Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, canlı zebra balığı larvalarında periferal sinir yaralanması sonrası glial hücre davranışının zaman aşımıyla görüntülenmesidir. Bu işlem, öncelikle anestezi altındaki zebra balığı larvalarının cam tabanlı petri kaplarında düşük erime noktalı agar üzerine monte edilmesi ve bir diseksiyon iğnesi ile konumlandırılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, monte edilen larvalar konfokal mikroskoba yerleştirilir.

Ablasyon için bir sinir seçilir ve hasarsız sinirin aksonlarının ve glial hücrelerinin bir görüntüsü alınır. Ardından sinir boyunca ROI'ler seçilir ve seçilen alanları ablate ederek bir sinir transeksiyonu oluşturmak için lazer ateşlenir. Son olarak, sinir transeksiyonunu takiben aksonlar ve glial hücreler zaman ayarlı görüntüleme (time-lapse imaging) yöntemiyle görüntülenir.

Nihayetinde, zaman ayarlı konfokal mikroskopi aracılığıyla sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında glia hücrelerinin dinamik davranışlarını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem; glia hücreleri sinir yaralanmasına nasıl yanıt verir ve farklı glia alt tipleri dejenerasyon ile rejenerasyon sırasında davranışlarını nasıl koordine eder gibi, rejenerasyon ve glia hücresi biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

İlgili motor nöronları ve glial hücre tiplerini floresan ile işaretleyen transgenlere sahip yetişkin zebra balıkları çiftleştirildikten ve embriyolar döllenmeden sonraki 24. saate veya HPF'ye kadar inkübe edildikten sonra, yumurta suyunu uzaklaştırın ve embriyoları inkübatöre geri yerleştirmeden önce yumurta suyu içindeki 1 pH'lık PTU (fenotiyolüre) ile değiştirin. Bu zaman noktasından yaklaşık 96 HPF'ye kadar, istenen floresan genin varlığını taramak için floresan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Pozitif embriyoları taze PTU'lu yumurta suyuna aktarın ve tekrar inkübatöre yerleştirin.

Larvalar döllemeden sonraki altıncı güne (DPF) ulaştığında, montaj için birkaç embriyo seçin ve bunları daha küçük bir kaba aktarın. Kabın içindeki suyu boşaltın ve hemen %0,02'lik tricaine içeren PTU'lu yumurta suyu ile değiştirin; larvaları anestezik içinde yaklaşık beş dakika inkübe edin. Metin protokolüne göre önceden hazırlanmış %0,8'lik düşük erime noktalı agar bloğunu, musluk suyu içeren bir behere yerleştirip mikrodalga fırına koyun.

30 saniye boyunca veya agar eriyene kadar, beherin içindeki agar tüpü dokunulduğunda ılık hissedilene kadar soğumasını bekleyin. Ardından, anestezi uygulanmış bir larvayı 35 milimetrelik cam tabanlı bir kaba aktarın. Kaptaki tüm suyu uzaklaştırın.

Ardından, larvaları kabın cam tabanlı kısmını dolduracak kadar sıcak agar ile hemen örtün. Agar sertleştikçe, bir disseksiyon iğnesi kullanarak larvaları yan tarafa gelecek şekilde konumlandırın. Sonra, larvaların yaralanma ve görüntüleme için gerekli olan kabın altındaki cama temas ettiğinden emin olarak onları hafifçe sırt üstü eğin.

Agar katılaşana ve larva hareketsiz kalana kadar larvanın konumunu korumak için iğneyi kullanın. Ardından, agar ve larvaları tamamen örtecek miktarda trica suyunu yavaşça kaba pipetleyin. Tüm konfokal mikroskop donanımını, zebrafish transgenlerini uyarmak için uygun diyot lazerleri ve azot pompalı boya lazerini açın.

Boş demet ayırıcı ve 435 nanometre coer ve boya hücresinin yerinde olduğundan emin olun. Lazer atenüatörünü tamamen açın ve ardından 63 x 1.2 na su daldırma lensi ile bir tarafı aynalı bir cam slayt kullanarak görüntüleme yazılımını açın. Aynadaki bir çiziği veya kazıma izini bulmak ve odaklamak için parlak alan aydınlatmasını kullanın.

Görüntüleme yazılımını kullanarak, lazer kalibrasyonunu ve güç ayarlarını kontrol eden pencereden bilgisayar ekranındaki kazımaları görüntüleyin ve odaklayın. Ana araç çubuğundan darbe sayısını bir ve zayıflatmayı %3 geçirgenlik olarak ayarlayın. Elips aracını seçin ve bilgisayar ekranındaki görüntüye tıklayın.

Tek bir dairesel ROI oluşturmak için, görüntü üzerinde rastgele dağılmış dört dairesel ROI olana kadar işlemi üç kez daha tekrarlayın. Ardından lazeri ateşleyin. Lazer düzgün çalışıyor ve kalibre edilmişse, bu işlem her bir dairesel ROI içerisinde bir adet olmak üzere dört küçük nokta aşındırması oluşturacaktır. Daha sonra lamı mikroskop tablasından çıkarın ve objektifi temizleyin.

Lazer ablasyonu kullanarak bir motor siniri kesmek için boş ışın ayırıcıyı %100ILL ışın ayırıcı ile değiştirin. Objektife küçük bir damla su daldırma medyumu uygulayın ve göz merceği ile geniş alan aydınlatmasını kullanarak, monte edilmiş larva içeren petri kabını stabilize etmek için klipsler yardımıyla uygun sahneye yerleştirin. Larvalara odaklanın ve motor nöronları tespit edin.

10 ile 20 arasındaki hemi segmentlerdeki sinirleri tarayın ve kesilecek bir motor sinir seçin. Ardından, sinirin canlı görüntüsünü bilgisayar ekranına getirin. Z düzlemlerini seçin ve yaralanmamış sinirin aksonlarının ve glial hücrelerinin bir görüntüsünü elde edin.

Ardından, tüm hücre tiplerinin Z projeksiyonlarını 5 ila 30 dakikalık aralıklarla yakalamak için zaman aşımı görüntüleme ayarlarını hazırlayın. Deneye bağlı olarak, %100ILL ışın bölücüyü çıkarın ve yerine boş parçayı yerleştirin. Sinirin canlı görünümüne geri dönün ve kesilecek aksonları görüntülemek için uygun floresan kanalını kullanın.

Elips aracını kullanarak, ablasyon yapılacak bölgede ince eliptik bir ROI oluşturun. Ardından, lazer ayarlarını kontrol eden pencerede, seçilen bölge içinde daha küçük ROI'ler oluşturun. Puls sayısını ikiye ve atenüasyon plakasını %18 transmission değerine ayarlayın.

Ardından, seçilen ROI'ler içinde lazeri ateşleyin. 10 saniye veya daha fazla bekleyin ve ablasyon yapılan alanı floresans açısından tekrar kontrol edin. Bir ROI'nin aslında fotobeach (foto-beyleme) olmuş olmasına rağmen başlangıçta ablate edilmiş gibi görünebileceğini ve tam bir kesi elde etmek için ablasyon sürecinde ROI'lerin hafifçe modifiye edilmesi gerekebileceğini unutmayın.

Floresans geri dönerse, lazer gücünü artırın ve lazeri ateşleyin. R OIS içinde floresans kaybolana ve 10 saniye içinde geri dönmeyene kadar bu işlemi tekrarlayın. Ablasyon tamamlandığında, zaman ayarlı görüntülemeye başlayın ve zaman ayarlı görüntüleme tamamlandığında işlemi bitirin.

Verileri derlemek ve her bir zaman noktası için renkli kompozit Z projeksiyonları oluşturmak için görüntüleme yazılımı kullanın. Aksonların ve glial hücrelerin davranışını eş zamanlı olarak analiz etmek için bir QuickTime videosu hazırlayın. Burada açıklanan analiz, glial hücrelerin ve diğer sinirle ilişkili hücre popülasyonlarının in vivo aksonal yaralanmaya verdiği yanıtı değerlendirmek için kullanılabilir.

Burada, bu yöntem kullanılarak oluşturulmuş bir sinir hasarı örneği ve çevredeki glial hücrelerin yanıtı gösterilmektedir. Deney, perineural glia hücrelerinde membrana hedefli EGFP ve motor nöronlardale sitozolik DS red eksprese eden altı DPF'lik transgenik zebra balığında gerçekleştirilmiştir. Hasar, bir gövde motor sinirinin rostral projeksiyonu boyunca yapılmış ve ardından hem EGFP hem de DS red kanallarında zaman serili görüntüleme ile izlenmiştir.

Bu sayede, yaralanmanın hemen ardından akson ve glial hücre davranışlarının eş zamanlı olarak görselleştirilmesi sağlanmıştır. Bu görüntüler, zaman ayarlı videodan alınmış statik zaman noktalarıdır. Noktalı elips, birinci dakikada lazer kullanılarak ablate edilen ROI'yi göstermektedir.

Transeksiyondan veya MPT'den sonra, ablate edilen alanda floresans görülmemiş ve yaralanma bölgesi proksimalden distal güdüye kadar yaklaşık 3,5 mikrometre olarak ölçülmüştür. Bir transeksiyonun başarısı, distal sinir güdüsünün görüntülenmesiyle ve distal akson fragmantasyonu ile hızlı temizlenme dahil olmak üzere Wallerian dejenerasyonu belirtilerinin aranmasıyla doğrulanabilir. 120 MPT'de distal güdüyü boyunca aksonal floresansın yokluğu, bu aksonların gerçekten Wallerian dejenerasyonuna uğradığını ve transeksiyonun başarılı olduğunu gösterir.

Lazer ablasyon deneyleri gerçekleştirilirken lazer gücünün ideal bir ayara getirilmesi kritik öneme sahiptir. İdeal lazer gücü ayarları, siniri yalnızca seçilen ROI içinde temiz bir şekilde ablate eder; çok düşük veya çok yüksek olan lazer gücü ayarları ise suboptimal sonuçlar verir; burada lazer gücünün çok düşük olduğu bir yaralanma görülmektedir. Lazeri ateşledikten sonra ROI içinde floresans kalmış, bu da eksik bir transeksiyona yol açmıştır.

Öte yandan, bu şekilde gösterildiği gibi, çok yüksek bir lazer gücü aşırı büyük bir ablasyona neden olmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, lazerle kesim deneyleri için zebra balığının nasıl sabitleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Azot pompalı boya lazeri kullanarak bir kesi oluşturun ve çevredeki hücrelerin tepkisini zaman ayarlı konfokal görüntüleme ile değerlendirin.