Name: Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Keşfedin görüntü sitometrisi ile makrofaj hücrelerinde patojenik maya miktarını hızlı ve güvenilir şekilde ölçme yöntemini. Bu teknik, geleneksel koloni sayımına verimli bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. H. ile makrofajlar enfeksiyonu capsulatum, C. albicans <ol><li> Enfekte edilmeden önce, 16 saat, 24-yuvalı plakalar içinde istenilen yoğunlukta tohum makrofajlar. Bu protokol, iyi bir 3.0 x 10 5 hücre yoğunluğu / kullanıldı. </li><li> Bir enfeksiyon çokluğu istenen (İB) de log-fazı büyümesinde mantar hücreleri ekleyin. Bu protokol İçişleri Bakanlığı bir dizi (- 5.0 0.2) ağırlayacak. H. ile RAW264.7 makrofaj enfeksiyon için capsulatum, biz İçişleri Bakanlığı 0.2 kullanılır. </li><li> 1.5 saat fagositoz izin vermek için sonrasında, hücre-dışı Mantar çıkarmak için PBS ile makrofajlar üç kez yıkayın. </li><li> Numune analizinden önce, istenilen sayıda saat süreyle inkübe edin. (Bizim deneyde 0.2) İçişleri Bakanlığı düşük de, enfekte makrofaj hücreleri birkaç gün için geçerli kalır ve örnekleri yaklaşık her 12-24 saat analiz edilebilir. </li></ol> 2. Makrofaj Lizis <ol><li> Makrofaj hücrelerinden mantar kurtarmak için, ortamı çıkarmak PBS ile 3 kez yıkayın, ve0.5 ml steril su ekleyin. Bu koşullar altında, makrofajlar lize ve mantar hücreleri gibi kalır. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Buz üzerinde tutmak, steril tüpe lizat aktarın. </li><li> Ayrı bir tüpe 20 ul lizat aktarın, daha sonra 20 ul AO / PI solüsyonu ekleyin. &quot;Numune Hazırlama Resim Sitometrik Analizi&quot;: doğrudan 5. adıma geçin </li></ol> 3. CFU Kaplama <ol><li> Medya lizatları on-kat seyreltme (adım 2.3) yapın. </li><li> Her seyreltme plaka 100 ul, SMM-agaroz plakalar üzerinde, yinelenen. 7-8 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir odasında inkübe edin. </li><li> El 100 en az ve 1000 farklı koloniler en fazla gösteren plakalar üzerinde koloniler sayılır. </li></ol> 4. Canlı Makrofajlar içinde Mantarlar Görselleştirme <ol><li> Canlı makrofajlar toplamak için PBS ile hücreler 3 kez yıkayın. 4, 30 dakika boyunca 0.5 ml PBS ile inkübe ekleme ° C</li><li> Doku kültürü kuyulardan makrofajlar kaldırmak için, hafifçe birkaç kez aşağı yukarı pipet ve. Buz üzerinde tutmak, steril tüpe sıvı aktarın. </li><li> Ayrı bir tüp 20 ul örnek aktarın, sonra 20 ul AO / PI çözüm ekleyin. &quot;Görüntü Sitometrik Analizi için Numune Hazırlama&quot;: doğrudan 5. adıma geçin. </li></ol> 5. Görüntü Sitometrik Analizi için Numune Hazırlama <ol><li> İyice hedef örneğin pipet ve daha sonra tek hücre sayım odası içine örnek 20 ul aktarın. </li><li> Hücreler 30 sn için odasına yerleşmek için izin verin. </li><li> Görüntü sitometresinin içine odası sayma yerleştirin. </li></ol> 6. Cellometer Cihaz Kurulumu <ol><li> Sisteme VB-535-402 ve VB-660-502 ve yerine oturduğundan emin olun: Floresan Optik Modülleri yerleştirin. <ol><li> VB-535-402 kişide (475 nm uyarma, 535 nm emisyon) akridin turuncu ve GFP tespiti için kullanılır. </li><li> VB-660-502 (excitatiüzerine, 540 nm dalga boyunda, 660 nm emisyon), propidyum iyodür tespiti için kullanılır. </li></ol></li><li> Görüntü sitometresinin açın ve beraberindeki yazılımını açın. </li></ol> 7. Cellometer Yazılım Kurulumu <ol><li> Önceden &quot;Test Tipi&quot; ve Testi Açılır Menü içinde &quot;Hücre Tipi&quot; seçeneğini seçin. <ol><li> Canlılığı için, tahlil akridin turuncu ve propidium iyodür algılama için optimize edilmiştir. </li><li> Candida albicans enfeksiyonun tespit edilmesi için, tahlil GFP tespiti için optimize edilmiştir. </li></ol></li><li> Üst &quot;Seçenekler&quot; i seçin ve &quot;alın, Background Image&quot; tıklayın ve işlemi tamamlamak için izin verir. </li><li> &quot;Önizleme Parlak-Alan Resim&quot; tıklayın. </li></ol> 8. Resim Alma Prosedürü <ol><li> Görüntü sitometresinin içine hazırlanan örnek odası yerleştirin. </li><li> Odak düğmesini kullanın ve odağı ayarlayın. </li><li> Bir kez odak, &quot;Count&quot; tıklayın ve görüntü elde etme işlemi tamamlamak için izin verir. </li><li> Remotek sayma odası ettik ve uygun bertaraf edin. </li></ol> 9. Görüntü Veri Analizi <ol><li> Konsantrasyon ve canlılığı ölçüm <ol><li> Sayma tamamlandıktan sonra, hedef hücrelerin konsantrasyonuna ve canlılık sonuç sayfasında görüntülenir. </li><li> Candida albicans enfeksiyonu deneyde GFP hücre popülasyonu analizi için FCS Express 4 içine veri ihracat &quot;İhracat&quot; tıklayın. </li></ol></li><li> Candida albicans, infekte olmuş hücrelerin FCS Hızlı analizi <ol><li> FCS Express 4 ve arsa bir floresan histogram sonuçları içine &quot;. NXDAT&quot; dosyasını içe aktarın. </li><li> Candida albicans ile enfekte olmuş hücreler topluluğundaki yüzdesini tespit etmek için histogram hücre popülasyonu kapı uygulamak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Vet.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li>
<li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li>
<li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+yeast%3A+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li>
<li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li>
<li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis%2C+mitochondrial+potential%2C+and+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li>
<li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li>
<li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micro.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1%2C+a+conserved+transcriptional+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li>
<li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar Leo Li-Ying Chan ve Benjamin Paradis Nexcelom Biyobilim LLC çalışanlarıdır.

Resim sitometri kullanıcı yüksek kaliteli çekim ve, özel yazılım kullanarak, hücrelerin hızlı ölçümü yapmak için izin verir. Mikrobiyal patogenez alanında görüntü sitometrisi benimsenmesine bir potansiyel bir sorun sayılması için mikrop memeli konak hücreleri arasında hücre, karışık bir popülasyonu içinde mevcut olmasıdır. Burada, görüntü sitometri in vitro makrofaj enfeksiyon sırasında canlı patojenik maya ölçümü için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Bizim yöntem, in vitro makrofaj enf...

Kendi ana ve / veya ana hücreleri ile birlikte patojenik mantarların çalışmalar genellikle bir zaman boyunca veya farklı enfeksiyon koşullar altında canlı mantar hücreleri ölçümü gerektirir. Koloni oluşturan birim sayımı (CFU) uygun bir mantar hücre sayısı ölçülmüştür hangi standart bir yöntem olup, ancak bu teknik, çeşitli dezavantajları ve sınırlamaları vardır. İlk olarak, birçok mantar türleri yavaş büyüyen vardır. Katı ortam üzerinde görünür kolonilerin büyüme önemli ölçüde araştırma hızını yavaşlatan, 1-2 hafta sürebilir. Birkaç seyreltme kolonilerin sayılabilir miktarda sağlamak için kaplama gerekir çünkü ikinci, CFU kaplama sırasında örneklerin manipülasyon, zahmetli bir süreçtir. Kaplama verimi de% 100&#39;ün altında, çünkü Üçüncü olarak, CFU sayısını kaplama canlı organizmaların sayısı genellikle daha düşüktür. Örneğin, dimorfik fungal patojen Histoplasma capsulatum için kaplama verimliliği% 90 kadar yüksek olabilir, ama rutin olarak düşük olabilir% 30 ve ilgili mantar dimorph Paracoccidioides brasiliensis, 1, 2 (% 10) daha düşüktür. Candida albicans için kaplama verimi de değişkenlik 3 tabidir. Birçok durumda, bu ölü ve / veya metabolik olarak aktif olmayan hücrelerin varlığı ve konsantrasyonu belirlemek için yararlı olacaktır, oysa Son olarak, CFU analizi, katı ortam üzerinde büyüme oluflturabildikleri sadece canlı ve aktif olarak bölünen hücreler için hesaplar. Daha önce, çeşitli patojenik mantar türlerinin miktarının tayini için akış sitometrisi ile 4-6 yöntemler tarif edilmiştir. Ancak, paylaşılan akış sitometrelerinde biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) veya BSL3 düzeyinde patojenler ile ile ilgili biyogüvenlik muhafaza sorunları nedeniyle, bu tekniğin benimsenmesi sınırlı kalmıştır. Akım sitometri gibi, görüntü sitometri hücre miktarının bir hassas ve hızlı bir yöntemdir. Ancak, görüntü sitometri karşılaştırılabilir sonuçlar 7 ile maliyetinin bir kısmını yapılabilir -11. Burada, ev sahibi hücrelerle ilişkili olarak patojenik mantarların görüntü sitometrisi gerçekleştirmek için yöntemler tarif eder. Biz iki insan mantar patojenleri kullanarak yöntemleri göstermek: Histoplasma capsulatum ve Candida albicans H.. capsulatum solunum hastalığı neden olan bir dimorfik fungal patojendir, insanlarda, o kadar tomurcuklanan maya büyür ve makrofaj içinde çoğaltır Candida albicans bazen kandidiyazis neden olan bir insan ortakçı türdür.. Biz görüntü sitometri görselleştirme yeteneği ile birlikte, bu maya hızlı ölçümü sağlar olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI Çözümü</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CSK-0102</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Sayma Odası</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">< güçlü > EKİPMANLAR< / güçlü</td></tr> <tr><td>> Selometre Vizyonu</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Yazılımı</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ana hücreler ile derneği patojen mantarlar miktarının image for sitometrinin kullanın

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Bu Candida albicans, Histoplasma capsulatum ve Cryptococcus neoformans gibi patojenik maya hücresel patogenezi mekanizmaların Çalışmaları genellikle birim analiz veya akım sitometri oluşturan koloni kullanarak maya miktar takip memeli ana veya ana hücreler (yani makrofajlar) enfeksiyonu kullanır. Koloni oluşturan birim numaralandırma alanında en sık kullanılan yöntem olsa da, bu tekniğin büyüme karşılaştırırken özellikle endişe vericidir katı ortam ve düşük ve / veya değişken kaplama verimliliği, bazı mantar türlerinin yavaş büyüme de dahil olmak üzere, dezavantajları ve sınırlamaları vardır Yabani tip ve mutant. Flow sitometri maya canlılığı ile ilgili hızlı bir niceliksel bilgi sağlayabilir, ancak, patojenik maya için akım sitometrik algılama benimsenmesinin yüksek maliyet ve biyogüvenlik konuları da dahil olmak üzere pratik nedenlerle bir dizi için sınırlı kalmıştır. Burada, bir görüntü tabanlı göstermekmakrofajlar ile birlikte kültür canlı patojenik maya ölçümü için Cellometer Vizyon (Bioscience Nexcelom, LLC) kullanarak sitometrik yöntem. Histoplasma capsulatum ve Candida albicans H.:. Çalışmalarımız iki insan fungal patojenlerin tespit odaklanmak capsulatum makrofaj phagosome içinde çoğaltarak makrofaj kolonize ve burada, biz kantitatif H. büyüme değerlendirmek görüntü sitometrisi ile birlikte akridin turuncu / propidyum iyodür boyaması kullanılarak bir RAW 264.7 makrofajlarda capsulatum mayalar. Bizim yöntemi sadakatle birim numaralandırma oluşturan geleneksel koloni ile ölçülen özetlediği büyüme trendleri, ancak önemli ölçüde artmış duyarlılık ile. Ayrıca, doğrudan C. bir GFP-ifade suşu ile canlı makrofaj enfeksiyonu değerlendirmek albicans. Bizim metodoloji ilişki zekâ önemli insan fungal patojenlerin tespiti ve ölçümü için bir, hızlı, doğru ve ekonomik bir araç sunuyors konakçı hücreler sunar.

Biz H. büyüme izlemek için Cellometer Vizyon görüntü sitometresinin kullanılır makrofaj hücrelerinde capsulatum. RAW 264.7 hücreleri H. ile enfekte edildi Çeşitli zaman noktalarında capsulatum maya hücreleri ve, örnekler görüntü-bazlı sitometrik analizi ile AO / PI boyama tabi tutuldu. Buna paralel olarak, örnekler geleneksel CFU numaralandırma ile analiz edildi. Her zaman noktasında, örnekler makrofajlar eritmek için su içinde inkübe edildi ve serbest kalan maya hücreleri Cellometer ...

Burada, görüntü sitometrisi kültür ev sahibi hücrelerle ilişkili olarak patojenik mantarların ölçümü için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu teknik, CFU sayımı için bir alternatif olarak kullanılabilir.

Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Bu prosedürün genel amacı, koloni oluşturan birimlerin plaka yöntemiyle sayımını yapmadan, konak hücrelerle ilişkili patojenik mayaları nicelleştirmektir. İlk olarak, makrofaj hücrelerini H capsulation veya C albicans maya hücreleri ile enfekte edin; ardından canlı maya hücrelerini belirlemek için enfekte makrofaj hücrelerini acridine orange ve propidium iodide ile boyayın. Daha sonra bir görüntüleme sitometresi kullanarak bir dizi görüntü yakalayın ve maya hücrelerini doğru şekilde saymak için boyut ve şekil parametrelerini analiz edin.Görüntü sitometrisi sonuçları, konak hücrelerle ilişkili patojenik mayaların miktarını belirlemek için etkili bir şekilde kullanılabilir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez, patojenik fungus Histoplasma capsulatum'un miktarını belirlemek için tekrar tekrar ekim yapmam ve koloni oluşturan birimleri saymam gereken fungal patogenez alanı üzerine araştırmalar yaparken edindim. Görüntü sitometrisinin, standart CFU sayım yöntemine göre temel avantajı; konak hücreler içindeki yabanı tip ve mutant suşların büyümesini karşılaştırırken, CFU'ların çok sayıda seri dilüsyonlarının ekilmesi, inkübe edilmesi ve sayılması gibi emek ve zaman yoğun adımları ortadan kaldırarak hızı artırmasıdır.Bu yöntem, katı besiyerlerinde kaliteli büyütme başlatma konusundaki farklı yeteneklerin neden olabileceği potansiyel yanlılığı ortadan kaldırır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler görüntü sitometrisi, cihaz kullanımı ve yazılım konularında zorluk yaşayabilirler.Prosedüre, makrofajları istenen yoğunlukta kültüre ederek başlayın. 24 kuyucuklu plakalara logaritmik büyüme fazındaki fungal hücreleri ekleyin, ardından fagositoz için 90 dakika inkübe edin. Sonrasında, hücre dışı fungusları uzaklaştırmak için makrofajları PBS ile üç kez yıkayın ve örnek analizi öncesinde deneysel olarak belirlenmiş zaman noktalarında inkübe edin; düşük enfeksiyon çokluğu durumunda enfekte makrofaj hücreleri birkaç gün boyunca canlı kalır ve örnekler yaklaşık her 12 ila 24 saatte bir analiz edilebilir.PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, enfekte makrofaj hücrelerine 0,5 mililitre steril su ekleyin. Fungusların makrofaj hücrelerinden serbest kalması için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından lizatı steril bir tüpe toplayın ve buz üzerinde tutun.Lizattan 20 µL'yi ayrı bir tüpe aktarın. Anlık görüntü sitometrik analiz için 20 µL aine orange propidyum iyodür çözeltisi ekleyin. Lizatları besiyerinde on kat seyreltin.Ardından, her dilüsyonun 100 µL'sini HMM agar plaklarına çift örneklik olacak şekilde ekleyin. Plakları nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbon dioksit altında yedi ila sekiz gün boyunca inkübe edin.Plakalarda, minimum 100 ve maksimum 1000 adet belirgin koloni olacak şekilde kolonileri manuel olarak sayın. Canlı makrofajları toplamak için hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Ardından 0,5 milliliters PBS ekleyin ve dört degrees Celsius'ta 30 dakika boyunca inkübe edin.Makrofajları nazikçe pipetleyerek doku kültürü kuyucuklarından uzaklaştırın. Sıvıyı steril bir tüpe aktarın ve buz üzerinde saklayın. Akselerometre cihazını kurmak için floresan optik modüllerini sisteme yerleştirin ve yerine kilitlendiklerinden emin olun.Yazılımın analiz açılır menüsünden görüntü sitometresini açın. Canlılık için önceden ayarlanmış analiz türünü ve hücre türünü seçin. Analiz, Candida albicans enfeksiyonunun tespiti için akridin oranj ve propidyum iyodür deteksiyonuna göre optimize edilmiştir.Deney, GFP tespiti için optimize edilmiştir. Şimdi seçenekler sekmesini açın ve arka plan görüntüsü al seçeneğine tıklayın. İşlem tamamlandıktan sonra, A OPI canlılık ölçümü için aydınlık alan görüntüsünü önizle seçeneğine tıklayın. 20 µL örnek ile 20 µL A OPI'yi karıştırın ve Candida albicans enfeksiyon oranını belirlemek için sayım odasına pipetleyin.Numuneyi iyice karıştırın ve doğrudan sayım odasına pipetleyin. Hücreler odada çöktükten sonra, görüntüleme için sayım odasını görüntüleyici sitometreye yerleştirin. Numuneyi odaklayın, ardından say (count) düğmesine tıklayın.Görüntüleme işlemi tamamlandığında, tek kullanımlık sayım hücresini çıkarın ve uygun şekilde imha edin. A OPI ölçümü için, candida albicans enfeksiyon oranını belirlemek amacıyla konsantrasyon ve canlılık sonuçları sayım sonuçları sayfasında görüntülenir. Sayım sonuçlarını aldıktan sonra dışa aktar düğmesine tıklayın.Ardından, GFP'nin hücre popülasyon analizi için verileri FCS express 4'e gönderin. FCS express'te veri dosyasını içe aktarın ve sonuçları bir floresan histogramında çizin. Daha sonra, Candida albicans ile enfekte olmuş hücrelerin popülasyon yüzdelerini belirlemek için histograma bir hücre popülasyon kapısı (gate) uygulayın.Bu deney, hcaps Lotum mayası ile enfekte edilmiş makrofaj hücrelerinin büyümesini belirlenmiş zaman noktalarında izler. Örnekler boyanır ve görüntü tabanlı sitometri ile analiz edilir. Enfekte makrofajlardan salınan maya hücreleri, Soter vision yazılımı ile tanımlanır.Burada, tespit edilen canlı mayaların mutlak sayısı, katı besiyerinde koloni oluşturma kapasitesine sahip mayalardan daha fazladır. Bu veriler, canlı ancak kültüre edilemeyen hücrelerin önemli sayılarda mevcut olduğunu vurgulamaktadır. Bu kemik iliği kaynaklı makrofajlar, A DH one promotörü kontrolü altında yeşil floresan protein ifade eden C albican maya hücreleri ile enfekte edilmiştir.0,1 ile 10 arasında değişen enfeksiyon çoklukları, enfekte makrofajlardaki GFP yoğunluğunun yanı sıra enfekte makrofajların toplam yüzdesinde de kademeli artışlara yol açmıştır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde örnek başına sadece birkaç dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, parametrelerin sadece fungal hücrelerin sayılacağı, konak hücrelerin sayılmayacağı şekilde ayarlandığından emin olmak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, konak hücrelerle ilişkili patojenik mayaları nicelleştirmek için görüntü sitometrisinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Patojenik mantarlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle kişisel koruyucu ekipman kullanın ve uygun biyotehlike atık bertaraf prosedürlerini takip edin.

use-image-cytometry-for-quantification-pathogenic-fungi-association

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, insan lökositleri tarafından FITC etiketli patojenik mantar sporlarının fagositozunu ölçmek için bir yöntem göstermektedir. Fagositozlu sporlar, karşı boyama yoluyla hücreye bağlı sporlardan ayırt edilir, ardından akış sitometrik analizi yapılır.

Mantar Sporu Fagositozunun İnsan Fagositleri ile Kantitatif Akış Sitometrik Ölçümü

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Burada, canlı hücre bir video mikroskobu ile birlikte floresan Aspergillus raportör konidyalarını kullanarak gerçek zamanlı olarak birincil insan bağışıklık hücrelerinin antifungal aktivitesini değerlendirmek ve akım sitometri bir protokol açıklar. Oluşturulan veriler, fungisit aktivite, fagositoz, hücre göçü ve mantar büyüme inhibisyonu olarak ana bilgisayarın hücreye Aspergillus etkileşimleri ilişkin bilgi sağlar.

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Burada tarif biz miktar histolojik bölümlerde boyama Gomori'nın değiştirilmiş methanamine gümüş tarafından invazif aspergillosis ile farelerde akciğer mantar yükünü belirlemek için bir iletişim kuralı. Bu yöntemin kullanılması için mantar yükünün değerlendirmesi akciğer mantar DNA kantitatif PCR ile karşılaştırıldığında daha az hayvan ile karşılaştırılabilir sonuçlarında sonuçlandı.

Deneysel aspergilloz akciğer mantar yükünü belirlemek için histolojik miktar

Bu yazıda hala, floresan görüntüler ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskop görüntüleri kullanılarak incelenmiştir kripokal hücreler ve amipler bir ortak kültürü hazırlamak için bir protokol ayrıntıları. Burada gösterildiği gibi nicel veriler bu tür niteliksel bilgileri tamamlayabilir.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

Biz situ hibridizasyon floresan kullanan bir protokol tarif (FISH) lytically enfekte insan hücrelerinin içinde birden fazla herpesviral RNA görselleştirmek için, süspansiyon veya yapışık. Bu protokol, nükleositoplazmik oran üreten floresan ların niceliğini içerir ve konak ve viral proteinlerin immünoresans (IF) ile eşzamanlı olarak görüntülenmesi için uzatılabilir.

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Bu protokolün amacı Memeli gastrointestinal sistemde Candida albicans hücre şekli ve lokalizasyonu görselleştirmektir.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Bu protokol, aspergillus fumigatus conidia'nın fagositozunu akış sitometrisi kullanarak insan primer fagositler tarafından nicel olarak ölçmek ve konidianın fagositozunu sadece aparatlardan lökositlere ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Hayati floresan boyalar modern mantar hücre biyolojisinde canlı hücre görüntüleme analizleri için gerekli araçlardır. Bu yazıda, filamentöz mantarlarda plazma membran dinamiği, endo-/eksositoz ve hücre duvarı morfogenezinin izlenmesi için kurulmuş ve daha az bilinen floresan boyaların uygulanması ayrıntılı olarak anlatılır.

Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

Hücre sayımlarını tanımlamak için genelleştirilebilir alan tabanlı görüntü analizi yaklaşımını kullanan bir yöntem sunuyoruz. Farklı hücre popülasyonlarının analizi, uyarlanabilir bir algoritma içinde farklı hücre tipleri arasındaki önemli hücre yüksekliği ve yapı farklılıklarından yararlandı.

Makrofaj-fibroblast Kokültürlerinin Nicelleştirilmesi için Alan Tabanlı Görüntü Analiz Algoritması

Keşfedin görüntü sitometrisi ile makrofaj hücrelerinde patojenik maya miktarını hızlı ve güvenilir şekilde ölçme yöntemini. Bu teknik, geleneksel koloni sayımına verimli bir alternatif sunar.

Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

Daha fazla video keşfet