Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, iki aşamalı bir kollajenaz perfüzyon prosedürü kullanılarak insan hepatositlerini izole etmektir. Bu, önce bir karaciğer parçasındaki kan damarlarının irrigasyon kanülü ile kanüle edilmesiyle gerçekleştirilir. Bunu, karaciğer parçasının kollajenaz kullanılarak perfüzyonu ve sindirimi takip eder.

Üçüncü adım, ayrışmış karaciğer hücrelerini serbest bırakan parıldayan kapsülün çıkarılmasıdır. Son adım, hepatositleri izole eden düşük hızlı bir santrifüjlemedir. Sonuç olarak, hepatositler, faz kontrast mikroskobu veya immünosito kimyası kullanılarak albümin boyaması ile tanımlanabilir ve triam mavisi dışlama testi kullanılarak belirlenen hepatositlerin canlılığı ve verimi ile tanımlanabilir.

Kanülasyon ve sindirim adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Bunun nedeni, kanülasyonun biraz incelik gerektirmesi ve sindirimin tamamlanmasının tanımlanmasının zor olabilmesidir. Tekniğe yeni başlayan kişiler için, prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Natalie Lun olacaktır.

Bu gösteride, bir insandan alınan bir parça yerine bir parça lamba karaciğeri kullanacağız, Karaciğer parçasının perfüzyonu için ekipmanı aşağıdaki gibi ayarlayın, su banyosunu, çözeltiler karaciğere ulaştığında 37 santigrat derece olacak şekilde uygun bir sıcaklığa ayarlayın. Parça. 41 santigrat derece, bir, iki ve üçüncü çözeltiler için iyidir ve ceketli cam kondansatör çözeltisi için dört, kollajenaz aktivitesi kaybını azaltmak için 37 santigrat derecede olmalıdır. Bolluktan kısa bir süre önce gaz regülatörünü açın Bir patologdan oksijenasyon cihazı için, ideal olarak çoğunlukla veya tamamen sağlam bir parıldayan kapsüle ve yalnızca bir kesilmiş yüzey yerine sahip bir karaciğer parçası edinin.

Delikli bir filtre diski içeren Buchner hunisi üzerindeki bu karaciğer parçası, perfüzyon sistemi şimdi düşük akış hızına sahip bir çözelti kullanılarak birinci çözelti ile astarlanmalı, karaciğer parçasının kesilmiş yüzeyindeki daha büyük kan damarlarına zeytin uçlu kavisli sulama kanülü yerleştirilmelidir. Kan karaciğerden dışarı akarken, perfüzyonun iyi olduğu bölgelerde doku daha hafif hale gelir. Kullanılan kanül sayısı farklı büyüklükteki karaciğerler için değişir.

Genel olarak, 20 gramın altından 80 gramın üzerine kadar değişen karaciğerler için dört ila sekiz kanül kullanılmalıdır. Sıkı ve güvenli bir şekilde oturması için kanülün ölçüsünü seçin. Tamponun dokudan dışarı akması için daha küçük kan damarlarını açık bırakın.

Şimdi, peristaltik pompadaki akış hızını dakikada 110 ila 460 mililitre arasına yükseltin. Kullanılan akış hızı boyunca karaciğer parçasının daha açık bir renk olması iyi bir perfüzyondur. Daha büyük karaciğerler için kullanılan daha yüksek perfüzyon oranları ile karaciğerin boyutuna bağlıdır.

Genel olarak konuşursak, kanül başına dakikada ortalama 44 mililitre perfüzyon hızı, bir dizi farklı karaciğer ağırlığı için idealdir. Seçilen akış hızı, karaciğer parçasının hafif bir şekilde dolgunlaşmasına neden olmalıdır. Karaciğer parçasını perfüzyon sırasında tuzlu suya batırılmış bir parça gazlı bezle kaplayarak nemli tutun.

Dokuyu bir litre çözelti ile perfüze ettikten sonra, karaciğer parçasında kalan kanı temizlemek için bir tane. Perfüzyon sıvısını ikinci çözeltiye değiştirin ve 10 dakika perfüze edin. Ardından, perfüzyon sıvısını üçüncü çözeltiye geçirin ve yarım litre ile perfüze edin.

Şimdi perfüzyon sıvısını kollajenaz içeren dördüncü çözeltiye değiştirin. Bu perfüzyonu dokuz ila 12 dakika boyunca veya karaciğer yeterince sindirilene kadar devridaim şeklinde gerçekleştirin. Karaciğer dokusu, parıldayan kapsülün altında hafifçe dağılmış gibi görünmelidir.

Karaciğer ayrıca bir neşterin künt tarafı ile incelendiğinde yumuşamış hissedilmelidir. Karaciğer parçasının doğru süre boyunca sindirilmesi önemlidir, çünkü aşırı sindirim hepatositlerin düşük canlılığına yol açabilir ve sindirim altında hepatosit veriminin düşmesine neden olabilir. Peristaltik pompayı kapatarak ve karaciğer parçasından kanülü çıkararak başlayın.

Daha sonra dokuyu 100 ila 200 mililitre çözelti içeren kristalleştirici bir kaba yerleştirin. Beş. Parıldayan kapsülü dikkatlice çıkarın ve hücreleri nazikçe sallayın. İyi perfüze edilmemiş bölgeler varsa, içinde bulunan hücreleri serbest bırakmak için bu bölgeleri kesmek için bir neşter kullanılabilir.

İşlem sırasında gerektiği kadar daha fazla çözelti beş ekleyin ve sonuçta çözelti hacmini 500 mililitreye getirin. Şimdi hücre süspansiyonunu iki kez filtreleyin. İlk olarak, hücreleri 210 mikronluk bir naylon ağdan bir litrelik konik bir şişeye süzün.

Daha sonra hücreleri 70 mikronluk bir naylon ağdan bir litrelik konik bir şişeye süzün. İki eşit hacimde hücre süspansiyonunu 200 mililitrelik santrifüj tüplerine dökün. Daha sonra filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 72 Gs'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Snat'ı aspire edin ve hücre peletini yaklaşık 200 mililitre çözelti içinde nazikçe yeniden süspanse edin. Beş. Santrifüjleme ve resusus süspansiyonunu üç kez tekrarlayın, son santrifüjlemeden sonra, hücreleri mililitre başına iki ila 5 milyon hepatositlik bir nihai konsantrasyon için soğuk depolama çözeltisinde yeniden süspanse edin. Bir hemo sitometre kullanarak hücre sayısını doğru bir şekilde ölçmek için bir triam mavisi testi kullanılabilir.

Burada 648 izolasyondan elde edilen trian mavisi lekeli hepatositler gösterilmiştir. İzole edilmiş insan hepatositlerinin ortalama canlılığı 77 artı veya eksi %10 idi. Hepatositlerin ortalama verimi, immünofloresan yoluyla karaciğerin gramı başına 13 artı veya eksi 11 milyon hepatosit idi. Yeşil albümin için pozitif boyanan izole hepatositler, hepatosit saflığını belirlemek için 94 artı veya eksi% 1 saflığa sahipti.

İmmünofloresan boyama, çalışma başına beş kopya ile dört kez gerçekleştirildi. Faz kontrast mikroskobu, hepatositlerin büyük hücre boyutları ve poligonal şekilleri gibi morfolojik özelliklerini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, iki aşamalı bir kollajenaz perfüzyon prosedürü kullanarak insan hepatositlerini nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.