Tek Adacık Düzeyde Oksijen mikroçevresinin Nicel ve Geçici Kontrol

Bu prosedürün genel amacı, ön koşullandırma etkilerini araştırmak için mikro ölçekli pankreas deliklerine dakika ölçekli aralıklı hipoksi uygulamaktır. Bu, ilk önce ince bir gaz geçirgen membrana sahip multimodal bir mikroakışkan cihazın üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bilgisayarlı bir oksijen modülasyon sistemi oluşturmaktır.

Sonraki halkalar cihaza dikkatlice yüklenir ve ardından sıvı ve oksijen mikroakışkanları bağlanır. Son adım, oksijen modülasyonu sırasında değişen kuşgözü parametrelerini görselleştirmek için mikroskobu multimodal mikroakışkanlarla koordine etmektir. Sonuç olarak, oyuk, aralıklı hipoksi tekniği, hipokside glukoz yanıtının açıkça bozulduğunu göstermek için kullanılır.

Hipoksi'nin zamansal modülasyonları, gözleri daha az bozulma ile yanıt verecek şekilde eğitebilir. Bu tekniğin çözünmüş oksijen veya hipoksik oda kullanma gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı bu kadar doğrudur. Oksijen konsantrasyonu, karmaşık akışlardan kaynaklanan stres olmadan göz kapaklarına hızlı, çok küçük zaman aralıklarında iletilebilir.

Ayrıca zemin ve mikroskopi ile gerçek zamanlı izlemeye izin verir. Bu usta, nakil bölgelerindeki hipoksik bozuklukların tanımlanması veya nakil sonuçlarını iyileştirmek için rejimlerin ön koşullandırılması gibi Alli nakli alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu yöntem Alli hipoksisi hakkında fikir verebilir.

Merkezi sinir sistemi, kalp dokuları, böbrek ve diğer nakli organları gibi diğer doku ve sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemin video gösterimi, cihaz imalatı ve kuşgözü sapının çoğu için kritik öneme sahiptir. Tekniğin yeni disiplinler arası doğası nedeniyle adımların öğrenilmesi zordur, ancak doğası gereği zorlu veya tanıdık Mikroakışkan cihazın kapak tabakasını imal ederek başlayın.

Bunu başarmak için, DGA'ların önceden karıştırılmış PDMS'sini 1,5 milimetre yüksekliğe kadar boş bir Petri kabına dökün ve iki saat boyunca 80 santigrat derecede sertleştirin. Daha sonra, dört inçlik bir silikon gofret üzerinde tek bir 700 mikron tabakası oluşturmak için iki adet 350 mikron kalınlığında SU 8 21 50 tabakasını döndürerek füzyon odası master ile glikoz mikroakışkan tabakasını imal edin. Ardından, mikrokanal desenini SU sekiz katmanına aktarmak için glikoz mikroakışkan katman fotoğraf maskesini kullanarak UV ışığına maruz bırakın.

Açıkta kalmayan alanı SU eight geliştirici ile durulayın. Daha sonra, DGA'ların önceden karıştırılmış PDMS'lerini üç milimetre yüksekliğe kadar MA'ya dökün ve iki saat boyunca 80 santigrat derecede sertleştirin. Sertleştikten sonra, giriş ve çıkış portlarını oluşturmak için iki milimetrelik bir zımba ve ana hazne için sekiz milimetre çapında bir zımba kullanmak için glikoz mikroakışkan tabakasını kesin ve kullanın.

Daha sonra, 100 mikron kalınlığında bir SU 8 2100 tabakasını temiz bir dört inçlik silikon gofret üzerine döndürerek kaplayarak göz kapağı immobilizasyonu için mikro kuyu master'ı üretin ve ardından mikro kuyu desenini bu katmana aktarmak için UV litografi kullanın. Microwell master tamamlandığında maruz kalmayan alanları geliştirici ile durulayın. 30 saniye boyunca 900 RPM'de sıkma kaplaması ile iki adet 100 mikron PDMS katmanı ekleyin ve ardından her katmanı üretmek için 80 santigrat derecede 10 dakika kürleyin.

Bitirdikten sonra, çıkış portlarına iki milimetre çapındaki girişi delin. Son olarak, önceki katmanda olduğu gibi SU 8 2100 ila 100 mikron kalınlığında döndürerek gaz mikroakışkan master'ı üretin ve gaz mikroakışkan modellerini UV litografi kullanarak tekrar aktarın. Açıkta kalmayan alanı geliştirici ile durulayın.

Daha sonra, 1.5 milimetre kalınlığında bir PDMS tabakası gaz mikroakışkan master'a dökün ve iki saat boyunca 80 santigrat derecede sertleştirin. Ardından PDMS'yi tıraş bıçağıyla şekillendirmek için kesin. Ardından, birden çok katmanı birbirine bağlamak için diğer katmanlarda bulundukları yerle aynı hizada olacak şekilde iki milimetre çapında giriş ve çıkış portunu kapak katmanına delin.

İlk olarak, yüzeyleri bantla temizleyerek, bir Corona yayına maruz bırakarak ve ardından katmanları aşağıdaki sırayla elle hizalayarak hazırlayın. İlk olarak, membranı mikro kuyular yukarı bakacak şekilde alt gaz tabakasına yapıştırın. Daha sonra glikoz mikroakışkan tabakasını mikro kuyu zarının üzerine yapıştırın.

Son olarak, giriş ve çıkış katmanını en üste yapıştırın ve tüm düzeneği kapsülleyin. Düzeneğin üzerine bir kilogramlık bir ağırlık ekleyerek ve üç saat boyunca 100 santigrat derecede pişirerek sıkı bir bağ oluşturmaya yardımcı olun. Sonra sızıntı.

Sızıntı ararken sulu tabakaya su yükleyerek, cihazı suya batırarak ve şırınga ile gaz tabakasından hava akıtarak cihazı test edin. Son olarak, sulu tabakadan bir ila iki dakika boyunca %70 etanol geçirerek sızdırmaz cihazları sterilize edin. Önce mikro dağıtıcı kontrol uçlarını birlikte verilen sürücü ünitelerine bağlayarak mikro dağıtıcıları kurun.

Ardından sürücüleri, laboratuvar görünümü kontrollerine karşılık gelen bağlantı noktalarında dijital IO kartına bağlayın. Ardından, beş volt ve 20 volt DC güç kaynağını sürücü ünitelerindeki ilgili kontaklarına bağlayın ve beraberindeki metin protokolünün ekinde açıklandığı gibi gaz kontrolü için laboratuvar view kodlarını yürütmek için dijital IO'yu bir dizüstü bilgisayara bağlayın. Ardından bir mikro dağıtıcıyı, her ikisi de %5 karbondioksit içeren nitrojene ve diğerini basınçlı havaya bağlayın ve her iki gazı da iki PS'ye ayarlayın. Mikroakışkan cihaza girmeden önce dağıtıcı çıkışlarını bir T bağlantısına bağlarım.

Daha sonra cihazı, cihaza bağlı %0 ve %21 oksijenli ters çevrilmiş bir mikroskobun ısıtılmış aşamasına monte edin. Ardından, çıkıştaki çözünmüş oksijeni gerçek zamanlı olarak ölçmek için cihazın sıvı çıkışına bir fiber optik oksijen sensörü yerleştirin. Ardından cihazı peristaltik bir pompaya bağlayın ve cihazdan dakikada 250 mikrolitre hızla su akıtmaya başlayın.

Mikro dağıtıcıları %beş ila %21 oksijen arasında döndürerek oksijen modülasyonunun geçici tepkisini karakterize edin. Mikroakışkan cihaza peristaltik bir pompa bağlayın ve sıvıyı mikroakışkan cihaza girmeden önce ısıtmak için boruyu 37 santigrat derecelik bir sıcak plakanın üzerine yerleştirin. Ayrıca, C 57 siyah altı fareyi incelemeye başlamak için glikoz mikroakışkanlarının çıkış portunu bir fraksiyon toplayıcıya bağlayın ve bir kez izole edildikten sonra JoVE'den temin edilebilen aşağıdaki videolarda açıklandığı gibi kollajenaz sindirimi ve F kkal yoğunluk gradyan ayrımı ile pankreas deliklerini izole edin.

Halkaları %10 FBS, %1 penisilin streptomisin ve Petri kaplarında 20 milimolar yığın içeren RPMI 1640 ortamında 24 ila 48 saat inkübe edin. Tutarlı sonuçlar elde etmek için halkaları iki gün içinde kullanın. Daha sonra, iki milimolar glikoz içeren bir çözelti ve 14 milimolar glikoz içeren bir çözelti ile ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi taze Krebs ringer bikarbonat tamponu hazırlayın.

Çözeltileri 50 mililitrelik konik tüplerde 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirerek ısıtın. Daha sonra, iki milimolar glikoz içeren iki mililitre Krebs tamponuna 4:02 ve DMSO'dan beş mikromolar ve 2.5 mikromolar RH 1, 23 ve% 100 etanol ekleyerek izole edilmiş delikler için lekeyi hazırlayın. Daha sonra, 10 mikrolitrelik bir pipetle halkaları alın ve 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca lekede inkübe edin.

Lekelendikten sonra, glikoz mikro kanal girişi aracılığıyla cihaza yaklaşık 20 delik yükleyin. Tamponu çıkıştan tekrar girişe doldurarak delikleri hazneye yönlendirin. Daha sonra halkaları perfüze edin ve fazla boyaları yıkamak için 10 dakika tamponlayın.

İlk olarak, normal bir nabız taban çizgisi oluşturmak için sistemden beş dakika boyunca iki milimolar Krebs zil bikarbonat tamponu çizin. Daha sonra hazneyi 14 milimolar glikoz tamponu ile 15 dakika boyunca uyarın, ardından iki milimolar glikoz tamponu ile 15 dakikalık bir yıkama yapın. Bu işlem sırasında, 340 nanometre ve 380 nanometre diyetini heyecanlandırarak iki emisyon için 510 nanometreyi kaydedin.

Ayrıca, boyayı 480 nanometrede uyararak RH 1 23'ün 530 emisyonunu kaydedin. Oksijen modülasyonu sırasında konvektif bozulmaları en aza indirmek için, stimülasyon ve yıkama adımları sırasında tampon akışı uygulayın ve test sırasında diğer adımlarda akışı durdurduğunuzdan emin olun. Ek analizde kullanılmak üzere glikoz çıkışından çıkan atık suyu bir dakikalık aralıklarla toplayın Bu videoda gösterilen mikroakışkan yaklaşımı kullanarak, bilgisayarlı mikro enjektörleri kullanarak ince PDMS membranından geçen oksijen yüzdesini hızlı bir şekilde düzenlemek mümkündür.

İşte bir dakika ile altı dakika arasında değişen bu modülasyonun bir örneği. %5 ila %21 arasında oksijen sağlayarak milyonda iki ila 8,5 parça arasında kantitatif dakika altı oksijen modülasyonları sağlamak da mümkündür Mavi çizgi, verilen oksijenin yüzdesini gösterir ve yeşil, milyonda parça olarak ortaya çıkan çözünmüş oksijendir. Bu döngü, deliklerde aralıklı hipoksi oluşturmak için uygulandığında, hipoksiye karşı ön koşullandırma halkalarının faydalarını, düzensiz normoksik nabız ile karşılaştırıldığında, hipoksi ve aralıklı hipoksinin tedavi sonrası iyileştirilmiş oranını gözlemleyerek, burada mavi ile gösterildiği gibi kalsiyum geçici akımlarının aşma ve salınım sönümlemesinde gözlemlenebilir.

Kırmızı hipoksik yanıttır ve yeşil çizgi koşullu hipoksik yanıttır. Kalsiyum, mitokondriyal potansiyel ve insülin ölçümü burada gösterilmektedir. Bunlar, gerçek zamanlı floresan mikroskobu ve sistemden gelen mikroakışkan atık suyu birlikte kullanan chipp EISA testinin sonuçlarıdır, bunlar hipoksik geçici altında glikoz insülin yanıtının multimodal bir görünümünü oluşturmaya başlar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa iki günde, bir gün cihazın üretimi ve göz kapağı hücrelerinin izole edilmesi için ve bir gün göz kapağı deneyleri için tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, geliştirildikten sonra cihazın gaz cihazı ile evlenerek verilen oksijen konsantrasyonunu doğrulamayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, fetal çıkış ve diğer doku mikro fizyolojisindeki araştırmacıların, hipoksi ve geçici oksijen modellerinin diyabet, kardiyovasküler ve nörolojik bozukluklar gibi hastalıkları nasıl etkileyebileceğini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, oksijen modülasyonunu nasıl kontrol edeceğinizi, mikro dokuları nasıl manipüle edeceğinizi ve multimodal mikroakışkan cihazlar kullanarak tekrarlanabilir, anlamlı doku hipoksisi ölçümlerini nasıl oluşturacağınızı iyi anlamış olmalısınız.