Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Aşağıdaki deneyin genel amacı, floresan veya immünolojik testler kullanarak tek hücre lizatlarını analiz etmektir. Bu, önce bir mikroakışkan cihaz oluşturularak ve iç haznenin antikorlarla kaplanmasıyla elde edilir. Daha sonra tek hücreler tuzaklarda hareketsiz hale getirilir ve ikinci bir adımda hücresel bir yanıtı uyarmak için çeşitli reaktiflere maruz bırakılır.

Halka şeklinde bir valf hızlı bir şekilde kapatılır ve lizis tamponu cihazdan geçirilir. Halka şeklindeki valf kısa bir süre için açılır ve hücreler mikro oda içinde parçalanır, bu da salınan proteinlerin küçük hacim nedeniyle yüksek konsantrasyonda antikorlara bağlanmasına izin verir. Daha sonra halka şeklindeki vana açılır.

Hazne yıkanır ve algılama reaktifleri kapalı mikro hazneye sokulur. Floresan yoğunluğunun artışı, bir floresan mikroskobu kullanılarak zaman içinde izlenir, sonuçlar, bu sistemin tek tek hücrelerden salınan bir ilgilenilen analiti kantitatif ve güvenilir bir şekilde tespit etme yeteneğini gösterir. Bu yöntem, tek A hücresi analizi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Özellikle, kimyasal ortamdaki değişikliklere hücresel tepki üzerine sistematik araştırmalar yaptı. Kimyasal uyaranın bir sonucu olarak hücre içi moleküllerin yukarı veya aşağı regülasyonlarını görebiliriz. Bu tekniğin iki ana avantajı vardır.

Birincisi, hareketsiz hücreleri sürekli veya periyodik olarak değişen tanımlanmış bir kimyasal ortama maruz bırakabilmemizdir. İkinci olarak, taşıma nedeniyle herhangi bir çapraz kontaminasyon veya analit kaybı olmadan satanın son derece hassas ve spesifik analizini yeniden düzenleyebiliriz. Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi üç farklı SU sekiz ana gofret üretin.

Biri akışkan katmanı oluşturmak için, biri kontrol katmanı için ve üçüncüsü mikro temas damgası için kullanılacaktır. Daha sonra, 10'a bir PDMS ve bir kürleme maddesi karışımının hazırlanmasıyla başlayarak mikroakışkan çipleri üretin. Her iki parçayı da kuvvetlice karıştırın ve çözeltiyi 30 dakika veya karışım kabarcıksız olana kadar gazdan arındırın.

Ardından, gofreti bir Petri kabının içindeki kontrol katmanına yerleştirin ve tabana bantlayın. Dört ila beş milimetre kalınlığında bir tabaka oluşturmak için üstüne yaklaşık 50 gram PDMS dökün ve PDMS'nin tam kürlenmesini sağlamak için gofreti en az iki saat boyunca 80 santigrat derecede bir fırına koyun. Mikro temaslı baskı gofret için aynı prosedürü tekrarlayın, ancak 50 yerine yaklaşık 20 gram PDMS kullanın, bu da dört ila beş milimetre kalınlığında bir PDMS tabakası elde etmenizi sağlar.

Alt katmanı hazırlamak için, mikroakışkan katmanla gofret üzerine 40 mikron yüksekliğinde bir PDMS katmanı sıkın. 60 saniye boyunca 2000 RPM dönüş hızı kullanarak. PDMS katmanını, tüm parçalar sertleştiğinde 80 santigrat derecede bir saat fırında kürleyin.

Kontrol katmanını gofretten çıkarın ve tıraş bıçağı yardımıyla parçalara ayırın. Daha sonra bir milimetrelik biyopsi delinmesi kullanarak basınç bağlantı deliklerini açın ve kanalları saklamak için bantla kapatın. Ardından, PDMS'yi mikro kontaklı baskı gofretinin üzerinden çıkarın ve hazne alanının büyüklüğünde pullar hazırlayın.

Kullanana kadar bir çekmecede tozdan arındırılmış olarak saklayın. Daha sonra spin kaplı gofret ve dört ila beş milimetre kalınlığındaki kontrol katmanını bir plazma temizleyiciye yerleştirin. 0,75 milibarda oksijen plazması kullanarak parçaları 18 watt'ta 45 saniye boyunca maruz bırakın.

Plazma işleminden sonra, her iki katmanı da mikroskop altında geniş bir çalışma mesafesi ile hızlı bir şekilde hizalayın. PDMS'nin yonga plakasından çıkarılmasını kolaylaştırmak için yerleştirilen üst parçaların etrafına bir miktar yedek PDMS ekleyin. Ardından gofreti en az bir saat boyunca 80 santigrat derecede bir fırına koyun.

Sertleştikten sonra, PDMS'yi gofretten dikkatlice çıkarmak ve mikroçipleri kesmek için bir neşter kullanın, 1.5 milimetrelik bir biyopsi delinmesi ile akışkan bağlantılar için erişim delikleri açın. Ek olarak, 200 mikrolitrelik bir pipet ucunun üst kısmını keserek ve bazı yedek yarı kürlenmiş PDMS kullanarak mikroçipte bir rezervuar oluşturun. Üstüne yapıştırın.

Daha sonra çipi fırında 80 santigrat derecede en az bir saat kürleyin. Bir cam sürgü ve PDMS parçalarını temizleyerek başlayın. Bir cam slaytı sabunla temizleyin.

Damıtılmış su ile durulayın ve ardından tekrar etanol ile durulayın. Bir nitrojen akışı kullanarak slaytı kurutun. PDMS'deki kalıntıları ve toz parçacıklarını temizlemek için bant kullanın.

Ardından PDMS parçasını ve temizlenmiş camı yerleştirin. Sıkı bir yapıştırma sağlamak için plazma temizleyiciye 18 watt'ta 45 saniye kaydırın, plazma işleminden sonra çipi beş dakika boyunca sıcak bir plakaya yerleştirin Yapıştırdıktan sonra, birkaç 200 mikrolitrelik pipet ucunun alt kısmını kesin. Bunları %4 BSA içeren 10 ila 15 mikrolitre filtrelenmiş PBS ile doldurun ve cihazın girişlerine yerleştirin.

Daha sonra 10 ila 15 mikrolitre PBS eklenmiş kesilmiş uçları kullanın ve bunları kontrol kanallarına koyun. Ardından, çipleri santrifüje yerleştirin ve kanalları sıvı ile doldurmak için beş dakika boyunca yerçekiminin 800 katı kadar döndürün. Kanallardan herhangi birinde hava kalırsa, kanallar tamamen dolana kadar bu adımı tekrarlayın.

Engelleme çözeltisini oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin. Daha sonra çözeltiyi sıvı tabakasından PBS ile dakikada 10 mikrolitre akış hızında yıkayın. Bir şırınga pompası kullanarak, cihaz artık hücre deneyleri için hücre deneylerine hazırdır: immünolojik testler için cam slaytı önceden yazdırmak, PDMS mikro temaslı baskı pullarını temiz bir Petri kabında %0,5 biyotinile BSA ile inkübe etmek.

Yarım saat sonra, pulları damıtılmış suyla iyice ve hızlı bir şekilde temizleyin ve damgayı bir nitrojen akışı altında kurutun. Kuruduktan sonra, desenli biyotinile BSA'yı biriktirmek için pulları hızlı bir şekilde temizlenmiş bir cam slayta yerleştirin. Yerleştirdikten sonra damgayı hareket ettirmeyin ve damganın cam sürgü ile temas halinde olup olmadığını kontrol edin.

Hafifçe değilse, damgaya dokunun, ancak sertçe bastırmayın. Daha sonra damgayı mikroakışkan çipin üst kısmı ile birlikte plazma odasına yerleştirin ve 45 saniye boyunca 18 watt'ta oksijen plazmasına maruz bırakın. Plazma işleminden sonra, damgayı cam slayttan çıkarın.

Yüzeyde nefes almak, deseni görünür kılacaktır. Mikro bölmeleri yazdırılan yüzeyin üzerine hizalayın. Hizalandıktan sonra, kalan yüzeyi bloke etmek için çipi 30 dakika boyunca 50 santigrat derecede sıcak bir plakaya yerleştirin, daha önce gösterildiği gibi bir santrifüj ile çipe PBS'de% 4 steril filtrelenmiş bir BSA çözeltisi ekleyin, mikroçipi en az 30 dakika inkübe edin ve ardından çözeltiyi dakikada 10 mikrolitrelik bir akış hızında PBS ile sıvı tabakasından yıkayın.

Bir şırınga pompası kullanarak, çipi doğrudan kullanın veya nemli bir kutuda dört santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın. Ardından, PBS'deki avadon'u rezervuara sokarak tamamen işlevsel bir bağlama yüzeyi oluşturun. Avadon'u daha sonra sıvı kanallarından çekmek için çözeltiyi akıtan.

Rezervuarı iyice durulayın ve kanalları PBS ile yıkayın. Daha sonra rezervuara protein G ekleyin ve kanallardan çekin. Rezervuarı ve çipi PBS ile durulayarak fazla protein G'yi yıkayın.

Daha sonra, ilgilenilen antikoru rezervuara ekleyin ve kanallardan akıtın. Ardından, kanalları PBS ile floresan olarak yıkamadan önce bağlanmaya izin vermek için akışı durdurun, hücreleri kanallara sokmadan önce baskı işleminin kalitesini kontrol etmek için etiketli analoglar kullanılabilir. Burada gösterilen HE 2 9 3 hücreleri gibi yapışmış hücreleri enzim içermeyen ayrışma tamponu kullanarak hasat edin ve ardından filtrelendikten sonra hücre kümelerinin sayısını azaltmak için süzün, bunları bir şırıngaya yükleyin.

Mililitrede 300.000 hücrede, şırınga pompasında ileri akış kullanarak hücreleri çip üzerine yükleyin, yaklaşık üç dakika boyunca dakikada 10 ila 20 mikrolitre hızında yapışkan hücreler için tuzaklar doldurulduğunda hücrelerin spesifik olmayan yapışmasını önlemek için, üst tabakayı üç çubukla basınçlandırarak odaları kapatın. Daha sonra odaları bir mikroskop kullanarak inceleyin. Birçok hücrenin odacıkların içindeki yüzeye özel olarak yapışmamış olduğu tespit edilirse, bunları hızlı bir şekilde açın ve dakikada 10 ila 30 mikrolitre akış hızında hücre ayrışma tamponu ile yıkamaya çalışın.

Glikoz altı fosfat dehidrojenaz veya G altı PDH testi için, bir lizis tamponuna iki milimolar glikoz, altı fosfat 0.5 milimolar ve mililitre DIA dizileri başına bir DP 0.5 birimi ve 0.3 milimolar RIN ekleyin ve iyice karıştırıldığından emin olun. Kanallar temizlendikten sonra, G six PDH lizis tamponunu dakikada 30 mikrolitrelik bir akış hızında çipten çekin. Lizis tamponu akarken, odaları hızlı bir şekilde açın ve kapatın, lizis kinetik reaksiyonu izlemeye başladıktan hemen sonra lizisin odaya girmesine izin vermek için 500 milisaniye açık bırakın.

Bu örnekte, bir floresan ürün zaman içinde izlenebilir. Burada, turuncu gıda boyası ile doldurulmuş ve daha sonra mikro odacıkların üzerindeki kontrol katmanına basınç uygulanarak kapatılmış bir dizi oda gösterilmektedir. Hazne kapatıldıktan sonra, haznelerin sıkılığını göstermek için yeşil gıda boyası kanallardan durulandı.

Her oda, lys hücrelerinden salınan moleküllerin konsantrasyonunu analiz için yeterince yüksek tutan sadece 625 pikolitre sıvıdan oluşan bir hacim içerir. Ayrıca vanalar, hazneler arasındaki çapraz kontaminasyonu ortadan kaldıracak şekilde açılıp kapatılabilir. Bu odacıklar içinde, tek bir PMA ile aktive edilmiş U9 37 hücresinden salınan lizozom miktarı gibi analitleri ölçmek mümkündür, çünkü oda içinde bir floresan molekülünün üretimini enzimatik olarak katalize eder.

Yeşil çizgiler, bir hücre tarafından işgal edilen odalar için zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişimi temsil eder. Ayrıca, siyah noktalı çizgi ile temsil edilen hücresiz bir oda için floresan yoğunluğu da gösterilmiştir. Karşılaştırma için, bu test, hücre içi bir enzim G six PDH'yi ölçerek toksik bir molekülün zar bütünlüğü üzerindeki etkisini gösterir.

Siyah çizgi, toksik etkisi olmayan kontrol örneklerini temsil ederken, turuncu çizgi, gösterilen toksinden etkilenen hücreleri temsil eder. İşte hücre içi protein için bir immünolojik test örneği. GFP anti GFP antikorları yüzeyde hareketsiz hale getirildi ve hücreler parçalandıktan sonra, GFP proteinlerinin bağlanma kinetiği çim mikroskobu kullanılarak görüntülendi.

0.1 zamanı, 0.2 GFP'nin yüzeyde birikmeye başladığı zaman lizis tamponunun girişini işaret eder, bu da hücre lizizinin meydana geldiği ve GFP'nin yüzeye yayıldığı anlamına gelir. GFP'nin antikorlara bağlanması 0.3 zamanında tamamlanır. Bu son örnekte, yüzeydeki antikorları yakalamak için serbest bırakılmış GA DH ve daha sonra HRP bağlantılı tespit antikorları eklendi.

Tüm bağlı olmayan tespit antikorları yıkandıktan sonra, tespit reaktifi tanıtıldı ve reaksiyon zamanla sona erdi. Bu yöntem kullanılarak ölçülen U 9 37 ve HEC 2 93 hücreleri arasındaki hayvan miktarlarında daha önce hücre içi GA DH miktarının bir karşılaştırması aşağıda verilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan çiplerin nasıl hazırlanacağını, immünolojik testleri etkinleştirmek için yüzeyin nasıl değiştirileceğini ve son olarak cihazın tek bir hücre analizi için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu yöntem, tek hücre biyolojisi alanındaki birçok tetikleyici soruyu yanıtlamaya yardımcı olmak için kullanılabilir.