Için optimize Protokoller

Bu çalışmanın amacı, nude farelere enjekte edilmek üzere yüksek canlılığa sahip bir mikobakteriyum lipid süspansiyonunun nasıl hazırlanacağını göstermektir. Enfeksiyonun tercihen erken evresindeki enfekte bir fareden temel yaşam materyali elde edeceğiz.

Yüksek canlılıkta ari verim sağlamak için, hayvanı biyolojik güvenlik kabini içerisinde sakrifiye edin. Arka nabzı hemostatik pensle tutun. Onları nöbetlerle kesin ve 2%Iodine içine 20 dakika boyunca daldırın. Dekontaminasyon için, ayak pedi yukarı bakacak şekilde nokta pozisyonunu tutun.

Yumuşak dokuyu toplayın. Dokunun homojenizasyonunu kolaylaştırmak için bir skapel bıçağı kullanarak birinci ve beşinci falanj kemiklerini çıkarın. Dokuyu steril bir Petri kabına yerleştirin. Epidermisi sıyırarak temizleyin.

Granülomatöz dokuyu makasla küçük parçalara ayırın ve doku verim programının daha sonraki hesaplamaları için bekletin. Küçük parçaları bir ml Hank's dengeli tuz çözeltisi içeren bir tüpe aktarın. Bir ml daha Hank's çözeltisi ekleyin ve dokuyu hız dörtte, her biri 15 saniye sürecek şekilde üç kez homojenize edin.

Bir hücre süzgecini 50 ml'lik steril konik tüpün içine yerleştirin. Süspansiyonu süzgecin üzerine pipetleyin ve çözeltinin yerçekimi ile geçmesini bekleyin. Kalıntıları gidermek için süspansiyona iki mL daha hanks ekleyin ve tekrar homojenize edin.

Aynı döngüyü kullanarak, süspansiyonu bu süzgeçten geçirin. Süzgeci hanks ekleyerek durulayın. Süspansiyonun toplam hacmini 9 ml'ye tamamlamak için, yaklaşık %0,05 final konsantrasyonuna ulaşacak şekilde süspansiyona 1 ml %0,5 tripsin solüsyonu ekleyin.

Tüpü nazikçe ters çevirerek karıştırın ve 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, steril salin ekleyerek süspansiyon hacmini 4 mL'ye tamamlayın; 4 °C'de 1700 ×g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı dökün ve tüpe vurarak pelletini yeniden süspanse edin. 1 mL sero salin ekleyin ve karıştırın.

Süspansiyonu yeni bir tüpe aktarın. Süspansiyonu yeni bir tüpe aktarırken, 26 gauge iğneye sahip bir ml'lik bir insülin şırıngası kullanarak vasküler süspansiyonu homojenize edin. Süspansiyondan ikişer damlayı 18 medium ve seven H nine brain heart infusion besiyerlerine yerleştirerek süspansiyonun mikrobiyolojik kontrolünü gerçekleştirin.

11 Stein Genesen 37 °C'de inkübe edildi. Ardından rutin mikrobiyolojik kontrol prosedürleri uygulandı. Kod Z boyaması için.

S süspansiyonunun salin içerisinde 1/10 ve 1/100'lük dilüsyonlarını hazırlayın. Sayım için lamları hazırlamadan önce her bir dilüsyonu homojenize edin; kalıcı bir mürekkep markeri kullanarak her lamın yüzeyine 10 mm iç çapta üç daire çizerek üç lam hazırlayın.

Şimdi daireleri immünohistokimya kalemi ile çevreleyin. Bu lamları iki numaralı kurşun kalem kullanarak etiketleyin; üç farklı konsantrasyon için lamları hazırlayın: Seyreltilmemiş, 1/10 ve 1/100.

Her bir daireye beş µL fenol serum çözeltisi ve 10 µL sary süspansiyonu pipetleyin, homojenleştirin ve süspansiyonu dairenin tüm alanına eşit şekilde yayın. Tek kullanımlık bir özenin sapını kullanarak, kuruma işlemi sonrası bunları düz bir masa üzerine yerleştirin. Süspansiyonlar yukarı bakacak şekilde, bunları üç kez mavi alev üzerinden geçirerek sabitleyin.

Bir kod Zuni sürdürülebilirliği gerçekleştirin. Bu lamları inceleyin. Üç dilüsyon.

Sayımdaki en uygun dilüsyonu seçin. Vasküler süspansiyonu 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklavlayarak 200 µL öldürülmüş sary süspansiyonu hazırlayın. Mikrobakteriyel lipidlerin floresan boyaması için L 7 0 0 7 canlı ölü arka ışık bakteriyel viabilite kitini kullanın.

Çözelti A'dan 1:10 dilüsyon ve çözelti B'den 1:20 dilüsyon hazırlayın. Kullanımdan hemen önce; orijinal ve öldürülmüş seyreltilmemiş vasküler süspansiyonun her 200 µL'sine, seyreltilmiş çözelti A'dan 3,6 µL ve seyreltilmiş çözelti B'den 6 µL ekleyin. Karanlıkta 15 dakika inkübasyonun ardından, süspansiyonu 4 °C'de, 10.600 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı pipet yardımıyla uzaklaştırın.

Peleti 50 µL %10 Gliserol içerisinde süspande edin ve pipetleme yaparak homojen hale getirin. Her süspansiyondan sekiz µL'yi bir lam üzerine yerleştirin ve küçük bir lamel ile kapatın. Işıktan koruyun.

Süspansiyonları floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Mililitrede 10^7 BA lip konsantrasyonuna sahip süspansiyon hazırlayın; her bir kriyoviyale bir ml dondurma medyumu koyun. Ardından, bir ml dondurma medyumu içerisine 150 µL S süspansiyonu ekleyin ve tüpü tersyüz ederek homojen hale getirin.

Kriyo tüpü dondurma kabının içine yerleştirin. Kabı en az 24 saat boyunca -80 °C'de tutun. Tüpleri bir saklama kutusuna aktarın ve çözdürme işlemi için -80 °C'de muhafaza edin.

Dondurulmuş süspansiyonu 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda çözdürün. Süspansiyonu, 20 mL steril salin içeren bir konik tüpe aktarın. Konsantre etmek için santrifüjleyin.

Baline için sayım amacıyla Z sürdürülebilirliği protokolü ve canlılık belirleme amacıyla floresan boyama protokolü takip edildi. Her öğün için 10 ila 8 BA içeren süspansiyon hazırlayın ve her hayvanı inoküle etmeden önce süspansiyonu homojenleştirin. Bir insülin şırıngasına 100 µL çekin ve canlılık belirlemesindeki her hayvanın arka ayak pedlerine 30 µL inoküle edin.

Tüm BAI'larda yeşil floresan, sadece o bai'de ise kırmızı floresan gözlemlenir. Bu BAI'lar steril kontrol olduğunda, yeşil ve kırmızı BAI ışığının aynı yoğunlukta olduğu görülür. Farklı süreler boyunca dondurulmuş M Lepar inokülasyonu, yedi ay sonra geri kazanılan BAI sayısında 10 ila 1000 kat artış sağlar.

Son bir not olarak, IL leid in vitro ortamda büyümediği için, bu protokolün canlı yl Leid'in laboratuvarda ilerideki kullanımlar için hazır tutulmasının hızlı ve kolay bir yolunu sağladığını eklemek isteriz.