Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Aşağıdaki deneyin genel amacı, floresan veya immünolojik analizler kullanarak tek hücre lizatlarını analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle bir mikroakışkan cihaz oluşturup iç hazneyi antikorlarla kaplayarak gerçekleştirilir. Ardından, tek hücreler tuzaklarda immobilize edilir ve ikinci bir adımda hücresel yanıtı uyarmak için çeşitli reaktiflere maruz bırakılır.

Halka şeklindeki bir valf hızla kapatılır ve cihazdan lizis tamponu akıtılır. Halka şeklindeki valf kısa bir süreliğine açılır ve hücreler mikro oda içerisinde lizize edilir; böylece serbest kalan proteinlerin, küçük hacim sayesinde yüksek konsantrasyonda antikorlara bağlanması sağlanır. Ardından, halka şeklindeki valf açılır.

Hücre yıkanır ve kapalı mikro hücreye tespit reaktifleri eklenir. Floresans yoğunluğundaki artış bir floresans mikroskobu kullanılarak zaman içinde izlenir; sonuçlar, bu sistemin tekil hücrelerden salınan ilgi çekici bir analiti nicel ve güvenilir bir şekilde tespit etme yeteneğini göstermektedir. Bu yöntem, tek hücre analizi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Özellikle, kimyasal ortamdaki varyasyonlara verilen hücresel yanıtlar üzerine sistematik araştırmalar yapılmıştır. Kimyasal stimülasyon sonucunda hücre içi moleküllerin artışı veya azalışı (up or down regulation) gözlemlenebilir. Bu tekniğin iki temel avantajı vardır.

Birincisi, immobilize edilmiş hücreleri sabit veya periyodik olarak değişen tanımlanmış bir kimyasal ortama maruz bırakabiliriz. İkinci olarak, herhangi bir çapraz kontaminasyon veya taşıma kaynaklı analit kaybı olmaksızın, örneğin yüksek hassasiyetli ve spesifik analizini gerçekleştirebiliriz. Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde üç farklı SU-8 master wafer hazırlayın.

Bir tanesi akışkan tabakayı oluşturmak için, bir tanesi kontrol tabakası için ve üçüncüsü ise mikro temas damgası için kullanılacaktır. Ardından, PDMS ve kürleme maddesinin 10'a bir oranında karışımının hazırlanmasıyla başlayarak mikroakışkan çipleri imal edin. Her iki kısmı kuvvetlice karıştırın ve çözeltiyi 30 dakika boyunca veya karışım kabarcıksız olana kadar vakumlayarak gazını alın.

Ardından, gofretle kontrol katmanını bir Petri kabının içine yerleştirin ve alt kısma bantlayın. Dört ila beş milimetre kalınlığında bir katman oluşturmak için üzerine yaklaşık 50 gram PDMS dökün ve PDMS'in tamamen kürlenmesini sağlamak için gofretle birlikte örneği 80 °C'deki fırında en az iki saat bekletin. Aynı işlemi mikro temas baskı gofreti için de tekrarlayın, ancak 50 gram yerine yaklaşık 20 gram PDMS kullanarak dört ila beş milimetre kalınlığında bir PDMS katmanı elde edin.

Alt tabakayı hazırlamak için, mikroakışkan tabakanın bulunduğu wafer üzerine 40 mikron yüksekliğinde bir PDMS tabakası spin coat ile kaplayın. Bunun için 60 saniye boyunca 2000 RPM dönüş hızı kullanın. Tüm parçalar kürlendiğinde, PDMS tabakasını bir fırında 80 °C'de bir saat boyunca kürleyin.

Kontrol katmanını wafer'dan çıkarın ve jilet yardımıyla parçalara bölün. Ardından, bir milimetrelik biyopsi iğnesi kullanarak basınç bağlantı delikleri açın ve kanalları saklama için bantla kapatın. Sonrasında, mikro temas baskılama wafer'ının üzerindeki PDMS'i kaldırın ve hazne alanı boyutunda damgalar hazırlayın.

Kullanılana kadar toz almayan bir çekmecede saklayın. Ardından, spin kaplama yapılmış wafer'ı ve dört ila beş milimetre kalınlığındaki kontrol katmanını bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Parçaları, 0.75 millibar basınçta oksijen plazması kullanarak 18 watt gücünde 45 saniye boyunca maruz bırakın.

Plazma işleminden sonra, her iki katmanı geniş çalışma mesafeli bir mikroskop altında hızla hizalayın. PDMS'in wafer'dan çıkarılmasını kolaylaştırmak için yerleştirilen üst parçaların çevresine bir miktar yedek PDMS ekleyin. Ardından, wafer'ı en az bir saat boyunca 80 °C sıcaklıktaki bir fırına yerleştirin.

Kürleme işlemi tamamlandıktan sonra, PDMS'yi wafer'dan dikkatlice ayırmak ve mikroçipleri kesip çıkarmak için bir skalpel kullanın; akışkan bağlantıları için 1,5 mm biyopsi ponksiyonu ile erişim delikleri açın. Ek olarak, 200 µL pipet ucunun üst kısmını kesip biraz yedek yarı kürlenmiş PDMS kullanarak mikroçipte bir rezervuar oluşturun. Bunu üst kısma yapıştırın.

Ardından çipi fırında 80 °C'de en az bir saat boyunca kürleyin. Bir lam ve PDMS parçalarını temizleyerek başlayın. Bir lamı sabunla temizleyin.

Distile su ile, ardından tekrar etanol ile durulayın. Lamı nitrojen akımı kullanarak kurutun. PDMS üzerindeki kalıntıları ve toz partiküllerini temizlemek için bant kullanın.

Ardından PDMS parçayı ve temizlenmiş camı yerleştirin. Sıkı bir bağlanma sağlamak için plazma temizleyiciye 18 watt gücünde 45 saniye boyunca sürün; plazma işleminin ardından çipi beş dakika boyunca ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin. Bağlanma işleminden sonra, birkaç 200 µL pipet ucunun alt kısmını kesin. Bunları %4 BSA içeren 10 ila 15 µL filtrelenmiş PBS ile doldurun ve cihazın girişlerine yerleştirin.

Ardından, içine 10 ila 15 µL PBS eklenmiş kesik uçlar kullanarak bunları kontrol kanallarına yerleştirin. Sonrasında, çipleri santrifüje yerleştirin ve kanalları sıvı ile doldurmak için beş dakika boyunca 800 ×g hızda döndürün. Herhangi bir kanalda hava kalırsa, kanallar tamamen dolana kadar bu adımı tekrarlayın.

Bloklama çözeltisini oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, çözeltiyi dakika başına 10 µL akış hızıyla PBS kullanarak sıvı tabakasından yıkayın. Şırınga pompası kullanıldığında, cihaz hücre deneyleri için hazır hale gelir; immünolojik analizler için cam lamı ön baskıya hazırlamak amacıyla, PDMS mikro temas baskı damgalarını temiz bir Petri kabında %0,5 biotinillenmiş BSA ile inkübe edin.

Yarım saat sonra, damgaları distile su ile hızlıca ve iyice temizleyin ve damgayı bir nitrojen akımı altında kurutun. Kuruduktan sonra, desenli biyotinillenmiş BSA'yı aktarmak için damgaları hızlıca temizlenmiş bir cam lam üzerine yerleştirin. Yerleştirdikten sonra damgayı hareket ettirmeyin ve damganın cam lam ile temas ettiğinden emin olun.

Eğer hafifçe yapışmamışsa, damgaya hafifçe vurun ancak sertçe bastırmayın. Ardından damgayı mikroakışkan çipin üst kısmıyla birlikte plazma haznesine yerleştirin ve 18 watt gücünde 45 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Plazma işleminden sonra damgayı lamdan çıkarın.

Yüzeye nefes vermek deseni görünür kılacaktır. Mikro odacıkları basılı yüzeyin üzerine hizalayın. Hizalama tamamlandıktan sonra, kalan yüzeyi bloke etmek için çipi 50 °C'deki bir ısıtıcı tabla üzerinde 30 dakika bekletin, daha önce gösterildiği gibi bir santrifüj yardımıyla çipe PBS içinde %4'lük steril filtrelenmiş BSA çözeltisi ekleyin, mikroçipi en az 30 dakika inkübe edin ve ardından çözeltiyi dakikada 10 µL akış hızıyla PBS kullanarak sıvı katmanından yıkayın.

Bir şırınga pompası kullanarak, çipi doğrudan kullanın veya nemli bir kutu içerisinde dört derece santigrat sıcaklıkta iki haftaya kadar saklayın. Ardından, rezervuara PBS içerisinde avadon ekleyerek tam fonksiyonel bir bağlanma yüzeyi oluşturun. Daha sonra, avadonun sıvı kanallarından geçmesini sağlamak için çözeltiyi akıtın.

Rezervuarı iyice durulayın ve kanalları PBS ile yıkayın. Ardından rezervuara protein G ekleyin ve kanallardan geçirin. Rezervuarı ve çipi PBS ile durulayarak fazla protein G'yi yıkayıp uzaklaştırın.

Ardından, ilgili antikoru rezervuara ekleyin ve kanallar boyunca akıtın. Kanalları PBS ile yıkamadan önce bağlanmaya izin vermek için akışı durdurun; hücreler kanallara yerleştirilmeden önce baskı işleminin kalitesini kontrol etmek için floresan işaretli analoglar kullanılabilir. Burada gösterilen HE 2 9 3 hücreleri gibi yapışkan hücreleri enzim içermeyen disosiasyon tamponu kullanarak toplayın ve ardından hücre kümelerinin sayısını azaltmak için onları filtreleyin; filtreleme işleminden sonra hücreleri bir şırıngaya yükleyin.

Yapışkan hücreler için, tuzaklar dolduğunda hücrelerin spesifik olmayan şekilde tutunmasını önlemek amacıyla, hücreleri mililitre başına 300,000 hücre konsantrasyonunda, şırınga pompasını kullanarak dakikada 10 ila 20 mikrolitre hızda yaklaşık üç dakika boyunca ileri akışla çipe yükleyin; ardından üst tabakayı üç bar basınçla sıkıştırarak odacıkları kapatın. Daha sonra odacıkları mikroskop altında inceleyin. Odacıkların içindeki yüzeye spesifik olmayan şekilde tutunmuş çok sayıda hücre tespit edilirse, odacıkları hızla açın ve dakikada 10 ila 30 mikrolitre akış hızıyla hücre dissosiyasyon tamponu kullanarak bunları yıkamaya çalışın.

Glikoz altı fosfat dehidrojenaz veya G6PDH analizi için, lizis tamponuna 2 mM glikoz altı fosfat, 0,5 mM NADP, mL başına 0,5 ünite DIA dizileri ve 0,3 mM RIN ekleyin ve iyice karıştığından emin olun. Kanallar temizlendikten sonra, G6PDH lizis tamponunu 30 µL/dakika akış hızıyla çip üzerinden geçirin. Lizis tamponu akarken, odacıkları hızlıca açıp kapatın; lizisin odacığa girmesine izin vermek için odacıkları 500 ms boyunca açık tutun ve lizis başladıktan hemen sonra kinetik reaksiyonu izlemeye başlayın.

Bu örnekte, floresan bir ürün zaman içinde izlenebilir. Burada, turuncu gıda boyası ile doldurulan ve ardından mikro odacıkların üzerindeki kontrol katmanının basınçlandırılmasıyla kapatılan bir odacık dizisi gösterilmektedir. Odacıkların kapatılmasından sonra, odacıkların sızdırmazlığını göstermek için kanallardan yeşil gıda boyasıyla durulama yapılmıştır.

Her bir oda, liz hücrelerinden salınan moleküllerin konsantrasyonunu analiz için yeterince yüksek tutan sadece 625 picoliter hacminde sıvı içerir. Ayrıca, odalar arasındaki çapraz kontaminasyonu önleyecek şekilde valfler açılıp kapatılabilir. Bu odalar içerisinde, tek bir PMA aktive edilmiş U 9 37 hücresinden salınan lizozom miktarı gibi analitlerin ölçülmesi mümkündür; çünkü lizozom, oda içerisinde floresan bir molekülün üretimini enzimatik olarak katalize eder.

Yeşil çizgiler, tek bir hücrenin bulunduğu odalar için floresan yoğunluğundaki zamanla meydana gelen değişimi temsil etmektedir. Ayrıca, hücre içermeyen bir odanın floresan yoğunluğu siyah noktalı çizgi ile gösterilmiştir. Karşılaştırma amacıyla, bu analiz, hücre içi bir enzim olan G six PDH'ın ölçümü yoluyla toksik bir molekülün membran bütünlüğü üzerindeki etkisini göstermektedir.

Siyah çizgi, toksik etkisi olmayan kontrol örneklerini temsil ederken, turuncu çizgi gösterilen toksinden etkilenen hücreleri temsil etmektedir. Burada, hücre içi protein için bir immünolojik analiz örneği yer almaktadır. GFP anti GFP antikorları yüzeye immobilize edilmiş ve hücreler lizedikten sonra, GFP proteinlerinin bağlanma kinetiği TIRF mikroskopisi kullanılarak görselleştirilmiştir.

0,1 zamanı lizis tamponunun eklenmesini işaret eder; 0,2 zamanında GFP yüzeyde birikmeye başlar, bu da hücre lizisinin gerçekleştiği ve GFP'nin yüzeye difüze olduğu anlamına gelir. GFP'nin antikorlara bağlanması 0,3 zamanında tamamlanır. Bu son örnekte, serbest kalan GA DH yüzeydeki yakalama antikorlarına bağlanmış ve ardından HRP bağlı saptama antikorları eklenmiştir.

Bağlanmamış tüm saptama antikorları yıkama ile uzaklaştırıldıktan sonra, saptama reaktifi eklenmiş ve reaksiyon zamana yayılmış şekilde gerçekleştirilmiştir. Burada, bu yöntem kullanılarak ölçülen U 9 37 ve HEC 2 93 hücreleri arasındaki eski hücre içi GA DH miktarının hayvan miktarları bazında bir karşılaştırması yer almaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan çiplerin nasıl hazırlanacağı, immünolojik analizleri mümkün kılmak için yüzeyin nasıl modifiye edileceği ve son olarak cihazın tek hücre analizi için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu yöntem, tek hücre biyolojisi alanındaki birçok tetikleyici sorunun yanıtlanmasına yardımcı olmak amacıyla kullanılabilir.