Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, primer miyofibroblastları fare veya insan kolon dokusundan izole etmektir. Bu, önce donör fareden kolonun toplanması ve buz gibi soğuk PBS ile durulanması ile gerçekleştirilir. Daha sonra, epitel hücreleri bir dizi yıkama ve enzimatik tedavi ile yok edilir.

Daha sonra epitel hücre süspansiyonu doku kültürü kapları üzerine kaplanır ve inkübe edilmesine izin verilir. Son olarak, miyofibroblastları izole etmek için yapışık olmayan hücreler yıkanır. Sonuçta, immünohistokimyasal boyama yoluyla primer miyofibroblast hücrelerinin izolasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir, Prosedürü göstermek, yay, laboratuvarımdan bir teknisyen paylaşacak.

Tüm deneyler, Kaliforniya Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Gözetim Ofisi tarafından, inhale flor ishale ile ötenazi yapılan bir fare ve ardından servikal çıkık kullanılarak onaylandı. Ventral orta hat insizyonu yaparak başlayın. Bağırsakları geri çekin ve kolonu bulun, mesaneyi yanal olarak geri çekin ve ince makas kullanarak kasık kemiğini tanımlayın.

Rektumu ortaya çıkarmak için kemiği kesin, dorsal mesentaryyi rektum ve kolondan ayırın ve kolonu anüsten çekuma hareketsiz hale getirin. Ardından, kolonu ince bağırsaktan ayırmak için onu kesin. Numuneyi buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin.

10 cc'lik bir şırıngayı buz gibi soğuk ile doldurduktan sonra, PBS içeriğini temizlemek için kolonun lümenini birkaç kez yıkayın. Daha sonra kolonu uzunlamasına kesmek için makas kullanın ve 20 mililitre buz gibi soğuk içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. PBS, sıvı partikül madde olmadan berraklaşana kadar PBS'yi değiştirmeye devam eder.

Ameliyattan önce hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam almak da dahil olmak üzere, cerrahi hastalardan insan dokusu elde etmek için bir protokol, İnsan Araştırmaları Koruma Programı'nın Kaliforniya Üniversitesi ofisi tarafından onaylandı. Standart prosedürler kullanılarak gerçekleştirilen bir kolon rezeksiyonundan yarım inç tam kalınlıkta bir kolon duvarı bölümü elde edin ve hemen buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin. Kolon, mesanter ve epi loik ekleri çıkarın.

Yağın varlığı sindirim sürecini etkileyeceğinden, tüm fare kolonunu HBSS'de 25 mililitre beş milimolar EDTA ile 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve 15 dakika boyunca 37 derece santigrat derece çalkalayan bir hava banyosunda inkübe edin. Solüsyonu dikkatlice dökün ve saatleri toplam beş kez tekrarlayın. İnsan dokusunu işlemek için.

Dört eşit büyüklükte parçaya kesmek için makas kullanın ve HBSS'de 25 mililitre beş milimolar EDTA içeren iki adet 50 mililitrelik tüpün her birine iki parça yerleştirin. Dokuyu beş kez yıkamak fare örnekleri için gösterilmiştir. Daha sonra, fareyi ve insan dokularını 20 mililitre buz gibi soğuk PBS'de iki kez kısaca yıkayın.

Daha sonra dokuları, 20 mililitre RPMI beş ve 10 birim disk macunu ve fare dokusu için 2000 birim kollajenaz veya insan dokusu için 20 birim dise ve 4.000 birim kollajenaz D içeren yeni 50 mililitrelik tüplere aktarın. Tüpü 37 derece santigrat derece çalkalama hava banyosuna dik olarak yerleştirin ve 250 RPM'de 60 dakikaya kadar veya doku lifli görünmeye başlayana kadar çalkalayın. Dokuyu parçalamak için tüpleri iki ila dört kez sallayın.

Daha sonra, miyofibroblastları izole etmek ve kültürlemek için numuneleri dört santigrat derecede 200 G'de beş dakika boyunca peletleyin. Süpernatanı sindirilmiş dokudan döktükten sonra, resus, her peleti 10 mililitre soğuk amonyum klorür potasyum veya bir CK lizis tamponu içinde askıya alın, ardından beş dakika boyunca dört santigrat derece ve 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, her bir peleti 10 mililitre RPMI beşte yeniden süspanse etmek için bir pipet kullanın.

10 mililitrelik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonlarının yarısını 70 mikrometrelik bir süzgeçten 100 milimetre TC ile muamele edilmiş kaplara geçirin. Her yemeğe beş mililitre daha 15 mililitre RPMI ekleyin. Kalan beş mililitrelik süspansiyonları ayrı TC ile muamele edilmiş kaplara süzün.

Numuneleri %10'luk bir karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin. Daha sonra, yapışmayan hücreleri çıkarmak için kültürleri HBSS ile iki kez yıkayın ve taze RPMI beş ekleyin. Yapışık hücreler epitel hücreleri, makrofajlar ve miyofibroblastlardan oluşur.

Tohumlamadan bir hafta sonra sadece miyofibroblastlar bölünürken makrofajlar ve epitel hücreleri sse olur. Geçişe ilk geçişten sonra, tripsin hücreleri onları görür ve ikiye böler. Bir kez izole edildikten sonra, birincil insan miyofibroblastları hücre kültüründe büyütülebilir ve dört geçişe kadar kullanılabilir.

Burada gösterildiği gibi. Hücreler alfa, düz kas aktin ve fermente pozitif ve desmin negatif olarak karakterize edilir. Bağırsak subepitelyal miyofibroblastları ile tutarlı olarak, aynı zamanda karakteristik bir yıldız morfolojisine sahiptirler.

Primer miyofibroblastlar, bir hücre hattında tanımlanan deneysel bulguları doğrulamak için kullanılabilir. Örneğin, 18 ko-hücrenin proinflamatuar sitokine maruz kalması. TNF alfa, EGF reseptör ekspresyonunda zamana bağlı bir artışa yol açtı.

Bu, gelişmiş EGF'nin neden olduğu COX iki ekspresyonu ve P 42 44 MA kinaz fosforilasyonu ile korelasyon gösterdi. Bu deneysel bulguları doğrulamak için. Deneyler, kolorektal kanserli hastaların cerrahi olarak rezeke edilen kolonlarından izole edilen primer insan miyofibroblastları kullanılarak tekrarlandı.

Bu rakamlar, birincil insan miyofibroblastlarının, başlangıçta 18 ko-hücre hattı hizasında tanımlanan deneysel bulguları yakından taklit ettiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, primer miyofibroblastların fare veya insan kolon dokusundan nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.