Name: Tek Adacık Düzeyde Oksijen mikroçevresinin Nicel ve Geçici Kontrol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan cihaz kullanarak pankreas adacıklarında oksijen mikroçevresini nicel ve zamansal olarak nasıl kontrol edeceğinizi. Bu yöntem, adacık patofizyolojisini anlamak ve hipoksik koşullardaki glikoz yanıtını incelemek için araştırmacılara kesin ve hızlı oksijen modülasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Sağlık Hibeler R01 DK091526 (JO), NSF 0.852.416 (DTE) Ulusal Enstitüleri, ve Chicago Diyabet Projesi tarafından desteklenmiştir.

1.. Fare Islets hazırlanması <ol><li> C57BL / 6 fareleri inceleyin ve kollajenaz sindirimi ve Ficoll yoğunluk gradyan ayırma ile izole adacıklar. (2,3 başvurulan JOVE makalelere bakın). </li><li> % 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve Petri tabaklarında 20 mM HEPES ihtiva eden RPMI-1640 ortam maddesi içinde inkübe adacıklar (37 ° C,% 5 CO2). Post-izolasyon, kültür deneylerinde kullanılmadan önce 24 saat boyunca adacıklarının. Tutarlı sonuçlar için 1-2 gün içinde adacıklar kullanın. </li></ol> 2. Mikroakışkan Platform Yapımı <ol><li> Her cihaz katman için şeffaflık PHOTOMASKS üzerinde mikro geometrileri oluşturmak: 1) giriş ve çıkış, perifüzyon odasına 2) Glikoz mikroakışkan katman (8 mm çap x 3 mm, 150 ul), mikro oyuk 3) 200 mikron membran (500 mikron çaplı, 100 derin um), ve 4) gaz mikroakışkan katmanları. </li><li> Giriş ve çıkış katmanı imal etmek için, gazı alınmış, önceden karıştırılmış PDMS dökmek2 saat boyunca 80 ° C&#39;de boş bir Petri çanağı ve tedavi de 1.5 mm&#39;lik bir yüksekliğe sahiptir. 2 mm çaplı giriş / çıkış portları Punch. </li><li> Glikoz mikroakışkan katmanı imal etmek, silikon gofret bir 4&#39;ten bir tek 700 mikron tabaka oluşturmak için SU8-2150, iki 350 mikron katmanları dönerler. <ol><li> 700 mikron boyunda ana üretim, geliştirme sonra SU8 üzerine Mikrokanallı deseni aktarmak için uygun photomask boyunca UV ışığı Açığa. </li><li> 3 mm bir yüksekliğe kadar bu ana üzerine gazı giderilmiş, önceden karıştırılmış PDMS dökün ve 2 saat boyunca 80 ° C&#39;de tedavi. Bu kesim, bir tıraş bıçağı ile şekil PDMS. </li><li> 2 mm çapında bir giriş / çıkış bağlantı noktaları ve 8 mm çapında bir bölmeyi yumruk. </li></ol></li><li> Mikro oyuk ile 200 mikron membran imal etmek, 100 um SU8-2100 dönerler. Bu 100 mikron boyunda master üzerine mikro kalıplarını aktarmak için aynı UV-litografi uygulayın. <ol><li> Spin 30 saniye boyunca 900 rpm hızda, bu ana üzerine, önceden karıştırılmış PDMS gazı alındı ​​ve 10 dakika boyunca 80 ° C&#39;de tedavi. Spimikro desen içeren bir 200 mikron PDMS membran ile sonuçlanan aynı koşullar kullanılarak, ilk üstüne na ikinci tabaka. </li><li> Bu zardan 2 mm çapında giriş / çıkış bağlantı noktaları Punch </li></ol></li><li> Gaz mikroakışkan katmanı imal etmek, 100 um SU8-2100 dönerler. Bu 100 mikron boyunda master üzerine gaz mikrosıvı kalıplarını aktarmak için aynı UV-litografi uygulayın. <ol><li> 1.5 mm&#39;lik bir yüksekliğe bu ana üzerine gazı giderilmiş, önceden karıştırılmış PDMS dökün ve 2 saat boyunca 80 ° C&#39;de tedavi. Bir jilet ile şekillendirmek için PDMS kesin. </li><li> Bu katman sayesinde 2 mm çapında giriş / çıkış bağlantı noktaları Punch </li></ol></li><li> , Çoklu katmanlar bağ, kapaklar ile temizleme korona yay maruz bırakılmasını ve daha sonra, aşağıdaki sırayla elle hizalama onları hazırlamak için. <ol><li> Mikrodelikler yukarı bakacak şekilde alt gaz tabakasına zar bağ. </li><li> Mikro membran üzerine glikoz mikroakışkan Bond. </li><li> Giriş ve çıkış katman o bağn bütün aksamını encapsulating çok üst. </li><li> Üst 1 kg ağırlık ekleme ve 3 saat boyunca 100 ° C&#39;de pişirme ile bağ güçlendirilmesi. </li></ol></li><li> Su altında tüm aygıtı daldırılması, sonra sulu tabaka içine su yükleyerek tamamlanmış aygıtı Kaçak-test edin. Daha sonra, boş bir şırınga ile gaz tabakası içinden hava akar. </li><li> Cihaz kullanılana kadar 4 ° C&#39;de muhafaza edildiği PBS tamponu ile yıkayın ve sulu tabaka boyunca% 70 etanol ile sızıntısız cihazları sterilize edin. </li></ol> 3. Microdispenser Kur <ol><li> Oksijen karıştırma ve teslimat kurulum oluşturmak için 2 microdispensers, 5 V ve 20 V DC güç kaynakları ve dijital I / O kartını alın. <ol><li> Dahil sürücü birimlerine microdispensers &#39;kumanda kablolarını bağlayın. </li><li> Labview kontrollere karşılık gelen limanlarında dijital I / O kartı için sürücüleri bağlayın. </li><li> Sürücü uni kişileri karşılık gelen 5 V ve 20 V güç kaynağı bağlayınts. </li><li> Gaz kontrolü (Ek) için Labview kodları çalıştırmak için bir dizüstü bilgisayar için dijital I / O bağlayın. </li></ol></li><li> Ise başka bir basınçlı hava için, her ikisi de 5 ile% CO2 nitrojene bir microdispenser bağlayın. 2 psi hem gazlar ayarlayın. Önce mikroakışkan cihazına giren bir T-kavşak dağıtıcılar &quot;çıkışları bağla. </li><li> Bir sızıntı test cihazı kullanılarak, (ekipman listesi ve temsili sonuçları görmek) bir fiber optik oksijen sensörü ile suda çözünmüş oksijen ölçüm yaparken, 5-21% oksijen arasındaki microdispensers bisiklet oksijen modülasyon geçici yanıt karakterize. </li></ol> 4. Mikroskopi at Kurma <ol><li> Ters mikroskop ısıtılmış sahneye cihazı monte. </li><li> Cihaza% 0 ve% 21 O 2 gazları bağlayın ve oksijen sensörü ile kalibre. </li><li> Bir fraksiyon toplayıcı için glikoz Mikroakiskan çıkış portunu. </li><li> Krebs Ringer bikarbonat hazırlayıntamponu (KRB): 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 4.7 mM KCI, 1.2 mM KH 2 PO 4, 1 mM CaCl2 · 2H 2 O, 1.2 mM MgSO 4 · 7H 2 O, 10 mM HEPES pH 7,35-7,40 , 2 mM bazal glükoz, ve% 5 FBS. </li><li> Konik tüp, 37 ° C su banyosu içinde, 50 ml banyo sırasıyla 2 mM ve 14 mM glükoz ihtiva eden iki tampon çözeltiler hazırlayın. </li><li> Boru halinde 250 ul / dk &#39;da tampon çekmek için bir peristaltik pompa bağlayın. Mikroakışkan cihaz girmeden önce bir 37 ° C ocak üzerinde boru akış. </li><li> Adacıklar leke için, sırasıyla, son boya 5 uM yoğunluklarda ve 2,5 uM ulaşmak için KRB, 2 ml% 100 etanol içinde DMSO ve Rh123 olarak Fura-02:00 ekleyin. </li><li> 10 ul bir pipet ile adacıklar almak ve 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe boyalar </li><li> Glikoz mikrokanal giriş yoluyla cihaz içine yaklaşık 20 adacıklar yerleştirin. Geri t içine çıkışından tampon priming ile odasına adacıklar Doğrudandiye girişine. </li><li> Fazla boya aşındırmak için 10 dakika tampon içinde adacıklar serpmek. </li></ol> 5. Eşzamanlı Oksijen ve Glikoz Uyarım Koşu <ol><li> 14 mM uyarım ardından 15 dakika KRB2 tarafından kurulan taban arasında 5 dakika ile bir şeker uyarım darbe teslim ardından KRB2 15 dakika boyunca yıkanır. </li><li> Rh123 için Fura-2 ve 534 emisyon Record 340/380 nm eksitasyon dalga boyu. </li><li> Her deneyde önce normal bir darbe (14 mM Normoksik) ölçümlerini yapmak. </li><li> Oksijen modülasyonu (hipoksi / aralıklı hipoksi) için, sadece konvektif rahatsızlıkları en aza indirmek için, uyarılma ve yıkama adımları ve diğer adımların hiçbir akış sırasında tampon akışı uygulanır. </li><li> ELISA insülin tayini için 1 dakika aralıklarla glukoz prizden atıklarının toplayın. </li></ol>

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343(2009).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649(2010).</li>
<li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
<li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice%3A+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Regu+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li>
<li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li>
<li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu adacık hipoksi tekniğin entegre çoklu yöntemler mevcut birkaç puan sorun giderme için burayı kaydetti. İlk izole adacıklar aşağılamak nedeniyle asiner hücrelerden sindirim enzimleri kültür çözülmeye devam ediyor. Doku adacığı izolasyonu sonra 1-2 gün için deneyler standartlaştırılması tutarlı sonuçlar elde etmek, böylece önemlidir. İkincisi, sulu akış laminer akışı ve difüzyon arasındaki sınırda konvektif boşluğunu önlemek için hipoksi ve aralıklı hipoksi sırasında durduruldu. Bu adacık önkoşullanmanın süresini sınır...

Dinamik hipoksi özellikle adacık nakli için, biyolojide önemli Dinamik Hipoksi çok biyolojik dokuda önemli bir fizyolojik hem de patofizyolojik bir parametredir. Oksijen değişim, örneğin, anjiyojenezin güçlü bir gelişim sinyaldir. Ayrıca, hipoksi mekansal ve zamansal desenler HIF1-alfa modüle ve pankreas kanseri gibi hastalıklarda rol oynar. Hipoksi aynı zamanda adacık nakli sonuçlarını etkileyen karıştırıcı bir faktör olduğunu. Son zamanlarda, hipoksi veya aralıklı hipoksi (İH) zamansal olarak salınımları &quot;önşartlama&quot; adacık 1 faydalar göstermiştir. Ancak, adacık fizyoloji statik ve geçici hem hipoksi etkisi de öncelikle nedeniyle islet en mikroçevreyi kontrol etmek için uygun araçlar eksikliği anlaşılan ya, incelenecek henüz. Islets iyi in vivo vaskülarize edilir Pankreas adacıkları olan 50-400<html> 56, beta-hücreleri ve glukoz homeostazı sorumlu olan alfa-hücreleri de dahil olmak üzere endokrin hücreleri, m küremsi agrega. Adacıklar ATP&#39;ye duyarlı potasyum (K ATP) kanal ve insülin granül eksositosizini tetikler kalsiyum girişine sonuçlar açılır ATP üretimi için kan alımı ve glikoliz kurşun uyarıcı glikoz maruz kalır. Oksijen, bu ağır metabolik süreci götürmek ve insülin salgısı belirgin glukoz geçişlerini ek olarak kan akımı ve oksijen kaynağı dinamikleri tarafından etkilenir önemlidir. Bunlar son derece her biri, pankreas perfüze edildiği gibidir Islets kolayca kılcal bir tekneden bir hücre uzunluğu içinde in vivo olarak bu glukoz, insülin yanıtı gerçekleştirin. Bununla birlikte, adacık içi bir kapiller yoğun ağ doku adacığı izolasyonu 2,3 sırasında kolajenaz ile çıkarılır. Sonuç olarak, oksijen ve besin hem malzemeleri nedeniyle difüzyon sınırlamaları 100 mikron çevresine kısıtlı. adacık mikroortam yeniden adım &quot;&gt; Güncel teknikler sınırlı başarı Yeniden islet yerli oksijen ve glikoz dinamikleri, fizyolojik ve patofizyolojik koşulları modelleme anahtar, ayrıntılı akışını gerektiren ve adacık fonksiyonlarının sürekli izlenmesi eksikliği standart hipoksik odaları ile elde etmek zordur. Ayrıca, Tip nakli tedavileri ben diyabet pankreas fizyolojik (% 5.6, 40 mmHg) kıyasla çok daha düşük pO 2 (&lt;% 2, 5-15 mmHg) olan hepatik portal sistem 4 hipoksi izole adacıklar maruz. Post-transplant, adacık greft Revaskülarize gereken iki hafta veya daha fazla sürebilir. Bu hipoksik maruz islet glikoz insülin bağlama mekanizmasını olumsuz etkileri gösterilmiştir. Uyarı-sekresyon bağlama faktörler, kalsiyum sinyalizasyon, mitokondriyal potansiyelleri, ve insülin kinetik arasında kolayca mikroflüidik kullanılarak izlenebilir olabilir. Bizim önceki microfluidic tekniği bu yeniden gösterdiEl-zamanlı tek adacık 5,6 civarında sulu mikro hassas modülasyonu ile izlenmesi. Ancak, adacık hipoksik bozulma ölçümü aynı anda uyarılması ve izleme teknikleri eksikliği stymied edilir. Bu nedenle, oksijen ve adacık izleme mikrofluidik kontrol birleştirerek adacık hipoksi çalışmaları artırabilir. Mikroakiskan sulu ve oksijen mikroortam yeniden ve modüle edebilir Doku ve kültürü hipoksi çalışmaları için standart teknik hipoksik odaları dayalı olmuştur. Genel olarak, hipoksik odaları dakika-ölçekli dinamik hipoksi ile bağdaşmayan ~ 10-30 dakika içinde dengeleme süreleri, tek oksijen konsantrasyonu sağlamak. İki yeni çalışmalar glikoz uyarılan insülin yanıtı 7,8 çelişkili sonuçlar, bütün fareler üzerinde aralıklı hipoksi poz için küçük özel odaları kullanılmaktadır. Bütün hayvan düzeyinde, solunuma oksijen doğrudan tran olmadığını Unutmayınnedeniyle solunum sistemi denetimleri, pO2 kılcal adacık planlanıyor. Dahası, bu çalışmalar, standart oksijen seviyeleri yoktur, ne de adacıklar doku düzeyinde gerçek-zamanlı önlemleri sağlıyoruz. Öte yandan, oksijen Mikroakiskan gaz kanalı ağlar aracılığıyla oksijenin bu sınırlamaları aşmak olabilir. Ayrıca, Mikroakiskan, oksijen modülasyonu esnasında standart hipoksik odaları ile feat şu anda mümkün değil canlı görüntüleme ile uyumludur. Bu yeni Mikroakiskan bir dizi hedef hücrelerin 9-14 üzerinden medya akışı mikrokanallardaki içine oksijen konsantrasyonlarını çözmek için polidimetilsiloksanın gaz geçirgenliğini kullanmak yaklaşır. Bu cihazlar aynı zamanda birden fazla ayrık oksijen konsantrasyonlarını, floresan bazlı oksijen sensörleri, ve on-chip bile kimyasal oksijen nesil entegre etmiş. Sıvı solvasyon tabanlı Mikroakiskan i gibi bir sabit zaman kararlı, sürekli geçişlerini bakımı vart koşulları akış duyarlıdır konvektif karıştırma bağlıdır. Buna karşılık, biz burada kullanmak teknik oksijen teslim difüzyon yolu azalan odaklanır. Gaz solvasyon makaslama akış doğrudan hücreler veya adacığı dokularla tohumlanmış bir zarından oksijen yayarak netleştirilmiştir. Bu solvasyonu kontrol etmek için gerekli ekstra mikroflüidik kaldırır ve kendisi insülin salınımını tetikleyebilir adacıklar, gereksiz kayma stresi önler. Bu platform reaktif oksijen türleri (ROS) göstermek için kullanılır olmuştur up-regülasyonu hücre kültürü 1,15 olarak hiperoksik ve hipoksik hem aşırı (2-97% O 2) de. Çünkü oksijen ve kesme akışının çıkarılması doğrudan teslimat, bizim difüzyon tabanlı platform adacık hipoksi çalışmaları için uygun mikroakışkan bir çözüm sağlar. Multimodal stimülasyon ve izleme Adacık MI çalışmak için adapte edilmiş zaman difüzyon merkezli ve arayüz da ek avantajlar getirircrophysiology. Bir difüzyon bariyeri olarak bir membran kullanılarak, sıvı hipoksik stimülasyondan bağımsız bir şekilde, sulu glukoz uyarılarının kontrol sağlayan, oksijen modülasyon izole edilebilir. Bu adacıklar mekansal pin puan teslimat sandviç gibi eşzamanlı stimülasyon oluşturur. Gaz geçici olarak bilgisayar mikropüskürtücü ile modüle edilir Dahası, biz 60 sn&#39;den daha azdır, geçici bir süre ile dijital olarak 21-0 &#39;den% oksijen konsantrasyonunu modüle edebilir. Mikroskop de oksijen ve glükoz mikro dinamik kontrol standart hipoksik odası kullanılarak mümkün ya da olağanüstü hantal değil, gerçek zamanlı bir protokolü multimodal izin verir. Bu cihazı kullanırken, kalsiyum sinyal (Fura-AM), mitokondriyal potansiyeller (Rhodamine 123) ve insülin kinetik (ELISA) hipoksi altında dinamik glikoz-insülin yanıtı tam bir resmini elde etmek için takip edilmiştir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>MicroChem</td><td>SU8-2150/SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Ocak Gözü</td><td>PMC Dataplate</td><td>722A</td><td></td></tr><tr><td>UV Kürleme Lambası</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>Dow Chemical</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Corona Değnek</td><td>ETP</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>Vakum Odası</td><td>Bel-Art</td><td>420220000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodağıtıcılar</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr><tr><td>5 V ve 20 V DC Güç</td><td>Radyo Kulübesi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>Ulusal Enstrüman</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>Termometre</td><td>Omega Mühendislik, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik Pompa</td><td>Gilson</td><td>Minipulse 2</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen Sensörü</td><td>Okyanus Optiği</td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>Fraksiyon Toplayıcı</td><td>Gilson</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>Fisher Scientific</td><td>Finnpipette II 100&mu; l</td><td></td></tr><tr><td>Ters Epifloresan Mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konik Tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 Floresan Boya</td><td>Moleküler Probları, Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 123 Floresan Boya</td><td>Moleküler Probları, Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kültür</td><td>Ortamı Sigma-Aldrich</td><td>RPMI-1640</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 Silikon Tüplerde</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 inç x 1/8 inç</td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-konektörler</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 inç ve 4 mm</td></tr><tr><td>Şırınga Konnektörleri</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>dişi Luer fişi 1/16 inç</td></tr><tr><td>Düz Konnektörler</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 inç</td></tr><tr><td>Dirsek Konektörü</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 inç</td></tr></tbody></table>

tek adacık düzeyde oksijen mikroçevresinin nicel ve geçici kontrol

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Tek bir teknik glikoz uyarıcı salgılama birleştirme faktörler aynı anda oksijen ve izlenmesi özellikle transplant ortamlarda, adacık hipoksi fizyopatolojik durumlarını modellemek için çok önemlidir. Standart hipoksik odası teknikler aynı anda hem uyarılmalara modüle ne glikoz uyarı-sekresyon bağlama faktörlerin gerçek zamanlı izleme sağlayamaz. Bu zorlukları gidermek için, bir difüzyon membranı aracılığı ile sulu ve gaz fazı modülasyon hem de entegre bir katmanlı mikroakışkan tekniği uygulandı. Bu floresan mikroskobu ile yukarıda belirtilen birleştirme faktörlerin izlenmesi sağlayan saydam polidimetilsiloksan (PDMS) cihazı içinde microscaled adacık etrafında bir uyarım sandviç oluşturur. Buna ek olarak, gaz giriş% 0-21 arasındaki oksijen kantitatif, alt dakika modülasyonu sağlayan microdispensers bir çifti tarafından kontrol edilir. Bu aralıklı hipoksi ada yeni bir fenomen araştırmak için uygulanırt önşartlandırma. Ayrıca, multimodal mikroskobu ile donanmış, bu hipoksik olaylar sırasında ayrıntılı kalsiyum ve K ATP kanal dinamiklerine bakmak başardık. Biz adacıklar okuyan yanı sıra birçok ex vivo dokular değerli bir araç olarak, mikroakışkan hipoksi, özellikle bu eş zamanlı çift faz tekniği öngörülüyor.

Bu adacık hipoksi tekniğe Central dakika ölçekli geçici ile aynı mikroakışkan odası içinde, sulu ve gaz fazı stimülasyon modüle etme yeteneğidir. Şekil 1 a) temsil eden bir sonucu olan doku adacığı bölmesi içinde ölçülen çift uyarılması ve b) hızlı bir modülasyon. Odacık içine fluoresein getirilmesi ile gösterilen sulu modülasyonu, karıştırma 3-4 dakika içinde bir denge elde edilir. Ayrıca, oksijen 2 dakika gibi kısa sürelerle ile oksijen bisiklet sağlayan, hızlı, geçici ile 5-21% istifa edilebilir. <st...

Mikroakışkan oksijen kontrol biyolojik deneyler için hipoksik odaları üzerinde sadece kolaylık ve hız daha fazla bahşeder. Bir zarından difüzyon yoluyla uygulanan, özellikle mikrofluidik oksijen mikro-düzeyde eşzamanlı sıvı ve gaz fazı modülasyon sağlayabilir. Bu teknik, adacık patofizyolojisi çalışmak için dinamik çok kritik parametre deneyler sağlar.

Tek Adacık Düzeyde Oksijen mikroçevresinin Nicel ve Geçici Kontrol

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Bu prosedürün genel amacı, ön koşullandırma etkilerini araştırmak için mikro ölçekli pankreas adacıklarına dakika ölçekli aralıklı hipoksi uygulamaktır. Bu işlem, öncelikle ince bir gaz geçirgen membrana sahip çok modlu bir mikroakışkan cihaz üretilerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise bilgisayar kontrollü bir oksijen modülasyon sistemi oluşturmaktır.Sıradaki gözletler cihaza dikkatlice yerleştirilir ve ardından sıvı ve oksijen mikroakışkan bağlantıları yapılır. Son adım, oksijen modülasyonu sırasında değişen gözlet parametrelerini görselleştirmek amacıyla mikroskobiyi multimodal mikroakışkanlarla koordine etmektir. Nihayetinde, hipoksi durumunda glikoz yanıtının belirgin şekilde bozulduğunu göstermek için gözlet aralıklı hipoksi tekniği kullanılır.Hipoksiniyi zamansal modülasyonlar, gözeyletlerin daha az bozulma ile yanıt vermesi için eğitilebilirken; bu tekniğin çözünmüş oksijen veya hipoksik oda kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, karmaşık akışlardan kaynaklanan kayma gerilmesi olmadan, göz kapaklarına hızlı ve çok kısa zaman aralıklarıyla hassas oksijen konsantrasyonunun iletilebilmesidir.Ayrıca flor ve mikroskopi ile gerçek zamanlı izlemeye olanak tanır. Bu

quantitative-temporal-control-oxygen-microenvironment-at-single-islet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Mikroakışkan bir adacık perifusion cihazı, çok sayıda adacık ve kalsiyum girişini ve mitokondriyal potansiyel değişiklikleri eş zamanlı olarak floresan görüntüleme dinamik insülin salgılanması değerlendirilmesi için geliştirilmiştir.

Mikroakışkan Perifusion Cihaz içindeki Multi-Parametrik Islet Perifusion Sistemi

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

Burada, pankreas adacık hücreleri gibi heterojen hücre popülasyonlarında kalsiyum dinamiğinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için bir protokol saklıyız. Floresan muhabirler adacık içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir, daha sonra hareketsiz hale getirilir ve görüntülenir ve floresan yoğunluğunun dinamiğinin hücre başına analizi yapılır.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Burada, bir damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisini kullanarak izole insan pankreatik izletden tek hücrelerin yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Bu protokol, insan dışı primat pankreas adacıklarında oksijen tüketiminin doğru ve tekrarlanabilir ölçümünü göstermektedir. Adacık yükleme teknikleri ve mikroplaka kaplama kültürlü küresel diğer türde solunum verimli ölçümü için bir çerçeve sağlar.

İnsan Dışı Primat Pankreatik Adacık Oksijen Tüketiminin Analizi

Bu protokolün amacı sürekli insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamikleri ve donör hücrelere karşı katkıda konak izlemektir. Bu bir NOD gözün ön odasına (ACE) insan adacıkları nakli ile gerçekleştirilir. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-fare alıcısı ve ardından tekrarlanan 2-foton görüntüleme.

Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal

Bu protokol, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörünün, bir cAMP fark detektörünün in situ (cADDis) ve bir mikroperifüzyon sisteminin adenoviral iletimini kullanarak hücre içi sinyal olaylarının senkron edinimi ve birlikte kaydı ve birincil insan psödoisletleri tarafından insülin ve glukagon salgılanması için bir yöntemi açıklar.

Floresan Biyosensör Dinamiğinin ve Hormon Salgı Profillerinin Senkron Değerlendirmesi için İnsan Psödoislet Sistemi

Burada, olası karışıklıkların azaltılması ile endokrin pankreas fonksiyonunu değerlendirmek için ek bir teknik olarak, sağlam bir pankreas ile fare damar sistemi yoluyla perfüzyon yoluyla glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu (GSIS) gerçekleştirme hakkında ayrıntılar sunuyoruz.

Sağlam Bir Pankreas ile Farelerin Damar Sisteminden Perfüzyon Yoluyla Glikozla Uyarılan İnsülin Sekresyonu

Bu protokol, çift katmanlı bir mikroakışkan çip üretmek ve hızlı oksijen salınımları altında mikrobiyal büyümeyi analiz etmek için bir yöntem sunar. Cihazın performansı, sıvı kanallarında oksijen algılama ve mikrobiyal yetiştirme yoluyla doğrulandı.

Mikroakışkan Çift Katmanlı Cihaz Kullanarak Mikrobiyal Tek Hücreli Büyüme Analizinde Hızlı Oksijen Salınımları Oluşturma

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Öğrenin, mikroakışkan cihaz kullanarak pankreas adacıklarında oksijen mikroçevresini nicel ve zamansal olarak nasıl kontrol edeceğinizi. Bu yöntem, adacık patofizyolojisini anlamak ve hipoksik koşullardaki glikoz yanıtını incelemek için araştırmacılara kesin ve hızlı oksijen modülasyonu sağlar.

Tek Adacık Düzeyde Oksijen mikroçevresinin Nicel ve Geçici Kontrol

Daha fazla video keşfet