Name: Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Öğrenin tek hücre lizatlarını mikroakışkan çip kullanarak floresan veya immünoassay ile analiz etmeyi. Antikor kaplı odacıklarda hücreleri immobilize ederek proteinleri nicelendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle el yazması, özel yapılmış basınç kontrol sisteminin yapımı için C. BÄRTSCHI ve H. Benz prova okuma Tom Robinson kabul. Biz de temiz oda tesisi İLK ve hem ETH Zürich Işık Mikroskopi Merkezi (LMC) kullanımını kabul etmek istiyorum. Çalışma 7. Çerçeve Programı (ERC Grant başlayarak, proje yok. 203.428, nμLIPIDs) altında Merck Serono ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) tarafından finanse edildi.

1.. SU-8 Asil Fabrikasyon Aşağıdaki protokole ancak farklı maske desenler ile (şema ve boyutlar Şekil 2 için, akışkan ve kontrol) kanalları için her iki ana kalıp hazırlayın. Bu süreç Şekil 3a&#39;da gösterilmektedir. <ol><li> 180 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 4 inç silikon gofret ısıtılarak Başlangıç Bir spin-lak susuz gofret yükleyin ve spin kaplama SU-8 2015 için aşağıdaki protokol kullanın: <ol><li> (Dağıtma sonra bu adım, yakın kapak sırasında SU-8 dağıtmak, spin-lak açık kapak) 20 sn boyunca 100 rpm&#39;de gofret Spin. </li><li> 10 saniye boyunca 500 rpm&#39;de Spin gofret (bu bütün gofret üzerinde karşı yayar.) </li><li> 30 saniye boyunca 1,750 rpm&#39;de Spin gofret (20 um karşı yüksekliğini tanımlar). </li></ol></li><li> Bu aksi takdirde bir sonraki adımda sıcak plaka sopa gibi, aseton (bir bez kullanın) gofretin kenarından karşı çıkarın. Ah gofret aktarın4 dakika boyunca 95 ° C sıcaklıkta otplate. Softbake sonra, (365 nm&#39;de ölçülen 150 mJ / cm 2) UV ışığı ile bir maske hizalayıcısı cam Sodalime bantlanmış bir photomask yoluyla direnmeyi ortaya. </li><li> Maruz kaldıktan sonra, bir sıcak plaka üzerinde 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de yeniden gofret ısı. RT&#39;ye gofret soğutun ve daha sonra 4 dakika süreyle SU-8 geliştirici bir banyo içine batırmayın. Kalmayan SU-8 çıkarmak için hafifçe sallayın. Temiz oda dereceli izopropanolle gofret yıkayın ve azot ile kuru darbe. Gelişme (özellikle hücre tuzaklar) başarılı olursa bir mikroskop altında kontrol edin. Hücre tuzakları tamamen geliştirilirse, silikon gofret yansıması görünür olmalıdır. Eğer gerekirse, birkaç dakika boyunca tekrar gofret gelişir. </li><li> Tüm çözgen kalıntılarını uzaklaştırmak için 180 ° C&#39;de 2 saat boyunca bir fırın içinde pişirmeye gofret. Bir basamak Profiler ile kanal yüksekliğini kontrol edin. Yüksekliği istenilen yüksekliğe farklıysa, bu protokol yeni bir gofret ile adım 1.1 &#39;de başlayan ve tekrarspin-hızı (adım 1.1.3) değiştirebilirsiniz. 1H, 1H, 2H, gece boyunca bir kurutucu içinde 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silan ile gofret Silanizing ile ana kalıbın imalat tamamlayın. </li></ol> 2. Microcontact Baskı Master İmalatı <ol><li> Microcontact baskı için ana kalıp hazırlamak için, 180 ° C&#39;de 10 dakika boyunca bir silikon gofret dihidrat (Karşı Silanlanmış yüzeye daha iyi yapışır) 30 saniye boyunca 7,500 rpm&#39;de bu gofret üzerine 1 ml HDMS-kapladıkları Spin. AZ1518 spin-kat 2 ml pozitif bu protokol ile karşı: <ol><li> Statik Dağıtım gofret direnmek. </li><li> 500 rpm&#39;de 5 saniye için gofret Spin. </li><li> 4000 rpm&#39;de 60 saniye boyunca gofret Spin. </li></ol></li><li> Bir ocak üzerinde 100 ° C&#39;de 50 saniye softbake sonra, maruz bir photomask boyunca ve bir maske hizalayıcısı UV ışık (365 nm 21 mJ / cm 2) için direnmek. 75 saniye için AZ 726 bir banyosuna karşı geliştirin. DI-su ve darbe d ile geliştirilen gofret durulayınazot ile ry. 50 saniye boyunca 115 ° C de ısıtmak suretiyle gofret, kalan solventin çıkması. Gece boyunca, vakum altında gofret Silanize. </li></ol> 3. Mikroakışkan Chip Fabrikasyon İki katman cihazın tasarımı, bu deneyler için kullanılır. Çip son olarak bir cam slayt (Şekil 3b) üzerine bağlandığı önceki iki kat, ayrı ayrı hazırlanır ve birbirine bağlanır. Bu adım, PDMS tabakaların üretim ve microcontact baskı için PDMS damga açıklar. <ol><li> 10:1 &#39;lik bir PDMS karışımı ve bir sertleştirme ajanı hazırlayın. Toplam yaklaşık 80 gr PDMS hazırlayın (bizim tasarımlar kullanılarak, bu 10 cips neden olacaktır). Karışım ücretsiz bubble (~ 30 dk) kadar şiddetle ve hem degas parçaları PDMS karıştırın. </li><li> Alt üzerine bir Petri kabı ve bantla bunu iç kontrol katmanı ile gofret yerleştirin. Daha sonra, üstte PDMS ~ 50 g dökün ve tam sağlamak için 80 ° C&#39;de bir fırın içinde en az 2 saat boyunca gofretin koymakPDMS kür. ~ 20 g PDMS gereklidir bunun için, microcontact baskı gofret için aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Spin-kat gofret PDMS 2000 rpm&#39;lik bir dönme hızında akışkan tabakası ile yaklaşık 40 mikron yüksek PDMS bir tabaka oluşturmak için. 80 ° C&#39;de en az 1 saat boyunca bir fırın içinde PDMS Cure </li><li> Iki parça tedavi zaman, gofret, kontrol tabakası kaldırmak ve bir tıraş bıçağı ile parçalar halinde kesilir. 1 mm biyopsi zımba kullanılarak basınç bağlantısı delikler. Depolama için, bu kanal üzerinden bir bant parçası koymak için tavsiye edilir. </li><li> Iki kat bağ için, spin-kaplı gofret ve üst kısmı almak ve bir plazma temizleyici 23 yerleştirin. Plazma muameleden sonra, hızlı bir şekilde büyük bir çalışma mesafesi bir mikroskop altında her iki parça hizalayın. Yerleştirilen üst parçaların etrafında bazı yedek PDMS ekleyin. Bu adım, ancak bu gofret PDMS kaldırılmasını kolaylaştırır, zorunlu değildir. En az 1 saat boyunca 80 ° C&#39;de bir fırın içinde gofretin yerleştirin. </li><li> Dikkatli gofret PDMS kaldırmak ve mikroçip kesmek için bir neşter kullanın. 1.5 mm biyopsi zımba ile akışkan bağlantıları için erişim delikler. </li><li> PDMS çip şimdi bitti ve ay boyunca saklanabilir. İsteğe bağlı: çip bir rezervuar ile kullanılırsa, 200 ul pipet üst kısmını kesip üstüne yapıştırmak için bazı yedek, yarı işlenmiş PDMS kullanabilirsiniz. En az 1 saat boyunca 80 ° C&#39;de yeniden fırında çipi koyun. </li></ol> 4. Cam Slide Bonding Direkt enzimatik tahliller için cihazı kullanmak için, yapıştırma sonra gerekli tek adım yüzeylerin engelleme olduğunu. Bu protokol için, immünodeneyler veya ELISA&#39;lan için mikroakışkan çipi kullanmak Ancak, A. geçin, sadece (yani TIRF mikroskopi veya SPR&#39;nin için) cam slayt bağlanma sitelerini sınırlandırmak için protokol B başvurun. Bu kısıtlama önemli değilse, A&#39;ya bakınız, ancak adım 4.3 biotinli konjugatlarını kullanın ve adım 4.8 ile devam edinProtokol B tamamen işlevsel bir yüzey oluşturmak için. Önceki protokol A ve B gerçekleştirmeden: Bu önce çipin içine tanıtmak için kullanılan protein tüm çözümleri filtre tavsiye edilir. Moloz ve protein agregatları, aksi böylece analiz için kullanılabilir bölmelerin sayısını azaltarak, hücre tuzakları engelleyebilir. Bu amaç için, kanalların içine verilmeden önce bütün çözümler filtre protein olmayan adsorbe edici bir filtre birimi kullanır. Protokol A (enzim tahlilleri) <ol><li> Mikroakışkan cihaz sonuçlandırmak için, bir cam slayt üzerine PDMS parçaları bağ. Bunu yapmak için, önce sabun, damıtılmış su ve etanol ile bir cam slayt temizleyin. , Bir nitrojen akışı kullanılarak slayt kurutun. Seloteyple PDMS kısmını temizleyin. </li><li> Sıkı bir bağ temin etmek için 18 W da 45 saniye boyunca plazma temizleyici içine PDMS bölümü ve temizlenmiş cam slayt bir ifadeyle, 5 dakika boyunca bir sıcak levha (100 ° C) üzerindeki çip koydu. </li><li> Bağlamadan sonra, f çip doldurunLUIDs. Bunu başarmak kolay bir yolu merkezkaç kuvvet kullanmaktır. 200 ul pipet ucunun alt kısmı kesilir. Akışkan kanal için, bloklama çözeltisi ile doldurun (sığır serum albümini (% 4 a / h) ya da poli-L-lizin) aşılanmış polietilen glikol (0.05% w / v) ve girişleri içine ipuçları yerleştirin. Su ile veya bir isosmotic çözelti, örneğin, PBS ile kontrol katmanı girişleri doldurun. 5 dakika boyunca santrifüj (800 x g) içine çip yerleştirin. Kanallar artık tamamen sıvı ile dolu olmalıdır. Eğer değilse, bu adımı tekrarlayın. </li><li> , Oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca bloke çözeltisi inkübe edin. Bir şırınga pompası kullanılarak 10 ul / dk &#39;lık bir akış hızında PBS ile sıvı tabakanın dışarı çözeltisi yıkayın. Cihaz artık cep deneyler için hazır. </li></ol> Protokol B (bağışıklık) Itibaren aşama 4,7 yüzey modifikasyonu tam bir genel bakış için, Tablo 1&#39;e bakınız. <ol start="5"><li> IçindeBir bBSA / BSA çözeltisi (örneğin 1-100) ile microcontact baskı için cubate PDMS pulları. 30 dakika sonra damıtılmış su ile iyice pulları temizlemek ve bir nitrojen akışı altında pul kurutun. Hızlı bir şekilde temizlenmiş cam slayt (Şekil 4) damgaları yerleştirin. </li><li> Birlikte, bir plazma temizleme maksimum güç (W 18) 45 saniye boyunca oksijen plazma mikroakışkan çip üst kısmı ile damga ile cam slayt Açığa. Plazma tedaviden sonra, damga kaldırmak ve cihazın microchambers altında yazdırılan yüzeye hizalamak. 50 ° C &#39;de sıcak bir plaka üzerinde 30 dakika boyunca çip yerleştirin </li><li> Geri kalan yüzeyi engellemek için, santrifüj ile yonga içine steril olarak filtre edilmiş BSA çözeltisi (% 4 (w / v) PBS içinde) (adım 4.2) tanıtmak. 1 saat boyunca inkübe edilir ve PBS ile akışkan tabaka (adım 4.3) üzerinden çözeltisi yıkayın. Çip, daha sonra bir nemli kutu içinde 4 ° C&#39;de doğrudan kullanılabilir ya da 2 haftaya kadar saklanabilir. </li><li> Tamamen işlevsel bir bağlanma için Surface, rezervuar, streptavidin (0.025% (w / v) PBS içinde) sunar. Akışkan kanallardan avidin çözeltisi çekilme 30 dakika boyunca 5 ul / dk &#39;lık bir akış hızı kullanarak. Daha sonra, 10 dakika boyunca PBS yıkayın. Iyice rezervuar durulayın. </li><li> Daha sonra, Protein G (% 0.0025 (w / v) PBS içinde) ve diğer bir 30 dakika boyunca çalkalama ekleyin. Daha sonra başka bir 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın. Daha sonra, 10 dakika süre ile, ilgi konusu antikoru (% 0.0001 (w / v) PBS içinde) ilave edin. 10 dakika sonra, bağlayıcı izin vermek için 15 dakika boyunca akışını durdurmak. Daha sonra, 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın. </li></ol> 5. Hücre Deneyler Protokol nedeniyle olası tahlillerinin çeşitli genel olarak yazılmıştır. Bir örnek olarak, G6PDH toksisite deneyi için gerekli olan reaktif maddeler verilir. Cihazın ilk hücre hapsi verimi yani 200 hücre üzerinden 5 tuzağa olacak,% 2.5 civarındadır. Hücre tuzakların son doluluk kuvvetle kullanılan hücre hattı, askıya protokole bağlıdırhücre soyu ve zaman hücreler kanalı ile temizlendi. Doğal (örneğin, U937 gibi) süspansiyon içinde büyüyen hücreler için, tek hücreler, bir kaç dakika sonra, odalar yaklaşık% 75 bulunabilir. Diğer odalar ya da dolu ya da iki ya da daha çok hücre tarafından işgal edilmez. Genel olarak, tek hücreli bir kişi yapışık hücre çizgileri için daha küçüktür. Burada yer alan oldukça hafif süspansiyon protokolünü kullanırken, yüzde (HEK MLT hücreleri) yaklaşık% 30 azalır. Tek hücreli bir kişi, hücrelerin tripsin muamelesi ile artırılabilir, ama bu da deneylerin sonuçlarını değiştirebilir. Hedef moleküle bağlı olarak, PDMS adsorpsiyon ya da emme sonuçlarını etkileyebilir. Adsorpsiyon BSA veya PLL-PEG-g ile yüzeylerin bloke ederek azaltılabilir. Emilim en hidrofilik biyomoleküllere için olası değildir, ancak (küçük) lipofilik hücre bileşenleri için kontrol edilmelidir. <ol><li> Özel protokole göre hücreleri hazırlayın (örneğin, </em&gt; ilaç eklenmesi). Süspansiyon hücreleri için, çip doğrudan hücreler ekleyin. Yapışkan hücre hatları, bir hücre süspansiyonu üretmek için enzim içermeyen ayrışma tampon kullanın. Hücre kümelerinin miktarını azaltmak üzere çipe tanıtarak önce hücreler filtre. </li><li> , Bir şırınga pompası ve ileri akış kullanılarak çip üzerine hücreleri yük yerine, hücre süspansiyonu çekilme. Kanal duvarlarına hücre spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için bu yana yapışkan hücreler için süspansiyon hücre hatları ve 10-20 | il / dk &#39;lık yüksek akış oranları için 5 ul / dk&#39; lık bir akış hızı kullanarak. </li><li> Trans dolu olduğunda, odacıkları kapatın. Birçok hücre yüzeyine spesifik olmayan yapışma ise, 10-30 ul / dk &#39;lık bir akış oranında hücre ayrışma tamponu ile aşındırmak deneyin. </li></ol> Protokol A (enzim tahlilleri) <ol start="4"><li> Yongası ile lizis tamponu çekiniz. Bu örnek için, bu tampon ilave Tween 20 (10 mM Tris-HCI, 10 ile bir hypoosmolar tampondurmM KCI, 1.5 mM MgCI2, 1% (v / v) Tween 20). Liziz için, hızlı bir şekilde açılır ve kapanır bölmeleri (örneğin 10-50 ul / dak 7,21 akış oranları için 500 msn). G6PDH deneyi için, 2 mM glikoz-6-fosfat, 0.5 mM NADP, 0.5 U / ml diaforaz ve lizis tamponuna 0.3 mM resazurin ekleyin. Liziz hemen sonra kinetik reaksiyon izleme başlatın. </li></ol> Not: tahlil için uygun olan herhangi bir tampon seçin (Triton, SDS) gibi güçlü deterjanlar lyse hücreler hemen ve oda açılması sırasında analit kaybına yol açacaktır aklınızda ancak çıplak. Protokol B (bağışıklık) ELISA hücre deneylerinde (debileri, oda durumu, vb) kısa bir açıklama için, Tablo 1&#39;e bakınız. <ol start="5"><li> ELISA için, doğrudan liziz tamponu için gerekli saptama reajanı (ör. ikincil antikor, etiketli antijen) ekleyin. Bu tarifnamede Twee eklendin 20 spesifik olmayan adsorpsiyon azaltır. 5.4 aşamasına göre Lyse hücreler. (Kullanılan antijen ve antikor bağlı inkübasyon süresi) bağlanmaya imkan vermek için 10-15 dakika için karışımın inkübe edin. </li><li> Kanal duvarlarına spesifik olmayan adsorbe antikor enzim konjugatları, halihazırda hazne ve kanal içindeki saptama reaktif bir dönüşüme yol açabilir. Bu emilmesidir sorunların azaltılması (saptama reaktif maddesi ilave edilmeden önce, oda kapalı) inkübasyon süresi esnasında yongası ile kullanılan algılama enzim inhibitörü, bir sürekli temizleme için. HRP için, kalıcı olarak spesifik olmayan bir adsorbe edilen enzimleri inaktive etmek için su içinde 20 mM HCl kullanımı. </li><li> İnkübasyon süresinden sonra, çip, deteksiyon reajanı (örneğin, Amplex Red ve HRP için hidrojen peroksit) sunar. Uzakta nonbound ikincil antikor yıkamak için kısa bir süre tekrar odaları açın ve algılama reaktifi ekleyin. Hemen kinetik reaksiyon izleme başlatın. </li><li> Kalibrasyon: hareketsizilgi konusu hedef karşı antikor. Yakın odaları. Tampon maddesi içinde ya da off-çip hücre lizatı analit farklı konsantrasyonlarda hazırlayın. Çipine bir konsantrasyon uygulayın ve hızlı bir şekilde odalarına (açılış saati 500 msn) iç hacmi değişimi. Bu açılma süresi ek bir birikimi meydana gelir analit yıkama sağlamak için yeterince kısa ve microchamber hacminden moleküllerin sadece bir belirli sayıda tespit edilir. Çözelti içindeki antijenin bilinen konsantrasyon ve odacığın hacminin (625 pl) itibaren, bölmenin içindeki miktarını hesaplar. Daha sonra, adım 5.5 ile devam edin ve algılama parçasını tanıtmak. </li></ol>

<ol><li>Walling, M. A., Shepard, J. R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+and+live+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity and live cell arrays.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).</li>
<li>Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological single cell analysis.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).</li>
<li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+single+cell+analysis%3A+from+promise+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).</li>
<li>Faley, S., Seale, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platform+for+real-time+signaling+analysis+of+multiple+single+T+cells+in+parallel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel.</a> Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+enzyme+concentrations%2C+kinetics%2C+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).</li>
<li>Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyphenated+optical+trap+capillary+electrophoresis+laser+induced+native+fluorescence+system+for+single-cell+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis.</a> Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchamber+array+for+single+cell+isolation+and+analysis+of+intracellular+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules.</a> Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li>
<li>Ma, C., Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).</li>
<li>Shi, Q., Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+circulating+tumor+cells%3A+transcriptional+heterogeneity+and+diversity+from+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines.</a> PLoS ONE. 7 (5), e33788(2012).</li>
<li>Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+polarity%2C+stem+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell polarity, stem cells and cancer.</a> Nature. 12 (1), 23-38 (2012).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li>
<li>Gao, Y., Majumdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+valve-enabled+microfluidic+cell+co-culture+platform+and+demonstration+of+its+applications+to+neurobiology+and+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology.</a> Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).</li>
<li>White, A. K., VanInsberghe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microfluidic+single-cell+RT-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).</li>
<li>Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).</li>
<li>Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+real+time+analysis+of+protein+secretion+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Towards real time analysis of protein secretion from single cells.</a> Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Cai, D., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+Nanotechnologies+for+Study+of+Cell+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).</li>
<li>Huang, N. T., Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+platform+for+in+situ+cellular+cytokine+secretion+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping.</a> Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.</li>
<li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li>
<li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+%28G6PD%29%3A+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Mikroakiskan teknoloji tek-hücre analizi için yeni ve ilginç olanaklar açtı. Özellikle, tuzak olasılığı ve mikroakışkan araçları hücreleri tek tek hareketsiz tek hücre özellikleri ve tepki üzerine sistematik kısa ve uzun vadeli çalışmalar izin verdi. Buna ek olarak, bir mikro çip üzerinde oluşturulan mikro damlacıkların yüksek frekans, hücrelerin kapsüllenmesi, geleneksel sitometrisi cihazlarla gerçekleştirilemez tek hücre salgısı çalışmalar, sağladı. Mikrodamlacık yaklaşım, ancak, inkübasyon ve yıkama adımları analitik...

Geçmişte birçok çalışmalar, hücre-hücre geniş bir hücre popülasyonu içinde 1-3 farklılıklar, özellikle sinyal 4 işler ya da bu tür proteinler 5,6, metabolitleri ve kofaktörler gibi hücre içi 7,8 biyomoleküllerin miktarlarını ortaya koymuştur. Bu heterojenliklerdir hücre uyumu ve evrimi 9 için temelde önemli olabilir, ama aynı zamanda kanser 10-13 gibi hastalıkların ortaya çıkması ve tedavisinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bu yüzden, tek hücre düzeyinde çalışmalar, bu çalışmalar, biyolojik olarak aktif kimyasal maddeler ile muamele edildikten sonra, farklı hücresi tepkilerini ortaya çıkarmak, özellikle biyolojik ve farmakolojik araştırmalar yüksek ilgi çekmektedir. Son yıllarda, çok sayıda analitik platformlar tek bir canlı hücrelerin analizi ya da hücre içeriği kimyasal kompozisyona geliştirilmiştir. Floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) altın st ikenandard tek bir canlı hücre çok yüksek verimli analizi için, yöntem, hücre içi veya salgılandığı bileşiklerin miktar tayini için kullanılabilir olamaz. Mikroakışkan platformların ortaya çıkması konumlandırma, tedavi ve tek hücre gözlem için yeni analitik stratejiler söz verdi. Mikroakiskan bir dönüm noktası Quake ve arkadaşları 14,15 tarafından gerçekleştirilen esnek PDMS vanaların entegrasyonu ile ulaşıldı. Onlar yonga üzerinde bölgeleri izole çünkü bu vanalar yararlıdır, örneğin iki kültürü 16 ayrı. Dahası, tek bir hücre analizi için özellikle uygun olan ve bu nedenle de bir analit sulandırma sorunlarını azaltmak için yardımcı olur. Tek hücre analizi için bu yaklaşımın gücü son Hansen ve 17 paralel olarak tek bir hücre yüzlerce gen ekspresyonunu analiz arkadaşları tarafından gösterilmiştir. Proteinler ve metabolitleri hedeflerken, analiz nedeniyle uygun olmaması için çok zordurmplification yöntemleri, farklı buluşa ait bileşiklerin, kimyasal yapıları ve bunların varyasyonlarının çok sayıda. Ayrıca, çoğu hücre içi biyomoleküller birkaç on bin 18 sırasına göre, düşük kopya sayısında mevcut olması beklenmektedir, bu yüzden, kullanılan analitik yöntem, yüksek bir hassasiyete sahip olmalıdır. Bu tür bağışıklık ve enzim-bağlantılı bağışıklık denemeler (ELISA) gibi daha güçlü deneyleri da birkaç yıkama ve inkübasyon aşaması hem de yüzey immobilizasyon gerektiğinden mikroakışkan cihazlara entegre zordur. Yaşanan bu zorluklar nedeniyle, bu proteinler ya da metabolitleri tek hücre düzeyinde üzerinde rakama dökülmüştür burada sadece birkaç örnek rapor edilmiş olması şaşırtıcı değildir. Örneğin, floresan bileşikleri salgılaması üzerindeki çalışmalar 19,20 bildirilmiştir. Son zamanlarda, ELISA ile uygulama, bir hücre kültüründen salgılanan (nonfluorescent) protein (THP-1 hücreleri) 21 ve bir (i analizi için sunulmuşturmmune) hücreler 10. Hücre içi proteinleri hedefleyen, Shi et al. Bir bağışıklık 11 vasıtasıyla tümör hücrelerinde sinyal yollarının analizi için hücre içi proteinlerin tanımlanmasını kolaylaştırılmış bir mikroakışkan cihaz geliştirmiştir. Bununla birlikte, proteinlerin, sadece nispi miktarları tespit edilmiştir ve herhangi bir enzimatik amplifikasyon düşük bolluk proteinleri için sinyali geliştirmek için kullanıldı. Son zamanlarda, floresan deneyleri 8 ve bağışıklık 22 ile tek-hücre yakalama mikrocihazda (Şekil 1) birleştirmek mümkün. Hücreler pasif arz ve hücrelerin herhangi bir hareketi olmadan orta ve diğer kimyasal maddelerin (hızlı) değişimine izin mikroölçülerdeki engel yapılarda, içinde sıkışıp kalırlar. Her bir tuzak etrafında halka şeklinde bir kapak, çok küçük bir hacme (&quot;microchamber&quot;) olarak hücre izolasyonunu sağlar. Bu valf hemen o, bir hücre-yokedici (hypoosmolar) tampon tanıttıktan sonra çalıştırılırnce uzaklaşacak şekilde yayılan moleküllerin hücre içi ya da salgılanan moleküller önler. En önemli olarak, hacim (625 ul) içinde küçük boyutu, moleküllerin büyük bir seyreltme önlenir. Parçalama ve analiz çip aynı pozisyonda yapılmaktadır Bundan başka, taşıma nedeniyle analitlerin kaybı yoktur. Burada açıklanan çip tasarımı 60 microchambers toplam 7 veya 8 ya microchambers 8 alternatif satır içerir. Bir hat boyunca çapraz kontaminasyon engellenir, böylece odalar, sıralar halinde kumanda edilir. Platform floresan denemelerinde hem de immünolojik tayinler (Şekil 1d) ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. Ikincisi için, çip, üretim ve montaj işlemi ile uyumlu olan antikorların, hareketsiz hale getirmek için protokoller kurulmuştur. Dolayısıyla platformu tek hücre düzeyinde, hassas, güvenilir ve ölçülebilir deneyleri için yolu açar. Şimdiye kadar, i analizi için cihaz kullanmıştırntracellular ve salgılanan enzimler (enzim deneyleri ile görece nicel), hücre içi kofaktörler, proteinler ve küçük moleküller (nokta tahlilleri ya da ELISA ile kesin miktar). Aşağıda, microcontact baskı ve yüzey kimyası vasıtası ile çok katmanlı yumuşak litografi ve antikor modelleme için protokol vasıtasıyla çip imalat sürecini tarif eder. Ayrıca, yonga kullanımı ve operasyonların bazı örnekler verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reaktif</td><td>Şirketinin</td> Adı <td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar (isteğe bağlı)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td><td>na.1H,1H,2H,2H-Perflorodesil-dimetilkloro-silan</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ABCR (Karlsruhe, Almanya)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbelliferil &beta;-DN,N&prime;-diasetilkiyosit hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Almanya)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Elektronik Malzemeler (Wiesbaden, Almanya)</td><td>n.a.AZ</td><td></td></tr> <tr><td>726 geliştirici</td><td>AZ Elektronik Malzemeler (Wiesbaden, Almanya)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini, biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>Hücre ayrışma tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Heksametildisilazan (HDMS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Almanya)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR developer 600</td><td>Microresist technology GmbH (Berlin, Almanya)</td><td>n.a.PBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG aşılı</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, İsviçre)</td><td>n.a.PLL-g-PEG</td><td></td></tr> <tr><td>aşılı biotin</td><td>SuSoS, (D&uuml; bendorf, İsviçre)</td><td>n.a.Potasyum</td><td></td></tr> <tr><td>klorür</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>Protein G, biotin</td><td>Sigma İnce Kimyasallar</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>Silikon gofret</td><td>Si-Mat (Kaufering, Almanya)</td><td>n.a.Sylgard</td><td></td></tr> <tr><td>184 Silikon Elastomer Kiti (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroksimetil)-aminometan</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1610716</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>EKİPMANLAR: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malzeme</td><td></td><td>Adı Şirket Katalog Numarası</td><td>Yorumlar (isteğe bağlı)</td></tr> <tr><td>0.22 &; m PES şırınga filtresi</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1/1.5 mm biyopsi zımba Miltex</td><td>, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Trics filtresi 20 ve mikro; m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.Hotplate</td><td></td></tr> <tr><td>HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Sax, İsviçre</td><td>n.a.MA-6</td><td></td></tr> <tr><td>maske hizalayıcı</td><td>Karl Suess</td><td>n.a.Multizoom</td><td></td></tr> <tr><td>AZ100M mikroskop</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.Photomask</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microlitho, Essex, Birleşik Krallık</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Plazma Temizleyici PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>kaplayıcı Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>Modülleri SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, İsviçre</td><td>n.a.Step</td><td></td></tr> <tr><td>profil oluşturucu Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.Şırınga</td><td></td></tr> <tr><td>pompası neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücrelerinin yönlü kimyasal analiz için mikroakışkan chip

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Biz, paralel çok sayıda tek hücre içi biyomoleküllerin nicel tespitine olanak sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunmaktır. Bu amaç için, hücreler, pasif bir microchamber ortasında tutulur. Kontrol katmanı aktivasyonu üzerine, hücre küçük bir oda içinde çevreleyen hacim izole edilir. Çevredeki hacmi daha sonra izole edilmiş hücre etkilemeden değiştirilebilir. Bununla birlikte, haznenin kısa açma ve kapama sırasında, odacık içindeki çözelti birkaç yüz milisaniye içinde değiştirilebilir. Nedeniyle odaların düzelmesi için, hücreler, inkübasyon, yıkama, ve son olarak, hücre erimesi için, örneğin, bir çok kontrol edilebilir bir şekilde farklı çözüm sırayla maruz edilebilir. Sıkıca kapatılmış microchambers, lizat tutulmasını sağlayacak en aza indirmek ve hücre lizi sonrasında seyreltme kontrol eder. Parçalama ve analiz aynı yerde meydana geldiği, yüksek hassasiyet muhafaza edilir, çünkü başka bir danalitlerin ilution veya zarar taşıma sırasında ortaya çıkar. Microchamber tasarım, bu nedenle tek tek hücrelerden salınan hücre içi moleküller (attomoles, zeptomoles) çok küçük kopya numaralarının, güvenilir ve tekrarlanabilir bir analiz sağlar. Ayrıca, birçok microchambers uygun optik aletler izlenmesi için kullanılan göz önüne alındığında, aynı anda bir çok hücre analizini sağlayan bir dizi biçimde düzenlenebilir. Biz zaten hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörlerin ve göreli veya mutlak ölçülebilir şekilde ikinci haberciler analiz etmek proof-of-concept çalışmaları için bir platform kullandık.

Bizim platformu içinde mevcut ya da tek hücreleri tarafından üretilen bir hücre içinde çeşitli yanı sıra salgılanmış molekülleri analiz edebilmektedir. Burada, olası deneylerin çeşitliliği vurgulamak için farklı bir örnek çalışmalar sunmak istiyorum. Bir salgılanmış bir enzim (Şekil 5a) ve hem de bir hücre içi enzim (Şekil 5b) ve protein (Şekil 5c ve d) için bir örnek verir. Böyle cofactors veya küçük moleküller gibi daha fazla örnek için, Eyer ve d...

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, floresan veya immünolojik analizler kullanarak tek hücre lizatlarını analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle bir mikroakışkan cihaz oluşturup iç hazneyi antikorlarla kaplayarak gerçekleştirilir. Ardından, tek hücreler tuzaklarda immobilize edilir ve ikinci bir adımda hücresel yanıtı uyarmak için çeşitli reaktiflere maruz bırakılır.Halka şeklindeki bir valf hızla kapatılır ve cihazdan lizis tamponu akıtılır. Halka şeklindeki valf kısa bir süreliğine açılır ve hücreler mikro oda içerisinde lizize edilir; böylece serbest kalan proteinlerin, küçük hacim sayesinde yüksek konsantrasyonda antikorlara bağlanması sağlanır. Ardından, halka şeklindeki valf açılır.Hücre yıkanır ve kapalı mikro hücreye tespit reaktifleri eklenir. Floresans yoğunluğundaki artış bir floresans mikroskobu kullanılarak zaman içinde izlenir; sonuçlar, bu sistemin tekil hücrelerden salınan ilgi çekici bir analiti nicel ve güvenilir bir şekilde tespit etme yeteneğini göstermektedir. Bu yöntem, tek hücre analizi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Özellikle, kimyasal ortamdaki varyasyonlara verilen hücresel yanıtlar üzerine sistematik araştırmalar yapılmıştır. Kimyasal stimülasyon sonucunda hücre içi moleküllerin artışı veya azalışı (up or down regulation) gözlemlenebilir. Bu tekniğin iki temel avantajı vardır.Birincisi, immobilize edilmiş hücreleri sabit veya periyodik olarak değişen tanımlanmış bir kimyasal ortama maruz bırakabiliriz. İkinci olarak, herhangi bir çapraz kontaminasyon veya taşıma kaynaklı analit kaybı olmaksızın, örneğin yüksek hassasiyetli ve spesifik analizini gerçekleştirebiliriz. Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde üç farklı SU-8 master wafer hazırlayın.Bir tanesi akışkan tabakayı oluşturmak için, bir tanesi kontrol tabakası için ve üçüncüsü ise mikro temas damgası için kullanılacaktır. Ardından, PDMS ve kürleme maddesinin 10'a bir oranında karışımının hazırlanmasıyla başlayarak mikroakışkan çipleri imal edin. Her iki kısmı kuvvetlice karıştırın ve çözeltiyi 30 dakika boyunca veya karışım kabarcıksız olana kadar vakumlayarak gazını alın.Ardından, gofretle kontrol katmanını bir Petri kabının içine yerleştirin ve alt kısma bantlayın. Dört ila beş milimetre kalınlığında bir katman oluşturmak için üzerine yaklaşık 50 gram PDMS dökün ve PDMS'in tamamen kürlenmesini sağlamak için gofretle birlikte örneği 80 °C'deki fırında en az iki saat bekletin. Aynı işlemi mikro temas baskı gofreti için de tekrarlayın, ancak 50 gram yerine yaklaşık 20 gram PDMS kullanarak dört ila beş milimetre kalınlığında bir PDMS katmanı elde edin.Alt tabakayı hazırlamak için, mikroakışkan tabakanın bulunduğu wafer üzerine 40 mikron yüksekliğinde bir PDMS tabakası spin coat ile kaplayın. Bunun için 60 saniye boyunca 2000 RPM dönüş hızı kullanın. Tüm parçalar kürlendiğinde, PDMS tabakasını bir fırında 80 °C'de bir saat boyunca kürleyin.Kontrol katmanını wafer'dan çıkarın ve jilet yardımıyla parçalara bölün. Ardından, bir milimetrelik biyopsi iğnesi kullanarak basınç bağlantı delikleri açın ve kanalları saklama için bantla kapatın. Sonrasında, mikro temas baskılama wafer'ının üzerindeki PDMS'i kaldırın ve hazne alanı boyutunda damgalar hazırlayın.Kullanılana kadar toz almayan bir çekmecede saklayın. Ardından, spin kaplama yapılmış wafer'ı ve dört ila beş milimetre kalınlığındaki kontrol katmanını bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Parçaları, 0.75 millibar basınçta oksijen plazması kullanarak 18 watt gücünde 45 saniye boyunca maruz bırakın.Plazma işleminden sonra, her iki katmanı geniş çalışma mesafeli bir mikroskop altında hızla hizalayın. PDMS'in wafer'dan çıkarılmasını kolaylaştırmak için yerleştirilen üst parçaların çevresine bir miktar yedek PDMS ekleyin. Ardından, wafer'ı en az bir saat boyunca 80 °C sıcaklıktaki bir fırına yerleştirin.Kürleme işlemi tamamlandıktan sonra, PDMS'yi wafer'dan dikkatlice ayırmak ve mikroçipleri kesip çıkarmak için bir skalpel kullanın; akışkan bağlantıları için 1,5 mm biyopsi ponksiyonu ile erişim delikleri açın. Ek olarak, 200 µL pipet ucunun üst kısmını kesip biraz yedek yarı kürlenmiş PDMS kullanarak mikroçipte bir rezervuar oluşturun. Bunu üst kısma yapıştırın.Ardından çipi fırında 80 °C'de en az bir saat boyunca kürleyin. Bir lam ve PDMS parçalarını temizleyerek başlayın. Bir lamı sabunla temizleyin.Distile su ile, ardından tekrar etanol ile durulayın. Lamı nitrojen akımı kullanarak kurutun. PDMS üzerindeki kalıntıları ve toz partiküllerini temizlemek için bant kullanın.Ardından PDMS parçayı ve temizlenmiş camı yerleştirin. Sıkı bir bağlanma sağlamak için plazma temizleyiciye 18 watt gücünde 45 saniye boyunca sürün; plazma işleminin ardından çipi beş dakika boyunca ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin. Bağlanma işleminden sonra, birkaç 200 µL pipet ucunun alt kısmını kesin. Bunları %4 BSA içeren 10 ila 15 µL filtrelenmiş PBS ile doldurun ve cihazın girişlerine yerleştirin.Ardından, içine 10 ila 15 µL PBS eklenmiş kesik uçlar kullanarak bunları kontrol kanallarına yerleştirin. Sonrasında, çipleri santrifüje yerleştirin ve kanalları sıvı ile doldurmak için beş dakika boyunca 800 ×g hızda döndürün. Herhangi bir kanalda hava kalırsa, kanallar tamamen dolana kadar bu adımı tekrarlayın.Bloklama çözeltisini oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, çözeltiyi dakika başına 10 µL akış hızıyla PBS kullanarak sıvı tabakasından yıkayın. Şırınga pompası kullanıldığında, cihaz hücre deneyleri için hazır hale gelir; immünolojik analizler için cam lamı ön baskıya hazırlamak amacıyla, PDMS mikro temas baskı damgalarını temiz bir Petri kabında %0,5 biotinillenmiş BSA ile inkübe edin.Yarım saat sonra, damgaları distile su ile hızlıca ve iyice temizleyin ve damgayı bir nitrojen akımı altında kurutun. Kuruduktan sonra, desenli biyotinillenmiş BSA'yı aktarmak için damgaları hızlıca temizlenmiş bir cam lam üzerine yerleştirin. Yerleştirdikten sonra damgayı hareket ettirmeyin ve damganın cam lam ile temas ettiğinden emin olun.Eğer hafifçe yapışmamışsa, damgaya hafifçe vurun ancak sertçe bastırmayın. Ardından damgayı mikroakışkan çipin üst kısmıyla birlikte plazma haznesine yerleştirin ve 18 watt gücünde 45 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Plazma işleminden sonra damgayı lamdan çıkarın.Yüzeye nefes vermek deseni görünür kılacaktır. Mikro odacıkları basılı yüzeyin üzerine hizalayın. Hizalama tamamlandıktan sonra, kalan yüzeyi bloke etmek için çipi 50 °C'deki bir ısıtıcı tabla üzerinde 30 dakika bekletin, daha önce gösterildiği gibi bir santrifüj yardımıyla çipe PBS içinde %4'lük steril filtrelenmiş BSA çözeltisi ekleyin, mikroçipi en az 30 dakika inkübe edin ve ardından çözeltiyi dakikada 10 µL akış hızıyla PBS kullanarak sıvı katmanından yıkayın.Bir şırınga pompası kullanarak, çipi doğrudan kullanın veya nemli bir kutu içerisinde dört derece santigrat sıcaklıkta iki haftaya kadar saklayın. Ardından, rezervuara PBS içerisinde avadon ekleyerek tam fonksiyonel bir bağlanma yüzeyi oluşturun. Daha sonra, avadonun sıvı kanallarından geçmesini sağlamak için çözeltiyi akıtın.Rezervuarı iyice durulayın ve kanalları PBS ile yıkayın. Ardından rezervuara protein G ekleyin ve kanallardan geçirin. Rezervuarı ve çipi PBS ile durulayarak fazla protein G'yi yıkayıp uzaklaştırın.Ardından, ilgili antikoru rezervuara ekleyin ve kanallar boyunca akıtın. Kanalları PBS ile yıkamadan önce bağlanmaya izin vermek için akışı durdurun; hücreler kanallara yerleştirilmeden önce baskı işleminin kalitesini kontrol etmek için floresan işaretli analoglar kullanılabilir. Burada gösterilen HE 2 9 3 hücreleri gibi yapışkan hücreleri enzim içermeyen disosiasyon tamponu kullanarak toplayın ve ardından hücre kümelerinin sayısını azaltmak için onları filtreleyin; filtreleme işleminden sonra hücreleri bir şırıngaya yükleyin.Yapışkan hücreler için, tuzaklar dolduğunda hücrelerin spesifik olmayan şekilde tutunmasını önlemek amacıyla, hücreleri mililitre başına 300,000 hücre konsantrasyonunda, şırınga pompasını kullanarak dakikada 10 ila 20 mikrolitre hızda yaklaşık üç dakika boyunca ileri akışla çipe yükleyin; ardından üst tabakayı üç bar basınçla sıkıştırarak odacıkları kapatın. Daha sonra odacıkları mikroskop altında inceleyin. Odacıkların içindeki yüzeye spesifik olmayan şekilde tutunmuş çok sayıda hücre tespit edilirse, odacıkları hızla açın ve dakikada 10 ila 30 mikrolitre akış hızıyla hücre dissosiyasyon tamponu kullanarak bunları yıkamaya çalışın.Glikoz altı fosfat dehidrojenaz veya G6PDH analizi için, lizis tamponuna 2 mM glikoz altı fosfat, 0,5 mM NADP, mL başına 0,5 ünite DIA dizileri ve 0,3 mM RIN ekleyin ve iyice karıştığından emin olun. Kanallar temizlendikten sonra, G6PDH lizis tamponunu 30 µL/dakika akış hızıyla çip üzerinden geçirin. Lizis tamponu akarken, odacıkları hızlıca açıp kapatın; lizisin odacığa girmesine izin vermek için odacıkları 500 ms boyunca açık tutun ve lizis başladıktan hemen sonra kinetik reaksiyonu izlemeye başlayın.Bu örnekte, floresan bir ürün zaman içinde izlenebilir. Burada, turuncu gıda boyası ile doldurulan ve ardından mikro odacıkların üzerindeki kontrol katmanının basınçlandırılmasıyla kapatılan bir odacık dizisi gösterilmektedir. Odacıkların kapatılmasından sonra, odacıkların sızdırmazlığını göstermek için kanallardan yeşil gıda boyasıyla durulama yapılmıştır.Her bir oda, liz hücrelerinden salınan moleküllerin konsantrasyonunu analiz için yeterince yüksek tutan sadece 625 picoliter hacminde sıvı içerir. Ayrıca, odalar arasındaki çapraz kontaminasyonu önleyecek şekilde valfler açılıp kapatılabilir. Bu odalar içerisinde, tek bir PMA aktive edilmiş U 9 37 hücresinden salınan lizozom miktarı gibi analitlerin ölçülmesi mümkündür; çünkü lizozom, oda içerisinde floresan bir molekülün üretimini enzimatik olarak katalize eder.Yeşil çizgiler, tek bir hücrenin bulunduğu odalar için floresan yoğunluğundaki zamanla meydana gelen değişimi temsil etmektedir. Ayrıca, hücre içermeyen bir odanın floresan yoğunluğu siyah noktalı çizgi ile gösterilmiştir. Karşılaştırma amacıyla, bu analiz, hücre içi bir enzim olan G six PDH'ın ölçümü yoluyla toksik bir molekülün membran bütünlüğü üzerindeki etkisini göstermektedir.Siyah çizgi, toksik etkisi olmayan kontrol örneklerini temsil ederken, turuncu çizgi gösterilen toksinden etkilenen hücreleri temsil etmektedir. Burada, hücre içi protein için bir immünolojik analiz örneği yer almaktadır. GFP anti GFP antikorları yüzeye immobilize edilmiş ve hücreler lizedikten sonra, GFP proteinlerinin bağlanma kinetiği TIRF mikroskopisi kullanılarak görselleştirilmiştir.0,1 zamanı lizis tamponunun eklenmesini işaret eder; 0,2 zamanında GFP yüzeyde birikmeye başlar, bu da hücre lizisinin gerçekleştiği ve GFP'nin yüzeye difüze olduğu anlamına gelir. GFP'nin antikorlara bağlanması 0,3 zamanında tamamlanır. Bu son örnekte, serbest kalan GA DH yüzeydeki yakalama antikorlarına bağlanmış ve ardından HRP bağlı saptama antikorları eklenmiştir.Bağlanmamış tüm saptama antikorları yıkama ile uzaklaştırıldıktan sonra, saptama reaktifi eklenmiş ve reaksiyon zamana yayılmış şekilde gerçekleştirilmiştir. Burada, bu yöntem kullanılarak ölçülen U 9 37 ve HEC 2 93 hücreleri arasındaki eski hücre içi GA DH miktarının hayvan miktarları bazında bir karşılaştırması yer almaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan çiplerin nasıl hazırlanacağı, immünolojik analizleri mümkün kılmak için yüzeyin nasıl modifiye edileceği ve son olarak cihazın tek hücre analizi için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu yöntem, tek hücre biyolojisi alanındaki birçok tetikleyici sorunun yanıtlanmasına yardımcı olmak amacıyla kullanılabilir.

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Millifluidic Nanomalzemelere aygıtları, tepkime mekanizmaları ve sürekli akış kataliz zaman çözümlü bir analiz olarak kontrol edilen sentez için kullanılmaktadır.

Kimyasal Sentez ve Zaman-çözülmesi Mekanistiksel Çalışmaları Millifluidics

Biz DNA hibridizasyon tespiti için mikroakışkan tabanlı elektrokimyasal Bioçip sunuyoruz. SsDNA probu fonksiyonlandırmalar ardından, özgüllük, duyarlılık ve algılama limiti tamamlayıcı ve non-ssDNA hedefleri ile incelenmiştir. Sonuçlar 3.8 nM'lik bir algılama sınırı ile, elektro-kimyasal sistemine DNA hibridizasyonu olaylarının etkisini göstermektedir.

Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Biz indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICPMS) için ayrı bir damlacık örnek giriş sistemi sunuyoruz. Bu 90 ila 7000 Hz arası frekanslarda 40-60 um boyut aralığında yüksek tek dağılımlı damlacıklarını üreten ucuz ve tek kullanımlık mikroakışkan çip dayanmaktadır.

ICPMS Numune Giriş için mikroakışkan Chip

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Akışkan bileşenlerle entegre edilmiş mikro fabrikasyon cihazlar, in vivo mikro ortamı taklit eden hücre çalışmaları için in vitro bir platform sağlar. Tek veya bir arada bulunan kimyasal/elektriksel/kesme gerilimi uyaranları altında hücresel tepkileri incelemek için polimetilmetakrilat bazlı mikroakışkan çipler geliştirdik.

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Birden mikroakışkan kanallarda parçacıkların algılama ve boyutlandırma multipleks için, kod bölmeli çoklu erişim (CDMA) ile rezistif darbe algılama (RPS) birleştiren entegre bir yüzey elektrot ağı ile mikroakışkan platformu göstermektedir.

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Burada adresli damlacık microarrays (ADM'ler), bir damlacık array tabanlı yöntemi mutlak protein bolluk içinde tek hücreleri belirlemek mümkün mevcut. Biz heterojenite tümör baskılayıcı protein p53 bir insan kanser hücre satırı ifade derecesinin ADM'ler kapasitesini göstermek.

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Bu rapor, birden fazla hücrenin yüksek verimli eşleştirme ve mikroskobik analizinin sağlanabileceği tek bir hücre kültürü deneyi kurmak için mikroakışkan çip tabanlı bir yöntem tanımlanmaktadır.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Protokol, bireysel insan periferik kan mononükleer hücrelerinin sitokin sekresyon dinamiklerini kantitatif olarak ölçmek için gelişmiş bir mikroakışkan platformu tanımlar. Platform, örnek olarak lipopolisakkarit ile uyarılan her bir hücre için paralel olarak üç adede kadar sitokini (IL-6, TNFa ve IL-1β) ölçer.

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım 

Öğrenin tek hücre lizatlarını mikroakışkan çip kullanarak floresan veya immünoassay ile analiz etmeyi. Antikor kaplı odacıklarda hücreleri immobilize ederek proteinleri nicelendirin.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Daha fazla video keşfet