Tek Adacık Düzeyde Oksijen mikroçevresinin Nicel ve Geçici Kontrol

Bu prosedürün genel amacı, ön koşullandırma etkilerini araştırmak için mikro ölçekli pankreas adacıklarına dakika ölçekli aralıklı hipoksi uygulamaktır. Bu işlem, öncelikle ince bir gaz geçirgen membrana sahip çok modlu bir mikroakışkan cihaz üretilerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise bilgisayar kontrollü bir oksijen modülasyon sistemi oluşturmaktır.

Sıradaki gözletler cihaza dikkatlice yerleştirilir ve ardından sıvı ve oksijen mikroakışkan bağlantıları yapılır. Son adım, oksijen modülasyonu sırasında değişen gözlet parametrelerini görselleştirmek amacıyla mikroskobiyi multimodal mikroakışkanlarla koordine etmektir. Nihayetinde, hipoksi durumunda glikoz yanıtının belirgin şekilde bozulduğunu göstermek için gözlet aralıklı hipoksi tekniği kullanılır.

Hipoksiniyi zamansal modülasyonlar, gözeyletlerin daha az bozulma ile yanıt vermesi için eğitilebilirken; bu tekniğin çözünmüş oksijen veya hipoksik oda kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, karmaşık akışlardan kaynaklanan kayma gerilmesi olmadan, göz kapaklarına hızlı ve çok kısa zaman aralıklarıyla hassas oksijen konsantrasyonunun iletilebilmesidir.

Ayrıca flor ve mikroskopi ile gerçek zamanlı izlemeye olanak tanır. Bu yöntem, transplant bölgelerindeki hipoksik bozulmaların tanımlanması veya transplant sonuçlarını iyileştirmek için ön koşullandırma rejimleri gibi, allojenik transplantasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu yöntem, allojenik hipoksi hakkında içgörü sağlayabilir.

Bu yöntem ayrıca merkezi sinir sistemi, kalp dokuları, böbrek ve diğer transplant organlar gibi diğer doku ve sistemlere de uygulanabilir. Cihaz üretimi ve halka sapıyla ilgili birçok adımın zor öğrenilmesi ve tekniğin özgün disiplinler arası doğası nedeniyle, bu yöntemin video ile gösterimi kritik öneme sahiptir; ancak zamanla bu zorluklar aşılabilir veya aşina olunabilir. Mikroakışkan cihazın kapak katmanını üreterek başlayın.

Bunu gerçekleştirmek için, önceden karıştırılmış PDMS'i boş bir Petri kabına 1,5 milimetre yüksekliğe gelecek şekilde dökün ve 80 °C'de iki saat boyunca kürleyin. Ardından, dört inçlik bir silikon gofret üzerine iki adet 350 mikron kalınlığında SU 8 21 50 tabakası spin coating ile kaplayarak tek bir 700 mikronluk tabaka oluşturun ve profüzyon odası master'ı ile glukoz mikroakışkan tabakasını hazırlayın. Daha sonra, mikrokanal desenini SU 8 tabakasına aktarmak için glukoz mikroakışkan tabakası fotomaskesini kullanarak UV ışığına maruz bırakın.

Pozlanmamış alanı SU eight geliştirici ile durulayın. Ardından, önceden karıştırılmış DGA'nın PDMS'ini MA üzerine üç milimetre yüksekliğe kadar dökün ve 80 °C'de iki saat boyunca kürleyin. Kürleme işlemi tamamlandığında, glikoz mikroakışkan tabakasını şekillendirmek için kesin; giriş ve çıkış portlarını oluşturmak için iki milimetrelik bir punch, ana oda için ise sekiz milimetre çapında bir punch kullanın.

Ardından, temiz bir dört inçlik silikon gofre üzerine 100 mikron kalınlığında bir SU 8 2100 tabakası spin kaplama yaparak göz kapağı immobilizasyonu için mikro kuyu kalıbını hazırlayın ve ardından mikro kuyu desenini bu tabakaya aktarmak için UV litografi kullanın. Mikro kuyu kalıbı tamamlandığında, maruz kalmamış bölgeleri geliştirici ile durulayarak temizleyin. Her bir tabakayı oluşturmak için 900 RPM'de 30 saniye boyunca spin kaplama ve ardından 80 °C'de 10 dakika kürleme yaparak iki adet 100 mikronluk PDMS tabakası ekleyin.

İşlem tamamlandığında, giriş ve çıkış portlarına iki milimetre çapında delikler açın. Son olarak, önceki katmanda olduğu gibi SU 8 2100'ü 100 mikron kalınlığa ulaşana kadar çevirerek gaz mikroakışkan ana kalıbını oluşturun ve gaz mikroakışkan desenlerini UV litografi kullanarak tekrar aktarın. Pozlanmamış alanları geliştirici ile yıkayarak temizleyin.

Ardından, gaz mikroakışkan kalıbının üzerine 1.5 mm kalınlığında bir PDMS tabakası dökün ve 80 °C'de iki saat boyunca kürleyin. Daha sonra PDMS'i jiletle uygun şekilde kesin. Çoklu tabakaları birbirine yapıştırmak için, diğer tabakalardaki konumlarıyla hizalanacak şekilde örtü tabakasına iki mm çapında giriş ve çıkış portları açın.

Öncelikle, yüzeyleri şeffaf bantla temizleyip bir korona arkına maruz bırakarak hazırlayın ve ardından katmanları el ile şu sırayla hizalayın. İlk olarak, mikro kuyucuklar yukarı bakacak şekilde membranı alt gaz katmanına yapıştırın. Ardından glikoz mikroakışkan katmanını mikro kuyucuk membranının üzerine yapıştırın.

Son olarak, tüm düzeneği kapsayacak şekilde en üste giriş ve çıkış katmanını yapıştırın. Düzeneğin üzerine bir kilogramlık bir ağırlık ekleyerek ve 100 °C'de üç saat boyunca pişirerek sıkı bir bağ oluşmasına yardımcı olun. Ardından sızdırmazlık testi yapın.

Sulu katmana su yükleyip cihazı batırarak ve sızıntı olup olmadığını kontrol ederken şırınga ile gaz katmanından hava akışını sağlayarak cihazı test edin. Son olarak, sızıntı olmayan cihazları, sulu katman boyunca bir ila iki dakika boyunca %70 etanol geçirerek sterilize edin. Mikro dağıtıcıların kontrol kablolarını beraberinde verilen sürücü ünitelerine bağlayarak mikro dağıtıcıları kurun.

Ardından, sürücüleri dijital IO kartındaki LabVIEW kontrollerine karşılık gelen portlara bağlayın. Sonra, beş volt ve 20 volt DC güç kaynaklarını sürücü ünitelerindeki ilgili kontaklara bağlayın ve eşlik eden metin protokolünün ekinde açıklandığı şekilde gaz kontrolü için LabVIEW kodlarını çalıştırmak amacıyla dijital IO'yu bir dizüstü bilgisayara bağlayın. Daha sonra, mikro dağıtıcıların birini azota, diğerini ise sıkıştırılmış havaya bağlayın; her iki gaz da %5 karbon dioksit içermeli ve her iki gaz da 2 PSI değerine ayarlanmalıdır. Dağıtıcı çıkışlarını, mikroakışkan cihaza girmeden önce bir T-bağlantısı ile birleştirin.

Ardından, cihaza %0 ve %21 oksijen bağlayarak cihazı bir ters mikroskobun ısıtmalı tablasına monte edin. Daha sonra, çıkıştaki çözünmüş oksijeni gerçek zamanlı olarak ölçmek için cihazın sıvı çıkışına bir fiber optik oksijen sensörü yerleştirin. Son olarak cihazı bir peristaltik pompaya bağlayın ve cihazdan dakikada 250 microliters hızla su akışını başlatın.

Mikro dağıtıcıları %5 ve %21 oksijen arasında döngüye sokarak oksijen modülasyonunun geçici yanıtını karakterize edin. Peristaltik bir pompayı mikroakışkan cihaza bağlayın ve sıvıyı mikroakışkan cihaza girmeden önce ısıtmak için boruları 37 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştirin. Ayrıca, glukoz mikroakışkanlarının çıkış portunu, C 57 black six farelerini diseke etmeye ve izole edilen pankreas adacıklarını, JoVE'den erişilebilen aşağıdaki videolarda açıklandığı üzere kollajenaz sindirimi ve Fccal yoğunluk gradyanı ayrıştırmasıyla izole etmeye başlamak için bir fraksiyon toplayıcıya bağlayın.

%10 FBS, %1 mls penisilinle streptomisin ve 20 millimolar HEPES içeren RPMI 1640 besiyerinde, gözletleri petri kaplarında 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Tutarlı sonuçlar elde etmek için gözletleri iki gün içinde kullanın. Ardından, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi, biri 2 millimolar glukoz ve diğeri 14 millimolar glukoz içeren iki ayrı çözelti şeklinde taze Krebs ringer bikarbonat tamponu hazırlayın.

50 milliliter konik tüplerdeki çözeltileri 37 °C su banyosuna yerleştirerek ısıtın. Ardından, 2 millimolar glikoz içeren 2 millilitre Krebs tamponuna beş micromolar 4:02 AM ve DMSO ile 2.5 micromolar RH 1 23 ve %100 etanol ekleyerek izole edilmiş gözeyleri için boyayı hazırlayın. Sonrasında, gözeyleri 10 microliter pipet ile alın ve 37 °C'de 30 dakika boyunca boya içerisinde inkübe edin.

Boyama işlemi tamamlandıktan sonra, glukoz mikrokanal girişini kullanarak cihaza yaklaşık 20 okülüs yükleyin. Çıkıştan girişe doğru tampon çözelti pompalayarak okülüsleri hazneye yönlendirin. Ardından, fazla boyaları uzaklaştırmak için okülüsleri ve tampon çözeltiyi 10 dakika boyunca perfüze edin.

İlk olarak, normal bir nabız baz çizgisi oluşturmak için sistemden beş dakika boyunca iki millimolar Krebs ringer bikarbonat tamponu geçirin. Ardından, odağı 14 millimolar glikoz tamponu ile 15 dakika boyunca stimüle edin ve bunu iki millimolar glikoz tamponu ile 15 dakikalık bir yıkama ile takip edin. Bu işlem sırasında, diyeti 340 nanometre ve 380 nanometre ile uyararak iki emisyon için 510 nanometreyi kaydedin.

Ayrıca, boyayı 480 nanometrede uyararak RH 1 23'ün 530 emisyonunu kaydedin. Oksijen modülasyonu sırasında konvektif bozulmaları minimize etmek için stimülasyon ve yıkama basamaklarında tampon akışı uygulayın ve test sırasında diğer basamaklarda akışın durdurulduğundan emin olun. Bu videoda gösterilen mikroakışkan yaklaşımını kullanarak ek analizlerde kullanmak üzere, glukoz çıkışından bir dakikalık aralıklarla efllüens toplayın; bilgisayarlı mikro enjektörler yardımıyla ince PDMS membranından geçen oksijen yüzdesini hızla düzenlemek mümkündür.

Burada, bir dakika ile altı dakika arasında değişen bu modülasyona bir örnek verilmiştir. Ayrıca, %5 ile %21 arasında oksijen verilerek, iki ve 8,5 parts per million arasında oksijenin bir dakikanın altındaki kantitatif modülasyonlarını sağlamak da mümkündür. Mavi çizgi verilen oksijenin yüzdesini, yeşil ise parts per million cinsinden ortaya çıkan çözünmüş oksijeni göstermektedir. Bu döngü, eyelet'lerde intermittant hipoksi oluşturmak için uygulandığında, tedavi sonrası iyileşen oran gözlemlenerek, eyelet'lerin hipoksiye karşı ön koşullandırılmasının (preconditioning) düzensiz normoksik pulsla karşılaştırıldığında sağladığı faydalar görülebilir; hipoksinin ve intermittent hipoksinin etkileri, burada mavi ile gösterilen normoksik yanıtın aksine, kalsiyum transientlerinin overshoot ve osilasyon sönümlenmesinde gözlemlenebilir.

Kırmızı renk hipoksik yanıtı, yeşil çizgi ise koşullandırılmış hipoksik yanıtı temsil etmektedir. Burada kalsiyum, mitokondriyal potansiyel ve insülin ölçümleri gösterilmiştir. Bunlar, gerçek zamanlı floresan mikroskopi ve sistemden gelen mikroakışkan efllüans kullanılarak gerçekleştirilen çip dışı ELISA analizinin sonuçlarıdır; tüm bunlar birlikte, hipoksik geçiş altında glukoz insülin yanıtına dair multimodal bir görünüm oluşturmaya başlar.

Bu teknikten yeterinceye ulaşıldığında, düzgün bir şekilde uygulandığında süreç iki günde tamamlanabilir; bir gün cihazın imalatı ve göz kapağı hücrelerinin izolasyonu için, bir gün ise göz kapağı deneylerinin kendisi için ayrılır. Bu prosedürü uygularken, cihaz geliştirildikten sonra gaz aktörüyle eşleşme sağlayarak iletilen oksijen konsantrasyonunun doğrulanmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu teknik, fötal çıkış ve diğer doku mikro fizyolojisi alanındaki araştırmacıların; hipoksini ve geçici oksijen paternlerinin diyabet, kardiyovasküler ve nörolojik bozukluklar gibi hastalıkları nasıl etkileyebileceğini keşfetmelerine yol açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, çok modlu mikroakışkan cihazlar kullanarak oksijen modülasyonunun nasıl kontrol edileceği, mikro dokuların nasıl manipüle edileceği ve doku hipoksisine dair tekrarlanabilir ve anlamlı ölçümlerin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.