Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

Bu prosedürün genel amacı, koloni oluşturan birimleri kaplamadan konakçı hücrelerle ilişkili olarak patojenik mayaların miktarını belirlemektir. İlk olarak, makrofaj hücrelerini H kapsülasyonu veya C albicans ile enfekte edin maya hücreleri, canlı maya hücrelerini vurgulamak için enfekte makrofaj hücrelerini aine portakalı ve propidyum iyodür ile boyarız. Daha sonra bir görüntüleme sitometresi kullanarak bir dizi görüntü yakalayın ve maya hücrelerini doğru bir şekilde numaralandırmak için boyut ve şekil parametrelerini analiz edin.

Görüntü sitometrisinden elde edilen sonuçlar, konakçı hücrelerle ilişkili olarak patojenik mayaları ölçmek için etkili bir şekilde kullanılabilir. Bu yöntem için ilk olarak, patojenik mantar Histoplasma kapsülünün nicelleştirilmesi için koloni oluşturan birimleri tekrar tekrar plakalamak ve saymak zorunda kaldığım mantar patogenezi alanında araştırma yaparken aklıma geldi. Görüntü sitometrisinin standart CFU sayım yöntemine göre ana avantajı, konakçı hücreler içindeki vahşi tip ve mutant suşların büyümesini karşılaştırırken, CFU'nun çoklu seri dilüsyonlarının işlenmesi, inkübe edilmesi ve sayılması gibi emek ve zaman yoğun kaplama, inkübasyon adımlarını ortadan kaldırdığı için artan hızıdır.

Bu yöntem, katı ortamlarda kaliteli büyümeyi başlatmak için farklı yeteneklerin neden olduğu potansiyel yanlılığı ortadan kaldırır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler görüntü sitometrisi ile karşı karşıya kalabilir. Enstrümantasyon ve yazılım.

Makrofajları istenen yoğunlukta kültürleyerek işleme başlayın. 24 oyuklu plakalarda, mantar hücrelerini log faz büyümesine ekleyin, daha sonra fagositoza izin vermek için 90 dakika inkübe edin. Daha sonra, düşük enfeksiyon çeşitliliğinde numune analizinden önce deneysel olarak tanımlanmış zaman noktaları için hücre dışı mantarları inkübe etmek için makrofajları PBS ile üç kez yıkayın, enfekte makrofaj hücreleri birkaç gün canlı kalır ve numuneler yaklaşık olarak her 12 ila 24 saatte bir analiz edilebilir.

PBS ile üç yıkamadan sonra, enfekte makrofaj hücrelerine 0.5 mililitre steril su ekleyin. Mantarları makrofaj hücrelerinden kurtarmak için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra lizatı steril bir tüpe toplayın ve buz üzerinde tutun.

20 mikrolitre lizatı ayrı bir tüpe aktarın. Anında görüntü sitometrik analizi için 20 mikrolitre aine turuncu propidyum iyodür çözeltisi ekleyin. Ortamdaki lizatların on kat seyreltilmesini gerçekleştirin.

Daha sonra her seyreltmeden 100 mikrolitreyi iki kopya halinde plakalayın. HMM aros plakalarında. Plakaları yedi ila sekiz gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.

Plakalardaki kolonileri manuel olarak sayın, minimum 100 ve maksimum 1000 farklı koloni görüntüleyin. Canlı makrofajları toplamak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra 0,5 mililitre PBS ekleyin ve dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Nazikçe pipetleme ile makrofajları doku kültürü kuyucuklarından çıkarın. Sıvıyı steril bir tüpe aktarın ve buz üzerinde saklayın. İvmeölçer cihazını kurmak için floresan optik modüllerini sisteme yerleştirin ve yerlerine kilitlendiklerinden emin olun.

Yazılımın tahlil açılır menüsünde görüntü sitometresini açın. Canlılık için önceden ayarlanmış tahlil tipini ve hücre tipini seçin. Test, candida albicans enfeksiyonunun tespiti için aine portakal ve propidyum iyodür tespiti için optimize edilmiştir.

Test, GFP tespiti için optimize edilmiştir. Şimdi seçenekler sekmesini açın ve arka plan resmi çek'e tıklayın İşlem tamamlandıktan sonra, A OPI canlılık ölçümü için parlak alan görüntüsünü önizlemeye tıklayın. 20 mikrolitre numuneyi 20 mikrolitre A OPI ile karıştırın ve candida albicans enfeksiyon oranı için muhasebe odasına pipetleyin.

Numuneyi iyice karıştırın ve doğrudan sayma odasına pipetleyin. Hücreler hazneye yerleştikten sonra, görüntü elde etmek için sayma haznesini görüntü sitometresine yerleştirin. Örneği odak noktasına getirin, ardından sayıma tıklayın.

Görüntü alma işlemi tamamlandığında, tek kullanımlık sayma haznesini çıkarın ve uygun şekilde atın. A OPI ölçümü için, konsantrasyon ve canlılık sonuçları, candida albicans enfeksiyon oranını belirlemek için sayım sonuçları sayfasında görüntülenir. Sayım sonuçlarını aldıktan sonra dışa aktar'a tıklayın.

Ardından, GFP'nin hücre popülasyonu analizi için verileri FCS express four'a gönderin. FCS express'te, veri dosyasını içe aktarın ve sonuçları bir floresan histogramında çizin. Ardından, candida albicans ile enfekte olmuş hücrelerin popülasyon yüzdelerini belirlemek için histograma bir hücre popülasyon kapısı uygulayın.

Bu deney, belirli zaman noktalarında hcaps Lotum mayası tarafından enfekte edilen makrofaj hücrelerinin büyümesini izler. Örnekler boyanır ve görüntü tabanlı sitometri ile analiz edilir. Bağcıklı makrofajlardan serbest kalan maya hücreleri, Soter görme yazılımı tarafından tanımlanır.

Burada, tespit edilen mutlak canlı maya sayısı, katı ortamda koloni oluşturabilen mayadan daha fazladır. Bu veriler, önemli sayıda canlı, ancak yetiştirilebilir olmayan hücrelerin varlığını vurgulamaktadır. Bu kemik iliği türevli makrofajlar, A DH bir promotörün kontrolü altında yeşil floresan proteini eksprese eden C albican maya hücreleri ile enfekte edildi.

0.1 ila 10 arasında değişen enfeksiyon çoklukları, enfekte makrofajlar içindeki GFP yoğunluğunda artımlı artışlara ve ayrıca bir kez kontrol altına alındığında enfekte makrofajların toplam yüzdesine neden oldu. Bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse numune başına sadece birkaç dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, parametreleri konakçı hücreler değil yalnızca mantar hücreleri sayılacak şekilde ayarlamayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, konakçı hücrelerle ilişkili olarak patojenik mayaları ölçmek için görüntü sitometrisinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Patojenik mantarlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle kişisel koruyucu ekipman giyin ve uygun biyolojik tehlikeli atık imha prosedürlerini izleyin.