Name: Bir atıl gaz püskürtüsünün kullanılması Uygulanan Hücrelerinin Permeabilization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Öğrenin, atıl gaz püskürtüsü kullanarak yapışkan memeli hücrelerin geçici permeabilizasyonu için bu yöntemi. Plazma membranını mekanik kuvvetle bozarak genetik materyal ve biyomoleküllerin hücre içine aktarımını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR), Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC): Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarını teşekkür etmek istiyorum.

1.. LabView Programının Geliştirilmesi <ol><li> Bir kütle akış kontrol cihazı (MKS M100B Mass-Flo Controller) kesin bir gaz akış oranı sağlamak için helyum gazı hattına bağlanmıştır. Bu birim, 0 ve 5 V LabView programındaki bir kontrol döngüsü herhangi bir zamanda gerekli voltaj tespit arasında değişen bir giriş gerilimi ile kontrol edilir. Bilgisayar ve arayüz arasındaki kütle akış kontrolörü bir veri toplama cihazı (NI USB-6009) tarafından gerçekleştirilen ve 12 V güç kaynağı kütle akış kontrol için güç sağlar. </li><li> İki pozisyonlama lineer slaytlar 6-plaka, her yön için bir hareketini kontrol etmek için kullanılır. Her derleme bir adım motor ile birleştiğinde bir MA15 serisi Velmex Unislide Meclisi oluşur ve her iki meclisleri Motor Kontrol Stepping tek Velmex VXM tarafından kontrol edilir. Kontrolör, her motorun manuel koşu için izin verir veya harici seri bir komut kabul, kombinasyonu spesifik hareket p izinatterns. Çeşitli desenler sadece istenilen meşale hızı hem de yol boyutları sağlamak için kullanıcı gerektiren, LabView programa programlanabilir. </li></ol> 2. Ekipman hazırlanması <ol><li> Helyum silindiri ve regülatörü hem açın. </li><li> Motor kontrol açın. </li><li> LabView programını açın ve tüm koşullarını doğrulayın. </li><li> Platform merkezli olduğundan emin olun. , Her kontrol motor aşamada bakmak ve her vagon aşama sonunda da yakın olmadığını doğrulamak için. Program merkezi arabaları ya da elle motor kontrol önündeki koşu denetimleri kullanarak ayarlayın ya. </li><li> Bu günün ilk çalışma ise, kurulum düzgün çalıştığından emin olmak için, hücreleri olmadan bir kez programı çalıştırmak için tavsiye edilir. </li></ol> 3. Kılcal gaz püskürtüsü Nozul Yükseklik hazırlanması <ol><li> Tutucudan kılcal çıkarın ve yükseklik kadranı sıfır. </li><li> 6-delikli plaka o yerleştirinn platformu. </li><li> Değiştirin ve kapak kayma edecek kadar kuyunun dibine gaz jet kılcal daha düşük. Tutucuya kılcal elde edin. </li><li> Yükseklik kadranının kullanılması, kılcal 3 mm yükseltmek. Kılcal bazında bu yüksekliğe işaretleyin. </li><li> Güvenli bir yüksekliğe kılcal kaldırın ve daha sonra 6-çukurlu plaka çıkarın. </li></ol> 4. Hücre Permeabilization Protokol <ol><li> Cam kapak üzerinde izdiham Kültür yapışkan hücre hattı, standart kültür teknikleri kullanılarak, 6-çukurlu bir plaka içerisinde kayar. HeLa hücreleri için, tohum 6-çukurlu, oyuk başına 2 x 10 5 hücre plakaları ve tedavi öncesi 48 saat için inkübe edilir. </li><li> İstenen vektörü içeren çözeltinin uygun hacmi hazırlayın. HrGFPII-1, 1 x PBS içinde 50 ng / ul &#39;lik bir konsantrasyon HeLa hücrelerinde güçlü bir floresan sinyali transfeksiyondan sonra 24 saat için, içerir. Dekstran çalışmaları için, 10 kDa, yeşil fluoresan dekstran 80 ug / ml önerilir. Bundan sonra, bu çözelti, adlandırılacaktırs &quot;vector çözüm&quot;. </li><li> Kuyudan hücre kültürü ortamını çıkarın ve 1x PBS ile üç kez çalkalayın. </li><li> Kuyuya aşama 4.2 &#39;de hazırlanan vektör çözeltisi 1.370 ul Pipet. Bu, yaklaşık 1.3 mm&#39;lik bir derinliğe sıvı ile sonuçlanmalıdır. </li><li> Platformun merkezinde vektör çözeltisi içeren kuyu yerleştirin. Sürgünün üzerinde 3 mm&#39;lik bir meme yüksekliğinin gösteren önceden işaretli seviyeye gaz püskürtme memesi indirin. </li><li> LabView programında helyum akış hızını ayarlamak ve kullanılacak istenilen hareket desen seçin. Zaman Permeabilization protokolü başlamak için hazır &quot;Çalıştır&quot; seçeneğini seçin. Kütle akış kontrol cihazı için gerekli akış oranını temin etmek üzere hazırlanıyor sırasında bir ilk gecikme süresi olacaktır. Uygun akış hızı ulaşıldığında, LabVIEW programı istenen permeabilization desen iyi hareket için kademeli motora aktive edecektir. Platformu durduktan sonra, yaklaşık 30 saniye bekleyin ve vektör çözüm kaldırmak.Not: Optimal permeabilizasyon kılcal çapına bağlı olarak, meme çıkışında 100-200 Pa bir dinamik basınç yakınında meydana gelir. </li><li> 1x PBS ile de üç kez yıkayın. </li><li> Taze kültür ortamı ile iyi doldurun. </li><li> Deneylerin istenilen sayıda 4.6 - 4.3 adımları tekrarlayın. Not: onlar üzerinde yürütülüyor gaz jetsız vektör çözümü ile dolu olan kuyuların oluşmaktadır kontrol örnekleri yer alıyor emin olun. Adımlara 4.5 ve 4.6 için devam yaklaşık olarak 1 dakika boyunca, kontrol çukurlarındaki çözelti bırakın. </li><li> Bir hrGFP transfeksiyon deneyi çalışan ise, transfekte edilmiş hücreler tarafından malzeme transkripsiyonu izin vermek için 24 saat boyunca inkübatör 6-çukurlu plaka döndürür. Bir dekstran permeabilizasyon deney çalışan takdirde, yaklaşık 15 dakika boyunca inkübatör 6-çukurlu plaka döndürür. </li></ol> 5. Hücre Görüntüleme <ol><li> İsterseniz, hemen önce görüntüleme, hücre ölümünü değerlendirmek için uygun ölü / canlı leke ile counterstain. </li><li> Approp ile Görüntü hücrelertransfeksiyon / permeabilizasyon etkinliğini araştırmak için yaklaşımlarına yön mikroskop. </li></ol>

<ol><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+humans--immunotherapy+of+patients+with+advanced+melanoma%2C+using+tumor-infiltrating+lymphocytes+modified+by+retroviral+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction.</a> The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immunity+to+viral+antigens+limits+E1-deleted+adenoviruses+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).</li>
<li>Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+method+for+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).</li>
<li>Rauth, S., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+DNA+Transferred+into+Mammalian-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells.</a> J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).</li>
<li>Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-mediated+gene+transfer+%28electroporation%29+into+mouse+Friend+and+human+K562+erythroleukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+analysis+techniques%22%5BJournal%5D)">Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells.</a> Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).</li>
<li>Fechheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+plasmid+DNA+by+scrape+loading+and+sonication+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).</li>
<li>Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhancement+of+liposome-mediated+cell+transfection+is+caused+by+cavitation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li>
<li>Hallow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+intracellular+loading+of+cells+with+molecules+by+controlled+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).</li>
<li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li>
<li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.

Inert gaz jet permeabilizasyon yapışık hücre transfeksiyonu için yararlı bir tekniktir. Bu, zararlı kimyasal maddeler ya da viral vektörler için olan ihtiyacı ortadan kaldırır mekanik kuvvetlerin kullanımı ile hücrelere biyomoleküllerin aktarma yeteneği sağlar. Teknik potansiyel araştırmacılara ve klinisyenlere hassas hücreleri transfect verimli ve nispeten basit bir yol verebilir. Nüfuziyet seçiciliği de araştırmacılar sadece çok uygulamalarda yararlı olabilir, tek bir koloni bazı hücreleri tedavi etmek için izin benze...

Biyotıbbın evrim ve hücre mekaniği anlayışı ile, hücre içine biyomoleküllerin teslim birçok araştırma alanları ve tıbbi tedaviler için hayati hale gelmiştir. Farklı teknikler plazma zarı ve hücre sitozolüne yabancı molekülleri tanıtmak için geliştirilmiştir. Viral, kimyasal ya da mekanik teknikler: Bunlar genellikle ya olarak sınıflandırılabilir. Viral teknikleri, viral vektörleri 1 kullanarak, RNA ve DNA gibi genetik malzemeyi transfekte olabilir. Viral teknikleri ancak bunlar immün ve enflamatuar reaksiyonlar 2 için potansiyel var, bazı hücre kuşaklarında yüksek verimliliğe sahip olma eğilimindedir. Genel kimyasal transfeksiyon yöntemleri, kalsiyum fosfat 3, 4 bakteriyel ekzotoksin ve lipofeksiyon 5 ile çökelmesini içerir. Bu teknikler etkili olduğu kanıtlanmıştır, ancak bazı sorunlar, hücre toksisitesi ve non-özgüllük olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, bu tür kalsiyum fosfata gibi tekniklere nadiren çökelme primer hücrelerde 6, en fazla% 70, ancak sadece belli hücre hatlarında transfeksiyon verimliliği sahip olduğu tespit edilmiştir. Artan araştırma çabaları, özellikle klinik kullanımı ve DNA işleyişi çalışma için çeşitli tedaviler tasarımı durumunda, primer hücrelerin içine koymak ediliyor gibi bu notun olduğunu. Mekanik uyarıcılara yoluyla hücre zarının zamansal bozulması hücre içine yabancı moleküllerin sokulması için bir alternatiftir. Teknikler şunlardır: molekül 7 mikroenjeksiyon, membran 8,9 bozmak için bir elektrik alanı kullanılarak elektroporasyon, sonoporation ile bağlı parçacıklar sürgünler &quot;gen tabancası&quot; ile gösterildiği gibi, hücre zarını, 10-12, partikül bombardımanı bozmak için ultrason dalgaları kullanarak hücrenin 13 içine genleri, ve son zamanlarda, memeli hücreleri geçici olarak 14,15 permeabilize gösterilmiştir akışkan kesme stresi uygulaması. Her ne kadar mekanikal yöntemleri yukarıda belirtilen sorunların bazılarını önlemek için, tipik olarak daha düşük verim ve son derece karmaşık ve uzman düzeneklerinin eşlik eder. Bir atmosferik basınçta ışıltılı tahliye meşale (APGD-t) yüzeyler işlevselleştirilmesiyle ve in vitro 16 yapışık hücreleri ayırmanın ilk hedefi ile McGill de geliştirilmiştir. Tesadüfen çok kullanılan canlı / ölü leke nasılsa bir geçirimli madde eklenmeden hücreleri tarafından alınan edildiğini keşfedildi. Ayrıca, bu sadece meşale yolu ile maç oldu kuyu kısıtlı alanlarda meydana gelmiş gibiydi. APGD-t permeabilization yetenekleri soruşturma devam etti ve kontrol çalışmaları, bu uyarımı olmadan plazma taşıyıcı atıl gaz püskürtüsü da permeabilize hücrelerin mümkün olduğu bulunmuştur. Bu plazma jeti tarafından oluşturulan reaktif türler geçici membran fonksiyonu bozulmuş ilk hipotezi çeliştiğini ve önerilen basit mekanik olduğunucal kuvvetler hücre geçirgenliği neden için yeterli idi. Buradan itibaren, çalışmalar denemek ve ölçmek ve Permeabilization inert gaz jetinin etkinliğin yanı sıra tranfeksiyon yetenekleri 16 bakmak karakterize bizim laboratuvarda devam etti. Bu çalışmalar sayesinde, mikro-plazma membranında gerçek biçimde yapmak olduğu bulunmuştur ve bu gözeneklerin yaklaşık 5 saniye 15 içinde yeniden mühürlemek için eğilimindedir. Bir piliç embriyo koriyoalantoik zara in vitro ve in vivo olarak tekniğin yarar göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>Vitality hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td><td>HeLa hücreleri üzerinde transfeksiyon deneyleri için yeşil floresan proteini</td></tr><tr><td>Dextran, AlexaFluor 488; 10.000 MW, Anyonik, Tamir Edilebilir Yaşam Teknolojileri</td><td>A.Ş.</td><td>Geçirgenlik deneyleri için</td> <td>D22910</td> dekstran</tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Canlılık/Sitotoksisite Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri A.Ş.</td><td>Memeli hücrelerinin karşı boyanması için</td> <td>L3224</td></tr><tr>Görüntüleme <td>sırasında slaytları monte etmek için</td><td>Prolong Gold Antifade Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td></tr><tr><td>Ultra Yüksek Saflıkta</td><td>Helium Praxair Canada Inc.</td><td>HE 5.0UH-T</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM / Yüksek Glikoz Ortamı - HeLa hücreleri için 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>DMEM ortamı için</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin, sıvı</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>DMEM ortamı için</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>Laboratuvarda üretilmiştir</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><güçlü>Tablo 1</güçlü>. Gerekli reaktiflerin listesi</td></tr><tr><td>6-Kuyulu Şeffaf TC ile İşlem Görmüş</td><td>Mikroplakalar Corning</td><td>3506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>#1 22 x 22 Lamel</td><td>Fisher</td><td>12-542B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam Kılcal</td><td>Damarlar Dünya Hassas Aletler</td><td></td><td>WPI Boyutlandırma Bilgileri</td></tr><tr><td>Kimlik (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Sipariş #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mass-Flo Kontrol Cihazı</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>Kütle akış kontrolörü, M100B Serisi, harici bir 12 V güç kaynağı gerektirir</td></tr><tr><td>USB-6009 DAQ Cihazı</td><td>Ulusal Aletler</td><td>779026-01&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Step motorlu ve kontrolörlü UniSlide Düzeneği</td><td>Velmex</td><td></td><td>Velmex tarafından sağlanan Vexta 1.8 derece kademeli motorlarla donatılmış ve bir VXM Step Motor Kontrol Cihazı tarafından kontrol edilen iki seri MA15 UniSlide Tertibatı</td></tr><tr><td>;</td><td></td><td></td><td><güçlü>Tablo 2.</güçlü> Gerekli ekipman listesi</td></tr></tbody></table>

bir atıl gaz püskürtüsünün kullanılması uygulanan hücrelerinin permeabilization

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

Çeşitli hücre transfeksiyon teknikleri var ve bu üç geniş kategoriye ayrılabilir: viral, kimyasal ve mekanik. Bu protokol, geçici olarak hücrelerin içine normal olarak geçirgen makromoleküllerin transferini kolaylaştırmak için bir inert gaz akımı kullanılarak yapışkan hücrelere nüfuz edilebilir kılınması için mekanik bir yöntemi tarif etmektedir. Bu teknik, mikro gözenek geçici oluşumu ile sonuçlanan, yapışkan hücrelerin plazma zarı üzerinde kesme kuvvetleri aktarmanın çalışır inanıyoruz. Bu gözenekler oluşturulur sonra, hücreler daha sonra, genetik madde ve diğer biyomoleküllerin geçirgendir. Kullanılan mekanik kuvvetlerin kendi alt-tabakaya kalıcı ya da zarar ayırma hücre riski yoktur. Teknik etkili olan atıl gaz dinamiği dar bir aralık, bu nedenle bulunmaktadır. Bir atıl gaz jet HeLa, HEK293 ve insan abdominal aort endotel hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre çizgileri yapışkan geçirimli de etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, p için uygunbunun gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda potansiyel olarak araştırma ve kullanılabilir gösteren in vivo olarak gösterdiği gibi, in vitro ve hem de yapışık hücre ermeabilization. Ayrıca, değerli bir araştırma aracı olarak kanıtlamak olabilir ki, uzaysal olarak kısıtlayıcı bir şekilde hücrelerin geçirgenleştiren avantajına sahiptir.

Bir 0.86 mm iç çap kapiller ile bir helyum gaz püskürtüsünün kullanılarak 10 kDa yeşil floresan dekstran ile HeLa hücre Permeabilization Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Hücreler hemen hücre ölümünü görselleştirmek için 2 ul / ml EthD-1 çözeltisi (LIVE / DEAD Canlılık / Sitotoksite Kit) ile geçirgenleştirmeden sonra zıt. Hemen counterstaining ardından, kapak fişleri monte edilmiş ve görüntülenmiştir. Bu şekil, bir kontrol numunesi ile karşılaştırıldığında, üç farklı çıkış basınçlarda helyum gaz püskürtüs...

Bu protokol, bir atıl gaz akımı kullanılarak yapışkan hücrelerin geçici nüfuziyet için bir yöntem tarif etmektedir. Bu teknik, plazma zarını bozan mekanik kuvvetlerin kullanılması ile yapışık memeli hücrelerine genetik malzeme ve biyomoleküllerin transferini kolaylaştırır.

Bir atıl gaz püskürtüsünün kullanılması Uygulanan Hücrelerinin Permeabilization

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

Bu prosedürün genel amacı, aderen hücreleri permeabilize etmektir. Bu işlem, öncelikle deneysel hücrelerin altı kuyucuklu plakalardaki lameller üzerinde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücreler 1X PBS ile durulanır ve hücreye aktarılacak biyomolekülü içeren çözelti ile kaplanır.Ardından, inert gaz jeti üzerinden geçirilir. Örnek hücrelere nüfuz eder. Son adım, istenirse hücrelerin fikse edilmesi ve boyanmasıdır.Nihayetinde, permeasyon verimliliğini ve hücre canlılığını göstermek için immünofloresan mikroskopi kullanılır. Bu tekniğin proliferasyon veya gen tabancaları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kurulumunun kolay olması ve adherent hücrelerin mekansal olarak kısıtlı permeasyonuna olanak tanımasıdır. Bir kültürde, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, kendi özel uygulamalarında verimli permeasyona izin verecek gaz akış hızı veya kapiler çap gibi belirli parametreleri mükemmelleştirmek zaman alabileceği için zorluk yaşayabilirler.Bu prosedürde kullanılan kütle akış kontrolörü harici bir 12 V güç kaynağı gerektirir ve hassas bir gaz akış hızı sağlamak için helyum gaz hattına bağlanır; kütle akış kontrolörü ile bilgisayar arasındaki arayüzleme bir veri toplama cihazı aracılığıyla gerçekleştirilir. Bu ünite, sıfır ile beş volt arasında değişen bir giriş voltajı ile kontrol edilir. LabVIEW programındaki bir kontrol döngüsü, herhangi bir anda gereken voltajı belirler.Altı kuyucuklu plakanın hareketini her bir yön için bir adet olmak üzere kontrol etmek amacıyla iki adet konumlandırma lineer kızağı kullanılır. Her bir düzenek, bir step motorla eşleştirilmiş MA 15 serisi Velm X uni kızak düzeneğinden oluşur ve her iki düzenek de tek bir VELM XVXM step motor kontrolörü tarafından kontrol edilir. Kontrolör, her bir motorun manuel olarak hareket ettirilmesine olanak tanır veya dışarıdan gelen bir dizi seri komutu kabul eder.Bu kombinasyon, spesifik hareket modellerine olanak tanır. LabVIEW programına, kullanıcının yalnızca istenen torç hızını ve yol boyutlarını girmesini gerektiren birkaç model programlanabilir. Helyum tüpünü ve regülatörü açıp motor kontrolörünü çalıştırarak ekipmanın hazırlığına başlayın.Lab view programını açın ve tüm koşulları doğrulayın. Ardından, kontrol için platformun merkezlendiğinden emin olun. Her bir motor aşamasına bakın ve her bir taşıyıcının aşama uçlarına yakın olmadığını doğrulayın, ardından programın taşıyıcıları merkezlemesini sağlayın.Eğer bu, günün ilk uygulamasıysa, kurulumun doğru çalıştığından emin olmak için programı hücreler olmadan bir kez çalıştırmanız önerilir. Gas Jett kapiler nozul yüksekliğini hazırlamak için kapileri tutucudan çıkarın ve yükseklik kadranını sıfırlayın. Altı kuyucuklu plakayı platforma yerleştirin.Gaz jeti kılcal tüpünü değiştirin ve lam üzerine değene kadar kuyucuğun tabanına indirin. Kılcal tüpü, yükseklik ayar düğmesini kullanarak tutucuya sabitleyin. Kılcal tüpü üç milimetre yukarı kaldırın ve bu yüksekliği kılcal tüpün tabanına işaretleyin.Son olarak, kılcal boruyu güvenli bir yüksekliğe kaldırın ve ardından altı kuyucuklu plakayı çıkarın. Bu protokol için kullanılan yapışkan hücre hattı, HeLa hücreleri için standart kültür teknikleri kullanılarak altı kuyucuklu bir plakadaki cam lameller üzerinde konfluense ulaşana kadar kültüre edilmelidir. Kuyucuk başına 2 × 10⁵ hücre içeren altı kuyucuklu plakaları hazırlayın ve işlemden önce 48 saat boyunca inkübe edin.Tedavi gününde, istenen vektörü içeren uygun hacimde bir çözelti hazırlayın. Dekstrin çalışmaları için, bundan böyle vektör çözeltisi olarak adlandırılacak olan bu çözeltide mililitre başına 80 mikrogram 10 kilodalton yeşil floresan dekstrin kullanılması önerilir.Bir kuyucuktaki hücre kültürü ortamını uzaklaştırın ve üç kez durulayın; ardından kuyucuğa bir XPBS pipeti ile 370 microliters vektör çözeltisi ekleyin. Bu işlem sonucunda yaklaşık 1.3 millimeters sıvı derinliği oluşmalıdır. Vektör çözeltisi içeren kuyucuğu platformun merkezine yerleştirin.Gaz jet nozulunu, lamın 3 mm üzerinde bir nozul yüksekliğini belirten önceden işaretlenmiş seviyeye indirin. LabVIEW programında helyum akış hızını ayarlayın ve kullanılacak istenen hareket modelini seçin. Çalıştır'ı seçin.Permeasyon protokolüne başlanmaya hazır olunduğunda, kütle akış kontrolcüsünün gerekli akış hızını sağlamaya hazırlandığı bir başlangıç gecikme süresi olacaktır. Bu protokolün başarısı için, hücre derinliğini ve hücre kopmalarını en aza indirmek amacıyla akış koşullarının optimize edilmesi önemlidir. Uygun akış hızına ulaşıldığında, LabVIEW programı kuyucuğu istenen permeasyon paterninde hareket ettirmek için step motorları etkinleştirecektir. Platform durduğunda, altı kuyucuklu plakayı platformdan çıkarın.Yaklaşık 30 saniye bekleyin ve ardından vektör çözeltisini uzaklaştırın. Kuyucuğu PBS ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, kuyucuğu taze kültür ortamı ile doldurun.Permeasyon protokolünü istenen sayıda deney için tekrarlayın. Gaz jetinin üzerinden geçirilmediği, sadece vektör çözeltisi ile doldurulan kuyucuklardan oluşan kontrol örneklerini dahil ettiğinizden emin olun. Çözeltiyi uzaklaştırmadan önce kontrol kuyucuklarında yaklaşık bir dakika bekletin.Hücrelerin PBS ile yıkanması ve kuyucukların taze kültür medyumu ile doldurulması. Altı kuyucuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin; dekstrin permeasyonu durumunda 15 dakika inkübe edin. Ardından, permeasyon etkinliğini incelemek için hücreleri uygun mikroskop ile görüntüleyin.Burada, 0,86 milimetre iç çaplı bir helyum gaz jeti kullanılarak HeLa hücrelerinin 10 kilodalton yeşil floresan dekstrin ile geçirgenleştirilme sonuçları gösterilmektedir. Kapiler paneller A, B ve C, helyum gaz jetinin üç farklı çıkış basıncında çalıştırılmasından elde edilen sonuçları göstermekte olup; panel D, dekstrin eklenen ancak helyum gaz jetine maruz bırakılmayan bir kontroldür. Hücre ölümü görselleştirmek için geçirgenleştirme işleminin hemen ardından hücreler karşıt boyama ile boyanmıştır. Bu görüntülerde dekstrin yeşil, ölü hücreler ise kırmızı floresan renginde görünmektedir.Panel A ve B'de, permeasyon iz genişliğinin ve verimliliğinin, hücre ölümünde yalnızca hafif bir artışla birlikte, daha yüksek dinamik basınçla arttığı gözlemlenmiştir. Bununla birlikte, panel C'de gözlemlendiği üzere, yüksek bir dinamik basınca ulaşıldığında, HeLa hücrelerinin lamellerden sıyrıldığı ve taramalı elektron mikroskobu çalışmalarıyla çok az periferik permeasyon gerçekleştiği görülmüştür. Hücre membranında mikroporlar gözlemlenmiştir.Bu örnekte, heela hücrelerinin permeasyonu, 0,86 milimetre iç çaplı bir kapiler ve 300 Pascal çıkış basıncına sahip bir helyum gaz jeti kullanılarak gerçekleştirilmiş ve 50.000 x büyütmede taramalı elektron mikroskobu görüntüleri elde edilmiştir. Panel A, pürüzsüz bir hücre yüzeyi sergileyen bir kontrol örneğini gösterirken, panel B, 84 nanometre çapında bir por sergileyen bir perme hücrenin yüzeyini göstermektedir. Tekniğe hakim olunduğunda, işlem düzgün bir şekilde yürütülürse 15 ila 30 dakika sürmelidir. Prosedürün ardından, hücre canlılığı gibi ek faktörleri değerlendirmek için boyamalar yapılabilir.

permeabilization-of-adhered-cells-using-an-inert-gas-jet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokol, eşzamanlı ve lokalize epitel hücreleri ve bakteri kültürü için bir mikroakışkan ortak kültür modeli açıklamaktadır. Bu model, varsayılan probiyotik bakteri suşlarının etkinliğini patogenezinde farklı çözünür moleküler sinyallerin rolünü araştıran gibi ekran için kullanılabilir.

Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

Bir bioprinter içine bir HP Deskjet 500 Yazıcı dönüştürmek için kullanılan yöntemlerin açıklaması. Yazıcı membran geçici gözenekler neden canlı hücreler, işleme kapasitesine sahiptir. Bu gözenekler baskılı hücrelerine flüoresan G-aktin dahil olmak üzere küçük moleküller, dahil etmek için kullanılabilir.

Standart Mürekkep Püskürtmeli Yazıcı Kullanımı Geçici Hücre Zarı Gözenekler oluşturma

Hücre ve parçacıkların eylemsizlik sıralamayı kümil potasyum başlatıcısı varlığında damla nesil birleştirerek, biz kHz fiyatlara tek bir damla hücre veya parçacıkların İstediğiniz bir numarayı kapsüllemek için bir yöntem tarif. Biz iki kez tek ve çift-parçacık damla sırasız encapsulation geçecek verimlilik göstermektedir.

Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Biz bir kaç nm çeşitli malzemelerin nano boyutlu parçacıkların birkaç 100 nm arasında değişen ince filmler yatırmak plazma gelişmiş kimyasal buhar biriktirme kullandık. Biz geçirgenliği kabuğun kalınlığı ile kontrol edilir oyuk nanoshells üretmek için daha sonra aşındırma Çekirdek malzeme. Biz küçük çözünen bu kaplamaların geçirgenliği karakterize ve bu engelleri birkaç gün içinde çekirdek malzemenin sürekli salım sağlayabilir göstermektedir.

Plazma Polimerize Hollow Parçacıkların Encapsulation ve Geçirgenlik Özellikleri

Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Hücre yapışkanlığı, biyomalzeme araştırmaları ve doku mühendisliğindeki birçok yaklaşımın anahtarıdır. Peptitler ile önemli polimer PTFE'nin yüzey modifikasyonu için ıslak kimya kullanılarak adım adım bir teknik sunulmaktadır.

Geliştirilmiş Hücre yapışma Politetrafloroetilen Islak Kimya ve Peptit İmmobilizasyonu

Tandem kabarcık üretimi için altın nokta çiftleri ve yakındaki tek hücreli modelleme için fibronektin kaplı adalar üretmek üzere bir mikroakışkan çip üretildi. Elde edilen akış alanı, parçacık görüntü hızı ile karakterize edildi ve hücre zarı porasyonu, zar deformasyonu ve hücre içi kalsiyum yanıtı dahil olmak üzere çeşitli biyoetkileri incelemek için kullanıldı.

Tek hücreli Seviyesinde Kavitasyon Kabarcık (ler) -Hücre Etkileşim ve Sonuç biyoetkiler incelenmesi için yüzey Desenlendirme ile mikroakışkan Sistemi

Bu rapor, biyolojik araştırmalar için mikroakışkan kanalları hücreler ve substratlarla doldurmak için düşük basınçlı vakum kullanan basit, uygulaması kolay bir tekniği açıklamaktadır.

Desenlendirme Proteinlerin ve Hücreleri Çok Yönlü Yöntemi

Geçerli bilayer kültür modelleri içinde vivo microenvironments taklit fonksiyonel vitro çalışmalar için izin vermez. Polietilen glikol ve çinko oksit şablon oluşturma yöntemi kullanarak, bu iletişim kuralını geliştirme, bir ultrathin biomimetic membran tunable sertlik, porozite ve yakından vivo içinde taklit eden biyokimyasal kompozisyonu ile açıklanır hücre dışı matrisler.

Kültür Ultrathin Porated elastik Hydrogels bir Biomimetic membran için çift olarak hücre

Yüksek çözünürlüklü bir ışık sıvazlama aracı kullanarak bakteri hücrelerini izole etmek için fotobozunur hidrojellerin kullanıldığı bildirilmektedir. Sürecin temel deneysel prosedürleri, sonuçları ve avantajları gözden geçirilmiştir. Yöntem, heterojen topluluklardan veya popülasyonlardan nadir veya benzersiz işlevler gösteren hedeflenen bakterilerin hızlı ve ucuz izolasyon edilmesini sağlar.

Bakteri Taraması, Seçimi ve İzolasyonu için Fotobozunur Hidrojel Arayüzleri

İğnesiz su jeti teknolojisi ile hücre enjeksiyonu yöntemini, hücresel canlılık, proliferasyon ve elastikiyet ölçümleri açısından doğum sonrası araştırmaların bir sekeli ile birlikte sunuyoruz.

Domuz Yağ Dokusundan Türemiş Stroma Hücrelerinin Su Jeti Teknolojisi ile Enjeksiyonu

Öğrenin, atıl gaz püskürtüsü kullanarak yapışkan memeli hücrelerin geçici permeabilizasyonu için bu yöntemi. Plazma membranını mekanik kuvvetle bozarak genetik materyal ve biyomoleküllerin hücre içine aktarımını sağlar.

Bir atıl gaz püskürtüsünün kullanılması Uygulanan Hücrelerinin Permeabilization

Daha fazla video keşfet