Name: Için optimize Protokoller Mycobacterium leprae Gerilme Yönetimi: Atimik Çıplak Farelerde Dondurulmuş Hazır Koruma ve Bakım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Öğrenin Mycobacterium leprae için hazırlama ve koruma yöntemlerini; canlı süspansiyon oluşturma, dondurma-çözme ve athymic çıplak farelerde bakım protokollerini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz teknik yardım için Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro ve Cláudia PM Carvalho teşekkür ederim. Biz hayvan tesis kurulmasını desteklemek için Pranab K. Das teşekkür ederim. Biz yazının gözden geçirilmesi için Lais RR Costa teşekkür ederim. Bu çalışma Fundação Paulista kontra Hanseníase ve pesquisa à Fundação de Amparo hibe tarafından desteklenmiştir Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5) yapmak.

1.. Mycobacterium leprae Süspansiyonunun Hazırlanması <ol><li> Atimik çıplak fare (NU-Foxn1 nu) ötenazi önce, Tripsin çözeltisi ve kültür ortamı hazırlar (reaktiflerin Protocol - Protokoller 1, 2 ve 3). Çıplak farelere M. ile 4-5 ay sonra aşılama Euthanize lepra Hayvanların ötanazi AVMA İlkelerine göre: 2013 Edition 10 (hayvanların görüntüleri deneyler ve kullanım onaylı ve Faculdade de Odontología de Bauru, USP Hayvan Bakım Komitesi kurallarına uygun olarak yapılmıştır). % 70 etanol alkol ile tüm fare temizlemek, hayvanlar taşıma için kullanılan bir biyolojik güvenlik kabini içinde. </li><li> Tarsal eklem distalinde hemostatik forseps kullanarak arka pençe tutun. Forseps altında makas ile pençe kesin ve 20 dakika boyunca 2% iyot pençe bırakın. Ardından, diğer arka pençe için prosedürü tekrarlayın. </li><li> Bir için pençeleri transferfazla çalışma için temiz biyolojik güvenlik kabini. ,% 2 iyot üzerinden pençelerini steril gazlı bez ile kurulayın ve ardından kemiğe yakın tüm yumuşak doku (dermis, epidermis tendonlar ve sinirler) kaldırarak, sayı 22 veya 23 neşter bıçak kullanarak iki ayak pedleri toplamak. Metatarsalların kemikleri ve 1 ve 5. parmak kemikleri çıkarın. Steril bir Petri tabağına yerleştirin malzeme ve bisturi bıçağı ile kazınmasıyla, epidermis çıkarın. Makasla küçük parçalar halinde doku kesilir ve yuvarlak alt tüp aktarabilirsiniz. Ağırlık doku ve Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 1 ml. Numunenin ısınma önlemek için buz üzerinde tüp tutun. </li><li> HBSS başka bir 1 ml ilave edilir ve bir doku homojenleştirici kullanılarak örnek homojenleştirin. <ol><li> İlk homojenizasyon döngüsü: hız 4 (14,450 rpm) 15 saniye 3 bakliyat. </li><li> Kalan enkaz ortadan kaldırmak için bir hücre süzgecinden geçirmeden, steril bir 50 ml konik bir tüp süpernatantı aktarın. Çözüm gra geçmesine izinvity. </li><li> HBSS&#39;nin ek 2 ml ekleyin ve homojenizasyon döngüsü (Bölüm 1.4.1) tekrar ve tekrar hücre süzgecinden örnekleri geçmektedir. </li><li> 9 ml hacim getirmek için HBSS ekleyerek süzgeç durulayın. Hücre süzgeç atın. </li></ol></li><li> % 0.5 tripsin çözeltisi bir kısım çözülme. A bir nihai konsantrasyonu,% 0.05 tripsin elde edilmesi için hücre süspansiyonu 9 ml tripsin 1 ml ilave edilir. Kalan çözülmüş tripsin atın. Bir 37 ° C su banyosu içinde 60 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tripsin sulandırmak için steril tuzlu su eklenmesi ile 40 ml hacmi getirmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 1700 x g&#39;de santrifüje </li><li> Dikkatli Tersine tüp süpernatant atın. Tüpü dokunarak pelletini ve daha sonra steril tuz 1 ml. Süspansiyonun (doku verim / gram hesaplamak için) ve son hacim ölçen yeni bir konik tüp süspansiyon aktarın. </li><li> 1 m kullanarak basil süspansiyon homojenleştirinizbir 26 G iğne ile l insülin şırınga yeni bir tüpe transfer süspansiyon ise. </li><li> Her bir ortamda bunu 2 damla (50 ul) yerleştirilmesi ile süspansiyondan mikrobiyolojik kontrol yapın: 7H9 ve Lowenstein-Jensen, orta ve mikobakteriler kirletici tespiti için, 30 gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Benzer şekilde, bir Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) inoküle orta ve aerobik bakteriler kirletici saptanması için, 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Boyama için tüpler içine süspansiyon tümbölen: Soğuk Ziehl-Neelsen boyama (Protokol 2) için 35 ul ve canlılığı belirlenmesi (Protokolü 3) 200 ul. </li><li> Ziehl-Neelsen boyama (ZN) sonra, asit dirençli basil / ml (AFB / ml) sayısını hesaplamak. Çıplak fareler aşılaması için, 1 x 10 8 AFB / ml süspansiyon hazırlamak; 30 ul / haydut / hayvan (Protokol 5) aşılamak için yeterli hacme sahip emin olun, ve aşılama kadar süspansiyon soğuk tutmak. Dondurma için, 1 x 10 7 AFB / ml sus hazırlamakemeklilik (Protokolü 4). </li></ol> 2. Soğuk Ziehl-Neelsen Boyama <ol><li> Boyama başlamadan önce, serum / fenol çözeltisi ve ZN boyama çözüm hazırlanması (reaktiflerin Protocol - Protokoller 4 ve 5). Bir immünhistokimya kalem kullanarak üç cam slaytlar üzerine üç daire (iç çapı 10 mm) çizin. (1) normal veya sulandırılmamış, (2) 1:10, ve (3) 1:100 sayı 2 kalem (Not: bazı grafit ZN boyama sonra kapalı kaybolur) kullanılarak: slaytlar tanımlayın. </li><li> 01:10 ve 1:100 seri seyreltileri için basil süspansiyonu (1,10 Aşama) seyreltin, yani seyreltilmemiş süspansiyonunun 5 ul ve 45 ul tuzlu su eklemek, daha sonra 01:10 5 ul almak ve tuzlu su için 45 ul ekle. </li><li> Serum / fenol çözeltisi 5 ul ve daire başına basil süspansiyonu 10 ul ekle. Homojenize ve atılabilir bir döngünün saplı dairenin alanı çevresinde yayılır. Süspansiyon bir tesviye masaya kuruması için bekleyin. </li><li> Gün sonrarying, bir Bunsen beki (yaklaşık 20 sn toplam) 11 mavi ateşte slayt 3 kez geçirerek smear düzeltmek. </li><li> Boyama için, 20 dakika boyunca, süzüldü Ziehl-Neelsen carbofuchsine (yaklaşık 5 mi) ile sürgünün tüm yüzeyini kapsamaktadır. </li><li> Su (yavaş akım) çalışan slayt durulayın. </li><li> 20 saniye için% 10 asit ile alkol solüsyonu slayt örtün. </li><li> Akan su içinde yeniden slayt yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca bir metilen mavisi çözeltisi ile slayt örtün. </li><li> Akar su slayt durulayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Bir 100X immersiyon yağı hedefi kullanılarak 20 alan / daire (toplam 60 alan / slayt) saymak. Aşağıdaki gibi asit hızlı basil / ml (AFB / ml) &#39;nin hesaplanması için 12 Lepra Laboratory Techniques in açıklamasına göre yapılır: AFB / alan = 60 bölü 3 çevrelerinde (60 alanlar) bulunan basil sayısı. AFB / ml = AFB / alan x sabit dairenin (bölgex 100) objektif lens açıklığı alanına bölünmesi ve seyreltilmiş bir süspansiyon sayımı kullanılırsa, seyreltme faktörü (10 veya 100) ile AFB / ml sayısını çarpın. </li></ol> 3. Canlılık Belirlenmesi <ol><li> Başlamadan önce, otoklav M. hazırlamak lepra süspansiyon (reaktiflerin Protokol - Protokol 7). M. kalitatif tayini için uygun kiti (reaktifler ve ekipman tabloya bakınız) kullanın süspansiyon içinde leprae mevcudiyetini göstermektedir. Aşağıdaki gibi (tüm işlemler loş ışık altında yapılmalıdır) seyreltilmiş solüsyonları,:, tuzlu su içinde 10 kat (1 ul stok artı 9 ul tuzlu su) çözeltisi ile seyreltik tuzlu su içinde bir faktör ile B solüsyonu 20 seyreltilmiş (1 ul stok ayrıca 19 ul tuzlu su). </li><li> Test edilecek olan basil süspansiyon (aşama 1.10) 200 ul seyreltilmiş çözelti A 3.6 ul seyreltilmiş ve çözelti B 6 ul ekleyin. Önceden otoklavlanmış M. leprae rutin bir süspansiyon olarak kullanılırgeçerlilik boyaması için egative kontrolü. </li><li> Karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin süspansiyonlar. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 10,600 x g&#39;de santrifüje tüp </li><li> Süpernatant atılır ve% 10 gliserol içinde 15 ul pelletini. Temiz bir cam slayt yüzeyine 8 ul uygulayın ve küçük bir kapak kayma ile örtün. (Moleküler Problar öneriler bakınız) uygun filtreler içeren bir floresan mikroskop kullanılarak slayt analiz edin. Iyodür (PI) boyama Propidium için boyama Syto 9 (Sy) karşılaştırarak sonuçlarını değerlendirin. Not: Sy leke hem de ölü ve canlı bakterilerin% 100 nüfuz ve PI leke hasarlı zarları ile sadece bakterileri nüfuz eder. Süspansiyon otoklav (negatif kontrol) hücre enkaz varlığı nedeniyle bakteri kümeleri oluşabilir. Ölü / canlı değerlendirilmesi için kullanılan yarı-kantitatif cetvel 0 ila 2 arasında değişir +, 0, hücrelerin en az% 30 PI boyama için pozitif olduğunu göstermektedir; 1 + 30 arasında demektir -Hücrelerin% 50 PI leke için pozitif olan, 2 + hücrelerin% 50&#39;den fazla PI boyama için pozitif olduğu anlamına gelir. 0 puan kullanım için, en uygun olarak kabul edilir. </li></ol> 4. Donma / çözülme M. lepra Süspansiyon <ol><li> Başlamadan önce, dondurma orta (- Protokol 6 reaktiflerin Protokolü) hazırlar. Dondurma için, aşağıda açıklanan adımları kullanın: <ol><li> Ihtiva eden bir süspansiyon, 150 ul 1 x 10 7 orta dondurma 1 ml ile birlikte steril cryovial ml AFB /. </li><li> Dondurucu bir kap içinde cryovial koyun ve 24 saat boyunca -80 ° C &#39;de kabı saklayın. </li><li> Bir saklama kutusu için dondurulmuş flakon aktarın ve -80 ° C&#39;de saklayın </li></ol></li><li> Çözündürmek için, aşağıda açıklanan adımları kullanın: <ol><li> -80 ° C donmuş süspansiyon ile dondurarak saklamaya uygun vialler çıkarın ve süspansiyonun çözülmesi başlatmak için bir 37 ° C su banyosu içine koyun. </li><li> Steril 20 ml tüp ihtiva eden bir süspansiyon içine döküntuzlu su. Çözülme tamamlanıncaya kadar yavaşça süspansiyon karıştırın. </li><li> 4 ° C&#39;de, 1,700 x g, 30 dakika boyunca bir süspansiyon santrifüj </li><li> Süpernatantı atın ve istenilen hacme ulaşmak için yeterli steril tuzlu su ekleyin. Bir şırıngaya (aşama 1,8) geçirilerek süspansiyon homojenize. </li><li> ZN boyama, canlılık tespiti ve aşılama için, Protokolleri 2, 3 ve 5 izleyin. </li></ol></li></ol> 5. Fare aşılama <ol><li> İki kişi bu işlem için gerekli olan, bir inokulum yönetmek için fare ve başka dizginlemek için. Inoküle edilecek hayvan etik kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak ele alınmalıdır ve bütün prosedürler, kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış olmalıdır. Pençeleri yukarı bakacak şekilde boynun ense tarafından çıplak fare kısıtlamaktadır. </li><li> Bir 26 G iğne içinden geçirilerek süspansiyon homojenize. İnoküla için 1 ml şırınga ile, aspire yeterli basilli süspansiyonte, iki ayak tabanları (30 ul / ayak tabanı). </li><li> , Arka pençe tutun enjeksiyondan önce% 70 etanol alkol ile ayak desteği temizlemek ve iğne konik iğne intradermal tanıtmak proksimal patinin uzak tarafına, işaret etti. Süspansiyonun 30 ul enjekte edilir. Enjeksiyon ayak tabanı, anestezi uygulanmış farelerde gerçekleştirilebilir. </li><li> Inokulum reflü önlemek için deriden iğne çekilmeden önce 5 saniye bekleyin. Fareler yumuşak yataklar Aşıdan üzerinde muhafaza edilmelidir ve ambulasyon ve kendini yaralama işaretler izlenmelidir. </li></ol>

<ol><li>Saúde, M. inistérioda, Brasil, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretaria+de+Vigil%C3%A2ncia+em+Sa%C3%BAde%3A+situa%C3%A7%C3%A3o+epidemiol%C3%B3gica+da+hansen%C3%ADase+no+Brasil.+Informe+epidemiol%C3%B3gico+2008%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Secretaria de Vigilância em Saúde: situação epidemiológica da hanseníase no Brasil. Informe epidemiológico 2008.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Scollard, D. M., Adams, L. B., Gillis, T. P., Krahenbuhl, J. L., Truman, R. W., Williams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continuing+challenges+of+leprosy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The continuing challenges of leprosy.</a> Clin. Microbiol. Rev. 19 (2), 338-381 (2006).</li>
<li>Rosa, P. S., Belone, A. deF., Lauris, J. R., Soares, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-needle+aspiration+may+replace+skin+biopsy+for+the+collection+of+material+for+experimental+infection+of+mice+with+Mycobacterium+leprae+and+Lacazia+loboi%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Fine-needle aspiration may replace skin biopsy for the collection of material for experimental infection of mice with Mycobacterium leprae and Lacazia loboi.</a> Int. J. Infect. Dis. 14, 49-53 (2010).</li>
<li>Truman, R. W., Krahenbuhl, J. L. V. iableM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((leprae+as+a+research+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Lepr.+Other+Mycobact.+Dis%22%5BJournal%5D)">leprae as a research reagent.</a> Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 69 (1), 1-12 (2001).</li>
<li>Levy, L., Ji, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+foot-pad+technique+for+cultivation+of+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22Lepr.+Rev%22%5BJournal%5D)">The mouse foot-pad technique for cultivation of Mycobacterium leprae.</a> Lepr. Rev. 77 (1), 5-24 (2006).</li>
<li>Lahiri, R., Randhawa, B., Krahenbuhl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+viability-staining+method+for+Mycobacterium+leprae+derived+from+the+athymic+%28nu%2Fnu%29+mouse+foot+pad%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of a viability-staining method for Mycobacterium leprae derived from the athymic (nu/nu) mouse foot pad.</a> J. Med. Microbiol. 54 (3), 235-242 (2005).</li>
<li>Katoch, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contemporary+relevance+of+the+mouse+foot+pad+model+for+cultivating%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The contemporary relevance of the mouse foot pad model for cultivating.</a> 80 (2), 2-120 (2009).</li>
<li>Colston, M. J., Hilson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+freezing+and+storage+in+liquid+nitrogen+on+the+viability+and+growth+of+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of freezing and storage in liquid nitrogen on the viability and growth of Mycobacterium leprae.</a> J. Med. Microbiol. 12 (1), 1-137 (1979).</li>
<li>Portaels, F., Fissette, K., De Ridder, K., Macedo, P. M., De Muynck, A., Silva, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+freezing+and+thawing+on+the+viability+and+the+ultrastructure+of+in+vivo+grown+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Lepr.+Other+Mycobact.+Dis%22%5BJournal%5D)">Effects of freezing and thawing on the viability and the ultrastructure of in vivo grown mycobacteria.</a> Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 56 (4), 580-587 (1988).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+Veterinary+Medical+Association%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22%5BJournal%5D)">American Veterinary Medical Association.</a> AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Edition. Schaumburg, Illinois, USA, https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf. 1-102 (2013).</li>
<li>Saúde, M. inistérioda, Brasil, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guia+de+procedimentos+t%C3%A9cnicos+-+Baciloscopia+em+hansen%C3%ADase%2C+S%C3%A9rie+A%3A+Normas+e+manuais+t%C3%A9cnicos%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Guia de procedimentos técnicos - Baciloscopia em hanseníase, Série A: Normas e manuais técnicos.</a> , (2010).</li>
<li>Health Organization, W. orld, Geneva, , Laboratory techniques for leprosy Forthcoming.</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

M. yayılması için iyi gösterildiği üzere, başarılı bir protokol ayrıntılı bir açıklaması leprae büyük ölçüde gereklidir. Bu çalışma, süzme ve tripsin emdirme ile aşı hazırlama protokol uygulanması gibi (+ 0 puan) çok az hücre kalıntıları ve basil yüksek canlılığı ile elde edilmesini sağlar göstermektedir. Sodyum hidroksit basili 6 saflaştırılması için doku parçalamak için kullanılmıştır. M. saflaştırılması için sodyum hidroksit kullanılarak laboratuvarımızda yapılan çalışmalarda leprae canlılığı belirlenmesi ve hayvan aşılama (veriler gösterilmemiştir) için süspansiyonun homojenizasyon engelleyici, basil kümeleri oluşumu ile sonuçlanmıştır. Filtrasyon ve tripsin emdirme ile aşılama hazırlanması ile karşılaşılan potansiyel problemler, bakteriyel veya mantar maddeleri ile inokulum hücre döküntüleri ve kirlenme büyük miktarda bulunur. Durumda, hücre Debr büyük miktarlardasaflaştırmadan sonra gözlenen, ya da tripsin artık aktif ya da biyolojik bir malzeme fazla miktarda var olmasıdır. Tripsin stok çözeltisi enzimatik aktivitesi değerlendirilmelidir. Ilk biyolojik maddenin aşırı miktarda şüphelenildiğinde, malzeme kısma bölünmüş olmalıdır ve protokol ayrı gruplar halinde yapılmalıdır. Bakteriyel veya fungal ajanlarla inokulum kirlenmesini önlemek için, bakım aseptik şartlar altında malzemeyi işlemek için alınmalıdır. Mantar ve / veya bakteriyel kontaminasyon algılanırsa, süspansiyon atılmalıdır. Bizim protokol bir sınırlama anlatılan yarı-nicel bir yöntem kullanarak canlılığı değerlendirme öznellik olduğunu. Yayımlanmış kantitatif 6 daha az hassas olsa da, yarı-nicel değerlendirildi Canlılık, daha pratiktir. 0 + ve 1 + Canlılık puan yayılması ve donma bakımı için tatminkarM. leprae. Lahiri et al. önceden% 80-90 uygun inokulum ile aşılanır çıplak fareler, aşılamadan 4-5 aylıkken (yüksek canlılığı basili) hasat edilmesi için uygun olan ayak yastıklarından neden olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, (4 aylıkken) erken enfeksiyon iyi hasat zamanı. Dondurulmuş inoculum hasat için, mevcut protokolde fareler büyüme eğrileri garanti uzun süre (7 ay) Aşılanan korundu. Yeterli canlılığı sağlamak için kritik bir safha, tercih edilen ana ve işleme biyolojik maddenin toplanmasından sonra 24 saat içinde, taze basili süspansiyonların kullanılmasıdır. Ayrıca, reaktifler kalitesi, taze hazırlanmış seyreltilmiş tripsin ve canlılığı boyama çözeltiler, yeniden üretilebilir sonuçlar garanti etmek için gereklidir. Bu protokolün diğer bir sınırlama olduğu kesin M. lepra süspansiyon konak DNA, RNA, protein, vb özgür değildir. Bu nedenle, diğer saflaştırma adımları t eklenmelidiro M. elde lepra süspansiyon konakçı hücre bileşenlerinin ücretsiz. M. bütün doku örnekleri dondurma ile uygun bir basili muhafaza edilmesi için bir yöntem leprae lezyonlar 9 bildirilmiştir. Ancak, Portaels ve arkadaşları tarafından çalışma. donma ve M. çözülmeden sonra 65-97% arasında değişen canlılığı ortaya önemli bir kayıp lepra armadillo 9 elde edilen doku örnekleri bulaşmış. Bizim protokol göstermiştir ki, M. gözlenen canlılık indeksi (Tablo 1) dondurulmuş olmasaydı kana göre donma ve erime sonrasında leprae süspansiyonlar düştü. Gerçekten de, M. dondurma donma medyada lepra süspansiyon değişen canlılığı vermiştir canlılığı skoru 1 + ile% 50-70, canlılık skoru 0 + donmamış süspansiyon elde iken gelen. Bununla birlikte, M. çarpma lepra (çıplak farelerin 7 ay Aşıdan sonra tatmin oldu <strong&gt; Tablo 1). Sulandırılan numuneler ile çıplak farelerin aşı ortalama 100 kat başlangıç ​​inokulum ile karşılaştırıldığında basilinin sayısındaki artış ile sonuçlanmıştır 60 gün boyunca donmuş olarak muhafaza. Öyle görünüyor ki M. dondurma Bunun yerine, enfeksiyon oluşmuş doku örneklerinin dondurma ortamı içinde süspansiyon leprae, daha etkilidir. Bizim protokol kritik bir safha, Colston ve Hilson 8 ile gösterildiği gibi basiller uygun bir muhafaza edilmesi için gerekli bir dondurma kaptaki AFB yavaş dondurma, vardır. Gelecek deneyler uzun donma dönemlerinden sonra basilinin canlılığını değerlendirmek için yapılacaktır. Özet olarak, çünkü M. leprae in vitro uzamadığı, protokol uygun bir aşı bakımı için hızlı ve kolay bir alternatif sağlar, ve başarılı bir dondurma basamağı bu şekilde tanımlanmış suşları-nın bir banka kurulmasını sağlayan, hayvanlarda sürekli geçişi olmayan soylarının bakım mümkün kılar. Bu bölüm, bu protokolü gerçekleştirmek için reaktiflerin hazırlanması için talimatları içerir. 1.. Tripsin <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tripsin </td><td> 0.5 g </td></tr><tr><td> Damıtılmış su </td><td> kadar 100 ml </td></tr></tbody></table> Filtre sterilize. -20 ° C&#39;de saklayın 2. 7H9 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 7H9 broth base </td><td> 4.7 g </td></tr><tr><td> % 40 gliserol stok </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Damıtılmış su </td><td> kadar 900 ml </td></tr></tbody></table> Karıştırılarak su ile temel karışım daha sonra gliserol ekleyin. Sterilize edilmesi için 20 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklav. 4 ° C&#39;de saklayın 3. Beyin kalp infüzyon (BHI) <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> BHI </td><td> 37 g </td></tr><tr><td> Damıtılmış su </td><td> 1,000 ml </td></tr></tbody></table> Sterilize edilmesi için 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklav. 4 ° C&#39;de saklayın 4. Fenol serum 4.1),% 5 fenol <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fenol </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Damıtılmış su </td><td> kadar 100 ml </td></tr></tbody></table> 4.2) Serum fenol <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> fetal sığır serumu </td><td> 2 mi </td></tr><tr><td> % 5 fenol </td><td> 98 mi </td></tr></tbody></table> 4 ° C&#39;de saklayın 5. Soğuk Ziehl-Neelsen Lekesi için Çözümler 5.1) CarboFuchsin <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody&gt; <tr><td> Fuchsin </td><td> 1 g </td></tr><tr><td> Fenol kristaller 60 ° C&#39;ye kaynaşık </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Saf etil alkol </td><td> 10 mi </td></tr><tr><td> Damıtılmış su </td><td> kadar 100 ml </td></tr></tbody></table> Her kullanımdan önce filtre. 5.2) Metilen Mavisi Base <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Metilen mavi </td><td> 3 g </td></tr><tr><td> % 95 etil alkol </td><td> kadar 200 ml </td></tr></tbody></table> 5.3) Alkol asit <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> % 70 alkol </td><td> 990 mi </td></tr><tr><td> kloridrik asit </td><td> 10 mi </td></tr></tbody></table> 6. Donma için Orta: <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> OADC </td><td> 10 mi </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> 20 mi </td></tr><tr><td> 7H9 ortamı </td><td> kadar 100 ml </td></tr></tbody></table> Kullanmadan önce gliserol otoklavlayın ve süzülerek OADC sterilize. 7. Otoklavlanmış M. lepra süspansiyon 20 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklav. -20 ° C&#39;de saklayın

Lepra, Mycobacterium leprae&#39;nın neden olduğu bir hastalık, dünya çapında 1,2 birçok ülkede önemli bir halk sağlığı sorunudur. Deri ve periferik sinir etkiler bir enfeksiyon hastalığı olarak da bilinen olmasına rağmen, hastalığın karmaşık immünopatogenezinde de dahil mekanizmalar ile ilgili bilgi çeşitli boşluklar hala vardır. M. zorlu özellikleri arasında Onun çalışmasını engelleyen lepra yapay kültür medya ve nispeten uzun bir süre iki katına (yaklaşık 14 gün) 3,4 büyümek için kendi yetersizlik vardır. M. kullanan çoğu deneysel prosedürler lepra cüzzam hastalarının deri lezyonları veya bu armadillos ve farelerin 5,6 birkaç suşları olarak deneysel hayvan modellerinde, saflaştırılmış basili ile ayarlanır. Uzun yıllar boyunca, araştırmacılar M. saflaştırılması bağlıydı var lepra multibacillary leptin reseptör deri lezyonları itibarendeney prosedürlerinde kullanım için osy hastalar. Canlı M. in vitro kültivasyonu veya bakım için birkaç laboratuar koşulları leprae teşebbüs edilmiş, ancak bugüne kadar, hayvan modelleri, araştırma amaçları için en uygun olduğu kanıtlanmıştır. 1960 ve 1970&#39;li yıllarda, araştırmacılar M. tespiti ve değerlendirilmesi için fareler ve armadillos kullanmaya başladı anti-M tepki olarak bakteri gelişimini izleme leprae canlılığı, leprae ilaçlar ve mikobakteri suşlarının 2,4 büyümesi ve bakım. Hayvan modelleri etik kaygılar, bakım maliyeti, hayvan bakım için gerekli özel altyapı ve sonuçların kötü tekrarlanabilirlik ve son ürünleri de dahil olmak üzere, özellikle armadillos ve primatlarda, bazı sınırlamalar var. Şu anda, fareler cüzzam araştırma için tercih edilen bir model hayvan bulunmaktadır. Fareler kullanarak için laboratuvar koşulları gerçekleştirmek kolay, hazır, ve standart protokolleri izin <sup&gt; 7,8,9. Çıplak fareler M. bakımında kullanılmaktadır daha düşük uygun bir basil yükleri ile, bir T-hücresi bağışıklık tepkisi eksikliği canlı granülom oluşumunda ve iyi basil çarpma yol açar, çünkü leprae suşları. Böylece, bu hayvan modeli cüzzam araştırma toplum içinde geniş kabul görmüştür. Bu raporda, biz çıplak fare footpads gelen basilinin enzimatik saflaştırılması için basit bir protokol tanımlayan, bir M. hazırlanması için tasarlanmıştır minimal hücre artıkları ve yüksek bakteriyel canlılık indeksi ile lepra süspansiyon. Canlılığı hızla laboratuarda yapılabilir floresan mikroskobu ile tespit edilir. Biz de soğuk Ziehl-Neelsen boyama ve ışık mikroskobu ile basil sayım için standart yönteme bir değişiklik göstermektedir. Ayrıca, M. bakım ve depolanması için alternatif bir protokol mevcut leprea suşları, izin donma ve basilli st çözdürmeocks.

<table><tbody><tr><td>BacLight Bakteriyel Canlılık Kiti</td><td>Invitrogen; Moleküler Problar</td><td>L7007</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td> <td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Cryo 1 & derece; C Dondurma Kabı</td><td>Nalgene</td><td>5100001</td><td></td></tr><tr><td>Lowenstein-Jensen ortamı</td><td>LB Laborclin</td><td>901122</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>TEK Nova Inc</td><td>S5812</td><td></td></tr><tr><td>Kalem</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü 50 ml / konik tabanlı</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci - nbsp; - 40 & mikro; m Naylon</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>T-7409</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Et Suyu Tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0178 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Gibco BRL</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Beyin kalp infüzyonu (BHI)</td> <td>Oksoit LTDA</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Fuchsin</td><td>Merck Millipore 1159370025</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol&nbsp;</td><td>Invitrojen</td><td>15509037</td><td></td></tr><tr><td>Etil alkol</td><td>Merck Millipore</td><td>EX02764</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrik asit</td><td>Merck</td><td>1131349010</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook OADC (oleik asit-albümin-dekstroz-katalaz)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco; Yaşam Teknolojileri</td><td>26140079</td><td></td></tr></tbody></table>

için optimize protokoller<em&gt; mycobacterium leprae</em&gt; gerilme yönetimi: atimik Çıplak farelerde dondurulmuş hazır koruma ve bakım

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Mycobacterium leprae&#39;nın neden Lepra, Brezilya dahil olmak üzere dünyanın birçok ülkesinde, hala endemik olan önemli bir bulaşıcı hastalıktır. M. büyüyen için bilinen bir yöntem bulunmamaktadır leprae in vitro, laboratuarda, bu patojenin çalışmada önemli bir engel sunulması. Bu nedenle, M. bakım ve büyüme leprae suşları tercihen atimik çıplak farelerde (nu NU-Foxn1) gerçekleştirilir. Fareler kullanmak için laboratuar şartları kolaylıkla kullanılabilir yapmak kolay ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için standardizasyon ve protokoller gelişmesini sağlar. Floresan mikroskopisi ile tespit edildiği üzere, bu yazıda, en az hücre artıkları ve yüksek bakteriyel canlılığı indeksi ile bir süspansiyon elde edilir, tripsin kullanılarak çıplak fare ayak yastıklarından ikinci basil saflaştırılması için bir protokol açıklar. Ziehl-Neelsen basil sayım için standart bir yöntem için bir modifikasyonboyama ve ışık mikroskobu da kanıtlanmıştır. Ayrıca, M. bakım ve depolama için alternatif bir protokol olarak dondurma ve çözdürme basil hisse senetleri için bir protokol açıklar lepra suşları.

Protokolün başarısı üç şekilde değerlendirilebilir. İlk olarak, aşı kalitesinin değerlendirilmesi hücresel atıkların miktarı ve son süspansiyon uygun bir basilinin edilen yüzde (Protokol 3 bak) ile tespit edilir. Şekiller 1 ve 2&#39;de gösterildiği gibi, nihai süspansiyon, basil çok az hücre artıkları ve yüksek canlılığı (+ 0 puan) içerdiği, en çok basiller Syto 9 yeşil floresan boya (leke ölü ve canlı bakteri hem de 100 ile boyanan% nüfuz unutmayın Şekil 1) ve kırmızı PI floresan boya (leke hasarlı membran, Şekil 2) ile, sadece bakteri nüfuz ile boyanmış sadece birkaç basiller. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50620/50620fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50620/50620fig1.jpg" /> Şekil 1. Syto 9 boyama<html> M. leprae süspansiyon. Yeşil flüoresan canlı ve ölü M. varlığını gösterir lepra. 400X. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50620/50620fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50620/50620fig2.jpg" /> Şekil 2. M. PI boyama Ölü M. az sayıda gösteren lepra süspansiyon. Kırmızı floresan lepra. 400X. Video (Protokol 1) gösterildiği gibi ikinci, yüksek canlılığı ile aşılama, bariz makroskobik lezyon gelişimi ile, 4-5 ay sonrası aşılamadan sonra hayvanların ayaklarından basilinin çoğalması etkileyecektir. Protokolünün başarısını değerlendirmek için üçüncü yol (Protokolü 4 bakınız) farklı dönemler için dondurulmuş olmuştu basili ile aşılanmış fare ayaklarından AFB hayatta kalmasını ve çoğalmasını değerlendirilmesi gereğidir. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Deney (hayvan) </td><td> 0. günde AFB / ml dondurulmuş Sayısı </td><td> Canlılık puan / gün 0 </td><td> Donma dönemi (gün) </td><td> Dondurma sonra aşılanmış AFB sayısı </td><td> Dondurma sonra Canlılık puan </td><td> 7 ay sonra geri kazanılan AFB / ml sayısı </td></tr><tr><td> 1 (1) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1.7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 2.3 x 10 8 </td></tr><tr><td> 1 (2) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1.7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 3.8 x 10 7 </td></tr><tr><td> 1 (3) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1.7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 8.5 x 10 7 </td></tr><tr><td> 1 (4) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 60 </td><td> 1.7 x 10 5 </td> &lt;td&gt; 1 + </td><td> 4.6 x 10 7 </td></tr><tr><td> 2 (1) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4.2 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1.7 x 10 7 </td></tr><tr><td> 2 (2) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4.2 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 4.8 x 10 6 </td></tr><tr><td> 2 (3) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 4.2 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 8.6 x 10 6 </td></tr><tr><td> 3 (1) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1.7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1.2 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (2) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1.7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1.8 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (3) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td&gt; 0 + </td><td> 15 </td><td> 1.7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 1.8 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (4) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1.7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 2.6 x 10 7 </td></tr><tr><td> 3 (5) </td><td> 1.0 x 10 7 </td><td> 0 + </td><td> 15 </td><td> 1.7 x 10 5 </td><td> 1 + </td><td> 3.7 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. M. Sonuçlar Mesajı donma süspansiyonlar kullanılarak lepra çarpma. Tablo 1 sonuçları göstermektedir M. dondurma işleminden sonra süspansiyon kullanılarak leprae büyümesi. Çözündükten sonra süspansiyonlarının yaşayabilirliği skoru 1 + idi. Donma protokolü farklı donma süreleri test etmek için üç bağımsız deneyde de gerçekleştirilmiştir. 15 ya da 60 gün boyunca dondurulmuş inokulum ile Her iki deneyde de, benzer bir sonuç, s ididondurma işleminin ropagation 10-1,000 kez aşılama (Tablo 1), 7 ay sonra, her patinin geri kazanılan AFB sayısındaki artış elde edilmiştir. Bu nedenle, M. donma OADC (oleik asit-albümin-dekstroz-katalaz) ile takviye edilmiş ortam içinde 7H9 leprae süspansiyonlar canlılığı bakım ile sonuçlanmıştır. Üç inokulumlar M. değerlendirmek için kullanıldı lepra iki farklı dondurma dönem (15 ve 60 gün sonra) Çarpma. 7 ay sonra, basil aşılanmış farelerin ayak yastıklarından dan elde edildi ve Ziehl-Neelsen boyama sonra sayılır. Yarı niceliksel canlılığı ölçek: 0 anlamına gelir PI boyalı hücrelerin% 30 kadar mevcut değildir; 1 + PI boyalı hücrelerin% 30-50 arasında araç; 2 + PI boyalı hücrelerin% 50 üstünde anlamına gelmektedir. AFB: aside dirençli basil.

Mycobacterium leprae, cüzzam neden olan madde, in vitro olarak büyümez. Biz M. büyük miktarlarda bakım sağlamak için bir basil süspansiyon hazırlamak için protokolü takip etmek kolay bir tarif çeşitli uygulamalar için leprae. Fare ayak tabanı aşılama, canlılığı değerlendirilmesi, dondurma ve eritme basil stok tarafından yayılması için protokoller detaylı olarak tarif edilmektedir.

Için optimize Protokoller<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Gerilme Yönetimi: Atimik Çıplak Farelerde Dondurulmuş Hazır Koruma ve Bakım

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Bu çalışmanın amacı, nude farelere enjekte edilmek üzere yüksek canlılığa sahip bir mikobakteriyum lipid süspansiyonunun nasıl hazırlanacağını göstermektir. Enfeksiyonun tercihen erken evresindeki enfekte bir fareden temel yaşam materyali elde edeceğiz.Yüksek canlılıkta ari verim sağlamak için, hayvanı biyolojik güvenlik kabini içerisinde sakrifiye edin. Arka nabzı hemostatik pensle tutun. Onları nöbetlerle kesin ve 2%Iodine içine 20 dakika boyunca daldırın. Dekontaminasyon için, ayak pedi yukarı bakacak şekilde nokta pozisyonunu tutun.Yumuşak dokuyu toplayın. Dokunun homojenizasyonunu kolaylaştırmak için bir skapel bıçağı kullanarak birinci ve beşinci falanj kemiklerini çıkarın. Dokuyu steril bir Petri kabına yerleştirin. Epidermisi sıyırarak temizleyin.Granülomatöz dokuyu makasla küçük parçalara ayırın ve doku verim programının daha sonraki hesaplamaları için bekletin. Küçük parçaları bir ml Hank's dengeli tuz çözeltisi içeren bir tüpe aktarın. Bir ml daha Hank's çözeltisi ekleyin ve dokuyu hız dörtte, her biri 15 saniye sürecek şekilde üç kez homojenize edin.Bir hücre süzgecini 50 ml'lik steril konik tüpün içine yerleştirin. Süspansiyonu süzgecin üzerine pipetleyin ve çözeltinin yerçekimi ile geçmesini bekleyin. Kalıntıları gidermek için süspansiyona iki mL daha hanks ekleyin ve tekrar homojenize edin.Aynı döngüyü kullanarak, süspansiyonu bu süzgeçten geçirin. Süzgeci hanks ekleyerek durulayın. Süspansiyonun toplam hacmini 9 ml'ye tamamlamak için, yaklaşık %0,05 final konsantrasyonuna ulaşacak şekilde süspansiyona 1 ml %0,5 tripsin solüsyonu ekleyin.Tüpü nazikçe ters çevirerek karıştırın ve 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, steril salin ekleyerek süspansiyon hacmini 4 mL'ye tamamlayın; 4 °C'de 1700 ×g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı dökün ve tüpe vurarak pelletini yeniden süspanse edin. 1 mL sero salin ekleyin ve karıştırın.Süspansiyonu yeni bir tüpe aktarın. Süspansiyonu yeni bir tüpe aktarırken, 26 gauge iğneye sahip bir ml'lik bir insülin şırıngası kullanarak vasküler süspansiyonu homojenize edin. Süspansiyondan ikişer damlayı 18 medium ve seven H nine brain heart infusion besiyerlerine yerleştirerek süspansiyonun mikrobiyolojik kontrolünü gerçekleştirin.11 Stein Genesen 37 °C'de inkübe edildi. Ardından rutin mikrobiyolojik kontrol prosedürleri uygulandı. Kod Z boyaması için.S süspansiyonunun salin içerisinde 1/10 ve 1/100'lük dilüsyonlarını hazırlayın. Sayım için lamları hazırlamadan önce her bir dilüsyonu homojenize edin; kalıcı bir mürekkep markeri kullanarak her lamın yüzeyine 10 mm iç çapta üç daire çizerek üç lam hazırlayın.Şimdi daireleri immünohistokimya kalemi ile çevreleyin. Bu lamları iki numaralı kurşun kalem kullanarak etiketleyin; üç farklı konsantrasyon için lamları hazırlayın: Seyreltilmemiş, 1/10 ve 1/100.Her bir daireye beş µL fenol serum çözeltisi ve 10 µL sary süspansiyonu pipetleyin, homojenleştirin ve süspansiyonu dairenin tüm alanına eşit şekilde yayın. Tek kullanımlık bir özenin sapını kullanarak, kuruma işlemi sonrası bunları düz bir masa üzerine yerleştirin. Süspansiyonlar yukarı bakacak şekilde, bunları üç kez mavi alev üzerinden geçirerek sabitleyin.Bir kod Zuni sürdürülebilirliği gerçekleştirin. Bu lamları inceleyin. Üç dilüsyon.Sayımdaki en uygun dilüsyonu seçin. Vasküler süspansiyonu 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklavlayarak 200 µL öldürülmüş sary süspansiyonu hazırlayın. Mikrobakteriyel lipidlerin floresan boyaması için L 7 0 0 7 canlı ölü arka ışık bakteriyel viabilite kitini kullanın.Çözelti A'dan 1:10 dilüsyon ve çözelti B'den 1:20 dilüsyon hazırlayın. Kullanımdan hemen önce; orijinal ve öldürülmüş seyreltilmemiş vasküler süspansiyonun her 200 µL'sine, seyreltilmiş çözelti A'dan 3,6 µL ve seyreltilmiş çözelti B'den 6 µL ekleyin. Karanlıkta 15 dakika inkübasyonun ardından, süspansiyonu 4 °C'de, 10.600 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı pipet yardımıyla uzaklaştırın.Peleti 50 µL %10 Gliserol içerisinde süspande edin ve pipetleme yaparak homojen hale getirin. Her süspansiyondan sekiz µL'yi bir lam üzerine yerleştirin ve küçük bir lamel ile kapatın. Işıktan koruyun.Süspansiyonları floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Mililitrede 10^7 BA lip konsantrasyonuna sahip süspansiyon hazırlayın; her bir kriyoviyale bir ml dondurma medyumu koyun. Ardından, bir ml dondurma medyumu içerisine 150 µL S süspansiyonu ekleyin ve tüpü tersyüz ederek homojen hale getirin.Kriyo tüpü dondurma kabının içine yerleştirin. Kabı en az 24 saat boyunca -80 °C'de tutun. Tüpleri bir saklama kutusuna aktarın ve çözdürme işlemi için -80 °C'de muhafaza edin.Dondurulmuş süspansiyonu 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda çözdürün. Süspansiyonu, 20 mL steril salin içeren bir konik tüpe aktarın. Konsantre etmek için santrifüjleyin.Baline için sayım amacıyla Z sürdürülebilirliği protokolü ve canlılık belirleme amacıyla floresan boyama protokolü takip edildi. Her öğün için 10 ila 8 BA içeren süspansiyon hazırlayın ve her hayvanı inoküle etmeden önce süspansiyonu homojenleştirin. Bir insülin şırıngasına 100 µL çekin ve canlılık belirlemesindeki her hayvanın arka ayak pedlerine 30 µL inoküle edin.Tüm BAI'larda yeşil floresan, sadece o bai'de ise kırmızı floresan gözlemlenir. Bu BAI'lar steril kontrol olduğunda, yeşil ve kırmızı BAI ışığının aynı yoğunlukta olduğu görülür. Farklı süreler boyunca dondurulmuş M Lepar inokülasyonu, yedi ay sonra geri kazanılan BAI sayısında 10 ila 1000 kat artış sağlar.Son bir not olarak, IL leid in vitro ortamda büyümediği için, bu protokolün canlı yl Leid'in laboratuvarda ilerideki kullanımlar için hazır tutulmasının hızlı ve kolay bir yolunu sağladığını eklemek isteriz.

optimized-protocols-for-mycobacterium-leprae-strain-management-frozen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

C57BL / 6 farelerinde Hc patogenezinde çalışma ve en iyi model sağlamak için kullanılmaktadır. Biz bu mantara karşı sıvısal bağışıklığın potansiyel yararları keşfetmek ve histon H2B ve ısı şoku proteini 60kDa] üretilen çeşitli mAbs intraperitoneal uygulamadan sonra koruyucu etkinlik için test ettiğim.

Karşı Monoklonal Antikorlar Pasif Yönetim H. capsulatum Ve Diğerleri Fungal Patojenler

Bu video, bir murin modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) indüklemek için bir antijen adjuvan emülsiyonu oluşturmak için etkili bir homojenizasyon tekniğini göstermektedir. Emülsiyon, inaktive edilmiş bir patojenik bakteri içeren sürekli bir yağ fazı ile çevrili su fazında bir otoantijen - miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG) içerir. Emülsiyon, uzun süreli bir bağışıklık tepkisi için sürekli bir antijen salınımı sağlar.

Otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için bir antijen adjuvan emülsiyonunun hazırlanması

Bu video, bulaşıcı sonrası üveiti incelemek için hazırlanmış mikobakteriyel üveitin (PMU) bir fare modelini oluşturma yöntemini gösterir. Daha önce aynı immünojen ile aşılanmış bir farede ısıyla öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis'in intravitreal enjeksiyonu ile PMU'nun indüksiyonu üzerine, gözdeki kronik inflamasyonun ilerlemesi görüntüleme ve histopatolojik inceleme kullanılarak analiz...

Post-enfeksiyöz üveiti incelemek için astarlanmış mikobakteriyel üveitin bir murin modeli

Bu video, farelerde Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG ile ayak tabanı enfeksiyonunu takiben dendritik hücre göçünü izlemek için bir testi göstermektedir. Bakteriyel enfeksiyon üzerine, aktive edilmiş cilt DC hücreleri, hücre geçirgen bir karboksifloresein diasetat süksinimidil ester (CFSE) boyası ile etiketlenir. Popliteal drenaj lenf noduna DC migrasyonu için uygun bir aralıktan sonra, nod hücreleri izole edilir ve DC'ye özgü yüzey belirteçleri için immün boyamaya tabi tutulur.

Enfekte farelerde drenaj lenf düğümlerine cilt dendritik hücre göçünü izlemek için CFSE tabanlı bir test

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Burada insanlaşmış farelerde HIV enfeksiyonu dinamikleri incelenmesi için üç deneysel yaklaşımlar açıklanmıştır. İlk ivedi kronik enfeksiyon olaylarının incelenmesine izin vererken, ikincisi primer enfeksiyon veya viral reaktivasyon sonrası akut olayların incelenmesine izin verir.

Humanized Immunoficient Mouse Modellerinde Kronik, Akut ve Yeniden Aktive HIV Enfeksiyonu

Bu protokol, farelerde Astarlı Mikobakteriyel Üveit'i (PMU) indükleme adımlarını özetlemektedir. Bu yöntem, fare modeli sisteminde güvenilir ve sağlam oküler inflamasyon üretmeye yardımcı olacak adımları özetlemektedir. Bu protokolü kullanarak, immünolojik, transkriptomik ve proteomik tahlillerle daha ileri değerlendirme için tek hayvanlardan uveitik gözler ve iltihapsız diğer gözler ürettik.

Post-Enfeksiyöz Üveit için Bir Model Olarak Astarlanmış Mikobakteriyel Üveit (PMU)

Bu protokol, miyelin oligodendrosit glikoprotein kullanılarak bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelitin indüklenmesini ve klinik bir skorlama sistemi kullanılarak hastalık sürecinin izlenmesini açıklamaktadır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit ile ilişkili semptomlar, hastalık sürecini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için fare femur mikro-bilgisayarlı tomografi analizi ve açık alan testi kullanılarak analiz edilir.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Çeşitli Değerlendirme Göstergeleri

Multipl sklerozun bir hayvan modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için, fareler bir otoantijen ve Freund'un adjuvanını tamamlayan bir yağda su emülsiyonu ile bağışıklanır. Bu emülsiyonların hazırlanması için çeşitli protokoller mevcut olsa da, emülsiyon hazırlığı için hızlı, basit ve standartlaştırılmış bir homojenizasyon protokolü burada sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyeliti İndüklemek için Antijen/Adjuvan Emülsiyonlar Hazırlamak için Hızlı, Basit ve Standartlaştırılmış Bir Homojenizasyon Yöntemi

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl sklerozun en yaygın kullanılan murin modellerinden biridir. Mevcut protokolde, her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi ile aşılanır ve bu da esas olarak kuyruk ve uzuvların artan parezi ile sonuçlanır. Burada EAE indüksiyonu ve değerlendirme protokolünü tartışıyoruz.

İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit

Fareler genellikle Mycobacterium abscessus enfeksiyonlarına karşı dirençlidir, bu da akciğer enfeksiyonlarına karşı çok ihtiyaç duyulan antibiyotiklerin keşfedilmesini ve geliştirilmesini zorlaştırır. Burada, immünokompetan farelerde sürekli enfeksiyon sağladığı gösterilen bir aşı hazırlama ve intratrakeal enfeksiyon yöntemini açıklıyoruz.

İmmünkompetan Fareleri İntratrakeal Olarak Aşılamak için Agar Boncuğu Gömülü Mycobacterium abscessus'un Hazırlanması

Öğrenin Mycobacterium leprae için hazırlama ve koruma yöntemlerini; canlı süspansiyon oluşturma, dondurma-çözme ve athymic çıplak farelerde bakım protokollerini keşfedin.

Için optimize Protokoller

Daha fazla video keşfet