Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, canlı zebra balığı larvalarında periferik sinir hasarını takiben glial hücre davranışını hızlandırılmış olarak görüntülemektir. Bu, önce anestezi uygulanmış zebra balığı larvalarının düşük erime noktalı aroslara cam tabanlı petri kaplarına monte edilmesi ve bir diseksiyon iğnesi ile konumlandırılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, monte edilen larvalar konfokal mikroskoba yerleştirilir.

Ablasyon için bir sinir seçilir ve yaralanmamış sinirin aksonları ve glial hücrelerinden elde edilen bir görüntü elde edilir. Daha sonra sinir boyunca ROI'ler seçilir ve seçilen alanları ablate etmek için lazer ateşlenir ve bir sinir transeksiyonu oluşturulur. Son olarak, aksonlar ve glial hücreler, sinir transeksiyonunu takiben hızlandırılmış olarak görüntülenir.

Sonuç olarak, hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışı gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, glial hücrelerin sinir hasarına nasıl tepki verdiği gibi rejenerasyon ve glial hücre biyolojisi alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Ve farklı glial alt tipler, dejenerasyon ve rejenerasyon sırasındaki davranışlarını nasıl koordine eder?

İlgilenilen motor nöronları ve glial hücre tiplerini floresan olarak etiketleyen transgenleri içeren yetişkin zebra balıklarını geçtikten ve embriyoları döllenme veya HPF'den 24 saat sonrasına kadar kuluçkaya yatırdıktan sonra, yumurta suyunu çıkarın ve embriyoları kuluçka makinesine geri döndürmeden önce yumurta suyunda bir pH diş threa veya PTU ile değiştirin. Bu zaman noktasından yaklaşık 96 HPF'ye kadar, istenen floresan genin varlığı için embriyoları taramak için bir floresan diseksiyon kapsamı kullanın. Pozitif embriyoları taze PTU yumurta suyuna aktarın ve inkübatöre geri koyun.

Larvalar döllenme veya DPF'den altı gün sonrasına ulaştığında, montaj için birkaç embriyo seçin ve bunları daha küçük bir tabağa aktarın. Suyu tabaktan çıkarın ve hemen %0.02 trica ile değiştirin PTU yumurta suyunda larvaları anestezik olarak yaklaşık beş dakika inkübe edin. Daha önce metin protokolüne göre hazırlanmış% 0.8 düşük eriyik agros içeren bir Eloqua'yı musluk suyu ve mikrodalga fırın ile bir behere yerleştirin.

30 saniye boyunca veya agros eriyene kadar, agros tüpü dokunulduğunda ılık hissedene kadar beherin soğumasına izin verin. Daha sonra, anestezi uygulanmış bir larvayı 35 milimetrelik bir cam alt tabağa aktarın. Tabaktaki suyu çıkarın.

Daha sonra larvaları hemen tabağın cam tabanlı kısmını dolduracak kadar ılık aros ile örtün. Agros sertleştikçe, larvaları yan tarafına yerleştirmek için bir diseksiyon iğnesi kullanın. Daha sonra, monte edilmiş larvaların tabağın altındaki cama temas ettiğinden emin olun, bu da yaralanma ve görüntüleme için gereklidir.

Agro katılaşana ve larvalar hareketsiz hale gelene kadar larvaları yerinde tutmak için iğneyi kullanın. Daha sonra, agros ve larvaları tamamen kaplayacak kadar trica suyunu tabağa yavaşça pipetleyin. Tüm konfokal mikroskop cihazlarını, heyecan verici zebra balığı transgenleri için uygun diyot lazerleri ve nitrojen pompalı boya lazerini açın.

Boş ışın ayırıcının yerinde olduğundan ve 435 nanometre kaplayıcı ve boya hücresinin yerinde olduğundan emin olun. Lazer zayıflatıcıyı tamamen açın ve ardından 63 x 1,2 na suya daldırma lensi ve bir tarafı aynalı bir cam sürgü ile görüntüleme yazılımını açın. Aynadaki bir çizik veya aşındırmayı bulmak ve odaklanmak için parlak alan aydınlatmasını kullanın.

Görüntüleme yazılımını kullanarak, lazer kalibrasyonu ve güç ayarlarını kontrol eden pencereden bilgisayar ekranındaki aşındırmaları görüntüleyin ve odaklayın. Ana araç çubuğundan darbe sayısını bire ve zayıflamayı %3 iletimine ayarlayın. Elips aracını seçin ve bilgisayar ekranındaki görüntüye tıklayın.

Tek bir dairesel ROI oluşturmak için, görüntü üzerinde rastgele aralıklı dört dairesel RI olana kadar işlemi üç kez daha tekrarlayın. Ardından, lazeri ateşleyin. Lazer düzgün çalışıyor ve kalibre ediliyorsa, bu, her dairesel ROI içinde bir tane olmak üzere dört küçük nokta aşındırma oluşturacaktır Ardından cam slaytı mikroskop aşamasından çıkarın ve objektifi temizleyin.

Lazer ablasyon kullanarak bir motor siniri kesmek için boş ışın ayırıcıyı %100 ILL ışın ayırıcı ile değiştirin. Objektife küçük bir damla suya daldırma ortamı uygulayın ve monte edilmiş larva ile tabağı, mercek ve geniş alan aydınlatmasını kullanarak stabilize etmek için klipsler kullanarak uygun sahneye yerleştirin. Larvalara odaklanın ve motor nöronları bulun.

10 ila 20 arasındaki hemi segmentlerindeki sinirleri tarayın ve transeksiyon için bir motor sinir seçin. Ardından, bilgisayar ekranındaki sinirin canlı bir görüntüsünü getirin. Z düzlemlerini seçin ve yaralanmamış sinirin aksonlarının ve glial hücrelerinin bir görüntüsünü elde edin.

Ardından, beş ila 30 dakikalık aralıklarla tüm hücre tiplerinin Z projeksiyonlarını yakalamak için hızlandırılmış görüntüleme ayarlarını hazırlayın. Deneye bağlı olarak, %100 ILL ışın ayırıcıyı çıkarın ve boş ile değiştirin. Sinirin canlı görüntüsüne dönün ve kesilecek aksonları görüntülemek için uygun floresan kanalını kullanın.

Elips aracını kullanarak, kesilecek alanda ince bir eliptik yatırım getirisi oluşturun. Ardından, lazer ayarlarını kontrol eden pencerede seçilen bölge içinde daha küçük ROI'ler oluşturun. Darbe sayısını ikiye ve zayıflama plakasını %18 iletime ayarlayın.

Ardından lazeri seçilen ROI'ler dahilinde ateşleyin. 10 saniye veya daha fazla bekleyin ve ablasyon yapılan alanı floresan açısından tekrar kontrol edin. Bir ROI'nin, aslında foto ağartılmış olduğunda başlangıçta kesilmiş görünebileceğini ve tam bir transeksiyon elde etmek için ablasyon sırasında ROI'lerin biraz değiştirilmesi gerekebileceğini unutmayın.

Floresan geri dönerse, lazer gücünü artırın ve lazeri ateşleyin. Yine, R OIS içinde floresan kaybolana ve 10 saniye içinde geri dönmeyene kadar bunu tekrarlayın. Ablasyon tamamlandıktan sonra, hızlandırılmış çekim tamamlandığında hızlandırılmış görüntülemeye başlayın.

Verileri derlemek ve her zaman noktası için renkli bileşik Z projeksiyonları oluşturmak için görüntüleme yazılımını kullanın. Aksonların glial hücrelerinin davranışını aynı anda analiz etmek için hızlı bir zaman filmi oluşturun. Burada tarif edilen test, glial hücrelerin ve diğer sinirle ilişkili hücre popülasyonlarının in vivo aksonal hasara tepkisini değerlendirmek için kullanılabilir.

Burada, bu yöntem kullanılarak oluşturulan bir sinir yaralanması örneği ve çevredeki glial hücrelerin tepkisi gösterilmektedir. Deney, perinöral ggl'de membran hedefli EGFP ve motor nöronlarda sitozolik DS kırmızısı eksprese eden altı DPF transgenik zebra balığında gerçekleştirildi. Yaralanma, daha sonra hem EGFP hem de DS kırmızı kanallarında hızlandırılmış olarak görüntülenen bir gövde motor sinirinin rostral projeksiyonu boyunca yapıldı.

Bu, yaralanmanın hemen ardından akson ve glial hücre davranışlarının aynı anda görüntülenmesine izin verdi. Bu görüntüler, zaman atlamalı filmden alınan statik zaman noktalarıdır. Noktalı elips, lazer kullanılarak bir dakikada kesilen yatırım getirisini gösterir.

Transeksiyon veya MPT sonrası, ablasyonlu alan floresandan yoksundu ve yaralanma bölgesi proksimal ve distal güdükten yaklaşık 3.5 mikrometre ölçüldü. Bir transeksiyonun başarısı, distal sinir güdüğünün görüntülenmesi ve distal akson parçalanması ve hızlı klerens dahil olmak üzere wallerian dejenerasyon belirtilerinin aranmasıyla doğrulanabilir. 120 MPT'de distal güdük boyunca aksonal floresan olmaması, bu aksonların gerçekten wallerian dejenerasyonu geçirdiğini ve işlemin başarılı olduğunu gösterir.

Lazer ablasyon deneyleri yapılırken lazer gücünün ideal bir ayara ayarlanması çok önemlidir. İdeal lazer gücü ayarları, siniri yalnızca seçilen ROI dahilinde temiz bir şekilde ablate eder ve çok düşük veya çok yüksek olan lazer gücü ayarları, burada çok düşük lazer gücüyle gerçekleştirilen bir yaralanma olarak görülen optimal olmayan sonuçlar verir. Floresan, lazeri ateşledikten sonra ROI içinde kaldı ve bu da eksik bir transeksiyona neden oldu.

Öte yandan, bu şekilde gösterildiği gibi, çok yüksek bir lazer gücü son derece büyük bir ablasyon üretti. Bu videoyu izledikten sonra, lazer transeksiyon deneyleri için zebra balığının nasıl monte edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir nitrojen pompası boya lazeri kullanarak bir transeksiyon oluşturun ve hızlandırılmış konfokal görüntüleme kullanarak çevredeki hücrelerin tepkisini değerlendirin.