Name: Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Öğrenin fare ve insan kolon dokusundan primer miyofibroblast izolasyonunu. Bu yöntem, gastrointestinal sağlık ve hastalık araştırmalarında stromal hücre biyolojisini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma JY Sağlık Hibe 5KO8DK085136-02 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1.. Kolon Doku elde Fare Mantığını ve araştırma hedefleri detaylandıran, hayvan deneyleri gerçekleştirmek için bir protokol, teslim ve Hayvancılık Araştırma Gözetim bizim kurumsal Dairesi tarafından onaylandı. <ol><li> Servikal dislokasyon inhale izofluran ile fare Euthanize. </li><li> Ventral orta hat kesi yapmak, uzakta küçük bağırsak geri çekin ve kolon tanımlamak. Yanal mesane ve rahim (varsa) geri çekin ve kasık kemiği belirlemek ve rektum maruz ince makasla kesti. </li><li> Kolon kapalı rektum dorsal mezenter incelemek ve anüs çekum kolon harekete ve küçük bağırsak kolon kesmek için transect. </li><li> Buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) &#39;de örnek yerleştirin. </li><li> Buz gibi soğuk PBS ile bir 10 ml şırınga doldurun ve kolon ope kesilmiş, daha sonra içeriğini temizlemek için birkaç kez lümen kolon temizlemen boy-bilge makas kullanarak. </li><li> Buz soğukluğunda PBS ile 20 ml içeren, 50 ml konik bir tüp içinde kolon yerleştirin. Kolon, herhangi bir yönde yerleştirilmiş olmak zorunda değildir. Akışkan, partikül madde ile temizlenene kadar PBS değiştirerek kolon yıkayın. </li></ol> Insan Bu dokusunun yanısıra, potansiyel riskleri ve yararları bir değerlendirmesini elde önemini ayrıntılı, cerrahi hastalarında insan dokusu elde etmek bir protokol, teslim ve İnsan Araştırma Koruma Programı bizim kurumsal Dairesi tarafından onaylandı. <ol><li> Bir kolorektal cerrah ile araştırma işbirliği araştırma için insan doku elde edebilmek için gereklidir. Insan kolon dokusu elde etmek için bir protokol gönderilen ve kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış olması gerekir. </li><li> Yazılı izin önce cerrahi prosedür için hastadan elde edilir. </li><li> Cerrah standında bir kolon rezeksiyonu yapacakard moda. Kolon hastadan çıkarıldıktan sonra, numune, hemen patolojiye alınır. Patolojik değerlendirilmesi için gerekli değildir kolon duvarının tam kat bölümünde 0,5 sağlanır ve hemen buz soğukluğunda PBS yerleştirilir. Bu numune kolon mezenter içermemelidir ve yağ mevcudiyeti, sindirim süreci etkiler çünkü epiploik uzantılar, aynı zamanda kaldırılması gerekir. </li></ol> 2. Epitel Hücreleri soymak <ol><li> 50 ml konik bir tüp içinde HBSS içinde 5 mM EDTA (oda sıcaklığı) 25 ml tüm fare kolon inkübe edin. 15 dakika boyunca 37 ° C hava banyosu çalkalanarak (250 rpm) &#39;de konik tüp yerleştirin. 15 dakika sonra, dikkatli bir şekilde sıvı dökün ve 5 mM EDTA, 25 ml dolum tüpü, 5 yıkama toplam tekrarlayın. Insan kolon için, patolog gelen kolon duvarının ½ inç şeridi aldıktan sonra dört eşit büyüklükte parçalara makasla kolon kesti. Bir 50 ml konik bir tüp içine parçalarının iki yerleştirin veAyrı bir 50 mL konik tüp içine kolon dokusunun geri kalan iki adet yerleştirin. Daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi, HBSS içinde 5 mM EDTA, 25 ml ile inkübe edilir ve yıkama yapar. </li><li> Buz soğukluğunda 20 ml PBS içinde iki kez kolon durulayın. </li><li> RPMI-5 20 ml, dispaz 10 U ve kolajenaz D 2000 U (oda sıcaklığı) içeren yeni bir 50 ml konik bir tüp içinde, fare kolon doku yerleştirin. Insan kolon dokusunun için, dispaz ve kolajenaz iki katı (20 U dispaz, 4000 U kolajenaz D) kullanın. </li><li> (Yatay yerleştirilmiş ise, çok fazla havalandırma ve hücre hasarı var) dikey yönelimli bir 37 ° C sallayarak hava banyoda tüpü yerleştirin. Kadar 60 dakika boyunca 250 rpm&#39;de çalkalanır. Dispase ve kollajenaz D maruz kaldıktan sonra, kolon doku sindirimi başlayacak ve kolon doku lifli bakmaya başlayacaktır. Bu genellikle yaklaşık 30 dakika sürer. Bu kolon görünüme sahip olduğunda, enzimlerden kolon çıkarın. </li><li> Dokusu kırmak için yukarı ve aşağı 2-4 kez her tüpü çalkalayın. P5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj (4 ° C) de 200 xg&#39;de doku ellet. Dikkatlice süpernatant dökün ve atın. </li></ol> 3. Miyofibroblast İzolasyon ve Kültür <ol><li> 10 ml ACK lisiz tamponu (47 ° C) eklenerek her pelet tekrar. Tekrar santrifüj 5 dakika (4 ° C) için 200 xg, kapalı dökün ve süpernatant atın. </li><li> Bir pipet ile 10 ml RPMI-5 ekleyerek her pelet tekrar. </li><li> Bir 100 mm TC-muamele kabı içine 10 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak 70 mikron gözenekli süzgeç vasıtasıyla hücre süspansiyonu (5 mi) arasında yarı geçirir. Daha sonra RPMI-5 ek bir 15 ml. Farklı 100 mm TC-muamele kabına hücre süspansiyonu geri kalan 5 ml ile tekrarla. Bir fare kolon nedenle iki 100 mm TC-muamele yemekler verecektir. Insan kolon dokusunun ½ bir inçlik tabaka, dört adet 100-mm TC-muamele yemekler, toplam ürün olarak verecektir. </li><li> 37 ° C&#39;de% 10 CO2 inkübatör doku kültür kaplarına yerleştirin Kültür koşulları aynı fya da fare ve insan birincil hücreler. </li><li> 3 saat sonra, yavaşça HBSS iki değişiklik ile yıkanarak yapışmayan hücreler yıkayın. Enkaz kayan nazikçe yıkanmalıdır. Yapışık hücreler epitel hücreleri, makrofajlar ve miyofibroblastlar oluşmaktadır. Bir hafta sonrası tohumlama, sadece bölme miyofibroblastlar, makrofajlar ve epitel hücreleri ilk geçişinden sonra senesce. Taze RPMI-5&#39;i ilave edin ve hücre kültüründe hücreler büyür. </li><li> Hücreler, 5 dakika boyunca tripsinizasyon ile pasajlanır ve 2:1 bölünür. </li></ol> Kısaltmalar HBSS: Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi, RPMI-5: Roswell Park Memorial Institute medya; ACK: Amonyum Klorür-Potasyum; FCS: fetal buzağı serumu, TC-tedavi: doku kültürü tedavi Çözümler ACK lisiz tamponu - (4.15 g NH4CI, 0.5 g KHCO 3, 18.6 mg Na 2 EDTA, 400 ml 2 H, O, 1 N HCI ile 7.2-7.4 pH ayarlamak için). Filtre Sterilize bir 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden 4 ° C&#39;de RPMI-5 - (500 ml yapmak için: 454,5 ml RPMI, 25 mi FCS, 5 ml 200 mM L-glutamin, 5 ml 1 M HEPES, pH 7.4, 5 mi 100 mM sodyum piruvat, 5 ml 100x Pen-Strep, PBS içinde 500 ml 50 mM B-ME).

<ol><li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li>
<li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li>
<li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-%7Balpha%7D+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li>
<li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li>
<li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li>
<li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li>
<li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li>
<li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li>
<li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li>
<li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-%2F-+colonic+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li>
<li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li>
<li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li>
<li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898(2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Fare ya da insan kolon kullanarak zaman genel teknik benzer. Bu teknik aynı zamanda ince bağırsaktan miyofibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. 1 ila miyofibroblastlar izolasyonu için özel bilgiler. Fare ve 2. insan kolon aşağıda tartışılmaktadır. 1.. Fare Kolon Fare kolon sulama kolonun bir ucuna 16 G Popper küt uç iğne, bir 4 takılarak kolaylaştırılır. Uzunlamasına kolon kesim bu da yardımcı olur. Sen iğne üzerine kolon doku Akordeon, sonra keskin ucu yuka...

Gastrointestinal (Gİ) sistem fonksiyonunun düzenlenmesi mukoza tabakası ve onun altında yatan mezenşimin arasındaki karmaşık, dinamik etkileşimleri içerir. Bu etkileşimler, normal dengesini korumak için hizmet değil, aynı zamanda patolojik koşullar altında 1 hastalık durumlarının gelişmesine yol açabilir. Miyofibroblastlar mukozal rejenerasyon, onarım ve fibrozis 2 içeren kritik Gİ süreçlerin bir dizi düzenleyen hücre subpopülasyonunun ülkelerle birlikte bir parakrin iletişim epitel tabakası alttaki bulunan stromal hücrelerin bir alt vardır. İn situ miyofibroblastlar primer özelliklerinin çok paylaştığı için 18Co hücre hattı yaygın olarak miyofibroblast fonksiyonu çalışma için kullanılmıştır, insan kolon miyofibroblast hücre hattının bir örneğidir. Bunlar protein a-düz kas aktin ekspresyonu (α-SMA) ve vimentin yanı sıra, bir dizi ekspresyonunu içerirörneğin, epidermal büyüme faktörü reseptörü, ya da lizofosfatidik asit, 3,4 için reseptör olarak, hücre yüzeyi reseptörlerinin. Çünkü bu ortak ince yapı özellikleri, hem de biyolojik işlevi 5 benzerlikler, 18Co hücre hattı, enflamatuar barsak hastalığı veya kolorektal kanser 3,6 gibi birçok hastalık durumlarının bağlamında miyofibroblast fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, hücre satırını kullanarak doğal sınırlamalar ve endişeler vardır. Bu büyüme oranları ve diğer hücre popülasyonları ile etkileşimler de dahil olmak üzere hücrenin fenotipini ve biyolojik işlevi değiştirerek, primer hücrelerden hücre çizgileri ayıran zamanla genotipik instabilitedir. Hücre hatları, aynı zamanda kullanımı için önemli bir sınırlamadır GI mikro-(epitel, stromal ve vasküler bileşenlerinin), normal bileşenleri eksikliği. Bu nedenle, deneysel hücre çizgisi araştırmadan çıkan sonuçlar ri azaltmak için daha fazla doğrulama gerektirirmisinterpretation sk. Birincil miyofibroblastlar bir hücre hattı 7 belirlenen deneysel bulguları teyit etmek için, insan ve fare kolon dokusundan elde edilebilir. Yöntem ilk Mahida, et al. 8 tarafından tarif edilen, ve protokol, fare ve insan kolon 9 birincil miyofibroblastlar izole etmek için de kullanılabilir, çok iyi tarif edilen tekniklerden biridir. Bağırsak hastalığının herhangi bir fare modeli için, bu teknik, bunlar komşu hücreler ile etkileşime nasıl çalışma veya normal ya da patolojik GI 10,11 süreçleri iki katkı birincil miyofibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. Bu teknik miyofibroblastlar şifa, fibrozis, ve kolorektal adenom ve karsinom gelişimine mukozal nasıl katkıda incelemek için kullanılabilir. Birincil miyofibroblastlar da benign (iltihaplı bağırsak hastalığı, striktür, divertikülit) ya da kötü huylu c operasyon zamanında rezeke edilmiş insan kolon dokusundan elde edilebilirşartlarından. İnsan ve fare kolon dokusundan izole edilmiş primer hücrelerde hücre kültürü içinde büyütülmüş ve pasajların sınırlı sayıda üzerinde kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Reaktifin adı</td><td></td><td>Şirket Katalog numarası</td><td>Yorumlar (isteğe bağlı)</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Invitrogen/GIBCO</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche</td><td>#1 088 858</td><td></td></tr><tr><td>4 inç, 16 G Popper künt uçlu iğne</td><td>Fisher</td><td>#14-825-16K</td><td></td></tr></tbody></table>

fare ve İnsan kolon doku primer miyofibroblastlar İzolasyonu

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Miyofibroblast çok GI fonksiyonları kritik rolü için önemli bir önem kazanmaktadır mide-bağırsak (GI) sistemi içinde bir stromal hücresidir. Birkaç miyofibroblast hücre çizgileri bu hücrelerin in vitro çalışma için ticari olarak mevcut olmakla birlikte, deneysel hücre kültür koşullarına maruz bırakılan bir hücre hattından araştırma sonuçları işin aşırı indirgemeci doğası gereği doğal sınırlamaları vardır. Birincil miyofibroblastlann bir hücre çizgisinde tespit deneysel bulguları teyit açısından büyük bir avantaj sunmaktadır. Bir hayvan modelinde birincil miyofibroblastlar izolasyonu daha yakından hastalık durumu çalışılmaktadır taklit eden şartlar altında miyofibroblastlar çalışma sağlar. Hücreler altta yatan hastalığı olan hastalarda doğrudan gelir beri insan kolon dokusundan birincil miyofibroblastlar izolasyonu, tartışmasız en uygun deneysel verileri sağlar. Biz u olabilir köklü bir tekniği açıklarFare ve insan kolon dokusunun hem birincil miyofibroblastlar izole etmek tilized. Bu izole edilmiş hücreler, bağırsak epitel altı miyofibroblastlar tutarlı a-düz kas aktin ve vimentin pozitif ve desmin-negatif olmak karakterize edilmiştir. Birincil miyofibroblast hücreler hücre kültürü içinde büyütülmüş ve pasajların sınırlı sayıda fazla deneysel amaçlar için kullanılabilir.

Bir kez izole edilmiş, birincil insan miyofibroblastlar hücre kültürü içinde yetiştirilen ve (geçit 4 kadar) geçişlerinin sınırlı sayıda üzerinde kullanılabilir. Bu hücreler, bağırsak epitel altı miyofibroblastlar 5,7 ile tutarlı a-düz kas aktin ve vimentin pozitif olarak karakterize edilir ve desmin-negatif (Şekil 1A) vardır. Ayrıca, tipik bir yıldız şeklinde bir morfoloji (Şekil 1 B) vardır. Birincil miyofibroblastlar daha sonra bir hücre çizgisinde tespit deneysel bulgular...

Miyofibroblast normal ve hastalık her iki durumda önemli fizyolojik işlemleri düzenleyen gastrointestinal sistemin etkili bir stromal hücresidir. Biz, fare ve in vitro deney için kullanılabilir insan kolon dokusu, hem birincil miyofibroblastlar izolasyonu sağlayan bir tekniği açıklar.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Bu prosedürün genel amacı, fare veya insan kolon dokusundan primer miyofibroblastları izole etmektir. Bu işlem, öncelikle donör fareden kolonun hasat edilmesi ve buz gibi soğuk PBS ile durulanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bir dizi yıkama ve enzimatik işlem aracılığıyla epitelyal hücreler uzaklaştırılır.Ardından, epitel hücre süspansiyonu doku kültürü kaplarına ekilir ve inkübasyona bırakılır. Son olarak, miyofibroblastları izole etmek için yapışmayan hücreler yıkanarak uzaklaştırılır. Nihayetinde, immünohistokimyasal boyama yoluyla primer miyofibroblast hücrelerinin izolasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir; prosedrenin uygulaması laboratuvarımdan bir teknisyen tarafından paylaşılacaktır.Tüm deneyler, inhale izofloran ile ötanazi uygulanan ve ardından servikal dislokasyon yapılan bir fare kullanılarak University of California Hayvan Araştırmaları Gözetim Ofisi tarafından onaylanmıştır. Ventral midline insizyonu yaparak başlayın. Bağırsakları kenara çekip kolonu bulun, mesaneyi lateral olarak çekin ve ince makas kullanarak pubik kemiği belirleyin.Rektumu açığa çıkarmak için kemiği kesin, dorsal mezenteri rektum ve kolondan ayırın ve kolonu anüsten sekuma kadar sabitleyin.

isolation-of-primary-myofibroblasts-from-mouse-and-human-colon-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Miyofibroblast fenotipine sahip murin ve insan özofagus stromal hücrelerinin primer kültürlerini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Kültürlenmiş hücreler iğ şeklinde morfolojiye sahiptir, α-SMA ve vimentin eksprese eder ve epitelyal, hematopoietik ve endotel hücre yüzey belirteçlerinden yoksundur. Karakterize edilmiş stromal hücreler, epitelyal-stromal etkileşimlerin fonksiyonel çalışmalarında kullanılabilir.

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Cerrahi kolon tümöründen ve normal dokulardan birincil insan hücrelerini çıkarmak için bir protokol tanımlanmıştır. İzole edilen hücreler daha sonra hücre dışı bir matris proteini tarafından işlevselleştirilen yumuşak elastik substratlar (poliakrilamid hidrojeller) üzerinde kültürlenir ve floresan mikro boncuklarla gömülür. Hücresel kasılma streslerini değerlendirmek için traksiyon sitometrisi yapılır.

Cerrahi Dokular İlköğretim İnsan Kolon Tümör Hücreleri İzolasyon ve Çekiş Sitometrinin Yumuşak Elastik Yüzeyler Doğrudan onları Kültürleme

Burada, uzamsal olarak farklı murin kolonik epitel yüzey hücrelerinin alttaki kript bazlı hücrelerden izolasyonu için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

Burada, MF fenotipine sahip donmuş mide, ince bağırsak ve kolon dokusu oluşum hücrelerinden primer fibroblast/miyofibroblast (MF) kültürlerinin izole edilmesi ve oluşturulması için bir protokol sunulmaktadır. Bu hücreler CD90, α-SMA ve vimentin eksprese eder. MF'ler, enzimatik aktivite ve sitokin üretimi dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel testler için kullanılabilir.

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu

Bu protokolün amacı kollajenaz kullanarak dokunun enzimatik sindirimi ile kolon lamina propria bulunan mononükleer hücreleri izole etmektir. Bu protokol, mononükleer hücrelerin verimli bir şekilde izolasyonuna olanak sağlar ve bu da sağlam immünhenototipleme için kullanılabilir tek bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanır.

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Bu protokolde, murine primer epitel kolon monolayerlerinin doğrudan bağırsak mahzenlerinden nasıl üretılacağını açıklıyoruz. Geçirgen filtreler üzerinde birleştirici monolayerler, çizik yarası iyileşmesi ve biyokimyasal çalışmalar için birikme monolayerleri ve immünofluoresans analizi için seyrek ve birleştirici monolayerler üretmek için deneysel yaklaşımlar sunuyoruz.

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

Burada, telositler de dahil olmak üzere murin bağırsak mezenkimini izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Bunlar, büyümeyi desteklemek ve orijinal dokudaki durumu daha iyi yansıtmak için fare veya insan kaynaklı organoidlerle birlikte kültür gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Murin bağırsak mezenkiminin izolasyonu yüksek telosit verimi ile sonuçlanır

Öğrenin fare ve insan kolon dokusundan primer miyofibroblast izolasyonunu. Bu yöntem, gastrointestinal sağlık ve hastalık araştırmalarında stromal hücre biyolojisini incelemek için kullanılır.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

Daha fazla video keşfet