Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

Bu prosedürün genel amacı, toksik maddeler veya farmasötiklerle muamele edildikten sonra zebra balığı larvalarındaki davranış kusurlarını belirlemektir. Bu, ilk önce embriyoların veya larvaların toplanması ve gelişimin ilk yedi gününe kadar kimyasallarla muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, özel olarak tasarlanmış kalıplar kullanarak agro yüzme şeritleri yapmaktır.

Daha sonra, tedavi edilen larvalar, hızlandırılmış fotoğrafçılık kullanılarak davranışsal analiz için agros şeritlerine yerleştirilir. Son adım, görüntüleri görüntü J'ye aktarmak ve şeritlerdeki larvaların XY koordinat verilerini toplamak için şirket içinde yazılmış belirli bir makroyu kullanmaktır. Sonuç olarak, yüksek verimli davranışsal tahlil, kaçınma ve figma ekseni davranışının yanı sıra tedavi grupları arasında yüzme hızı ve dinlenme farklılıklarını bulmak için kullanılır.

Bu tekniğin ticari olarak mevcut olanlar gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yöntemimizi daha karmaşık davranışları gözlemlemek için kullanabilmemizdir. Ayrıca yapımı ucuzdur ve kurulumu kolaydır. Bu yöntem, toksik maddelerin erken embriyonik maruziyet sırasında beyin gelişimini ve davranışını nasıl etkilediği gibi davranışsal sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Ayrıca, diğer mevcut toksisite ekranları tarafından bulunamayan insanlardaki ince beyin kusurları hakkında da bilgi sağlayabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü larvaları yakalamak zor olabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, protokol özel olarak oluşturulmuş sistemleri içerdiğinden, adımların bir öğrenme eğrisine sahip olması nedeniyle kritik öneme sahiptir.

Bu işleme başlamak için, yeşil iplikten yapılmış sahte çim içeren cam Pyrex tabaklarını tanklara yerleştirin. Şafakta, zebra balığı embriyolarını toplamak için bulaşıkları iki saat boyunca tanklarda bırakın. Embriyoları içeren cam tabakları deiyonize su ile elde tutulan bir süzgeç rinin üzerine dökün.

Daha sonra, embriyoları deiyonize suda litre başına 60 miligram anlık okyanus ve küf inhibitörü olarak kullanılan litre başına 0.25 miligram metilen mavisi içeren yumurta suyunda büyütün. Embriyolar, 50 mililitre başına 50 ila 60 larvada veya embriyolar toksik maddelerle tedavi edilmeye hazır olana kadar daha büyük üreme tanklarında barındırılabilir. Bireysel deneyin hipotezine bağlı olarak, embriyolar hemen veya gelişimin belirli aşamalarında, genellikle DMSO'da çözülen ve daha sonra doğrudan yumurta suyu ortamında seyreltilen toksik maddeler veya farmasötikler kullanılarak tedavi edilebilir.

Mavi renk, embriyonik ve larva tedavisi sırasında video gösterimi amacıyla kullanılır. Larvalar ve embriyolar, döllenmeden yedi gün sonraki davranış analizi, ölü embriyolardan mantar veya bakteri üremesini önlemek için yumurta suyu çözeltisini en az iki günde bir değiştirene kadar 50 mililitrede yaklaşık 50 ila 60 larva yoğunluğunda derin Petri kaplarında barındırılabilir. Thermos Scientific'ten tek kuyulu plastik plakalara dökülen aros kullanılarak şeritler oluşturmak için plastik kalıplar üretildi.

Kalıplar, kenarların 60 derece açılı olduğu beş şerit içerir. Kalıpların ve plakaların boyutları için bu videoya eşlik eden metin protokolünü görüyor musunuz? İlk olarak, aros'u deiyonize suda litre başına 60 miligram ile %0,8 aros eriterek hazırlayın.

Daha sonra, 50 mililitre erimiş aros'u tek bir kuyucuk plakasına dökerek şeritleri oluşturun. Daha sonra kalıbı çok yavaş bir şekilde herhangi bir kabarcık oluşumunu ortadan kaldıran sıvı aroların üzerine yerleştirin. Aros soğuduğunda kalıbı çıkarın.

Aros şeritleri, bulaşıkların üzerindeki kapaklarla birlikte oda sıcaklığında 36 saate kadar saklanabilir. Yüksek verimli davranış analizi için, görüntüleme kabinleri, kabinin üst kısmına takılan ve kabinin alt kısmında aşağı bakacak şekilde 15 megapiksel dijital kamera ile hazırlanır. 15.6 inç ekranlı bir dizüstü bilgisayar, ekran yukarı bakacak şekilde yerleştirilir.

Larvaların aşırı ısınmasını önlemek için, ekran sıcaklığı 28 santigrat derecenin üzerine çıkmayan bir dizüstü bilgisayar kullanmak en iyisidir. Agros plakalarının yerleştirileceği dizüstü bilgisayar ekranının üstüne plastik bir difüzör yerleştirin. Difüzör, toplanan görüntülerde daha fazla desen oluşmasını önleyecektir.

Görüntü yakalamaya başlamak için, larva stresini azaltmaya yardımcı olmak için larvaları Petri kabından agros şeridine dikkatlice taşıyın. Her şeride en fazla 20 larva yerleştirilebilir, ancak kulvar başına beş larva tipik olarak yüzme hızının en doğru şekilde izlenmesini kolaylaştırmak ve deney başına ihtiyaç duyulan larva sayısını azaltmak için kullanılır, şeritleri yumurta suyu ile doldurun, deneye bağlı olarak farmasötik veya toksik maddeler olsun veya olmasın. Taşmayı önlemek için görüntüleme kabinlerine yerleştirilene kadar şeritleri tamamen doldurmayın.

İklimlendirme döneminden sonra larvaların alışması için 10 dakika bekleyin. Dört plakayı elinizle doğrudan dizüstü bilgisayar ekranının üzerine yerleştirin. Şu anda, şeritlerin kenarlarındaki gölgeleri ortadan kaldırmak için şeritler yumurta, su veya kimyasal işlemle doldurulabilir, böylece şeridin üst kısmı ile aynı hizada olur.

Görüntülerde, bilgisayarı hızlandırılmış fotoğrafçılık için programlayın ve deney başına toplam 300 görüntü için her altı saniyede bir fotoğraf çekin. Video hızında görüntüleme için kamerayı daha düşük bir çözünürlüğe ayarlayın. Daha düşük çözünürlük, kayıtları tek bir çok kuyulu plaka ile sınırlar.

Video kayıtları, hızlı yüzme olaylarını görüntülemek için uygundur. Bu gösteride larvalar için caydırıcı bir uyaran olarak bir PowerPoint sunumu kullanın. PowerPoint, 15 dakika boyunca boş beyaz bir arka planla başlar, ardından plakanın üst yarısında 15 hareketli kırmızı çubuk gelir.

Aros şeritleri içindeki sıvının buharlaşmasını önlemek için, maksimum görüntüleme süresini bir saatin altında tutun. Bu gösterimde resim J ile görüntüleri açın. Beş şeritli larva analizi için şirket içi bir makro kullanılır ve herhangi bir kullanıcının kullanımına sunulabilir.

Görüntü sayısı ve çıkarılacak renk gibi parametreleri ayarlamak için makrodaki istemleri kullanın. Makro daha sonra renk kanalını otomatik olarak böler, böylece kırmızı renk kaldırılabilir. Arka planı çıkarır, bir eşik uygular ve partikül analizi ile larvaları tanımlar.

Tüm görüntüler görüntü J Makrosu üzerinden çalıştırıldıktan sonra, bir sonuç dosyası görüntülenecek ve görüntü numarası ve şerit numarası ile birlikte her görüntü için tek tek larvaların XY koordinatlarını içerecektir. Sonuç dosyasını Excel biçiminde kaydedin ve boş arka plana karşı hareketli çubuk arka planına ve ardından kuyu numarasına göre sıralayın. Larvaların kuyucuklardaki yerleşimini, larvalar arasındaki mesafeyi, hareket hızını ve dinlenme miktarını otomatik olarak belirlemek için yerleşik denklemlere sahip bir Excel şablonu kullanın.

Cretin laboratuvarında oluşturulan en güncel Excel şablonu, istek üzerine, tedavi grupları ve kontroller arasında karşılaştırma için T-testi ile birlikte, Excel sayfasına çeşitli tedavi gruplarını gösteren grafikler oluşturun. SPSS istatistik programı kullanılarak daha fazla istatistiksel analiz yapılabilir. Sonuçlar, organik olmayan gıdalarda yaygın olarak bulunan bir organofosfat pestisitin kontrolleri ve değişen konsantrasyonları olarak yumurta suyu ve DMSO ile muamele edilen larvalar için gösterilmiştir.

Burada beyaz çubuklar, boş bir arka plana maruz kalan larvalardan gelen verileri gösterir ve kırmızı çubuklar, kırmızı hareketli çubuğa maruz kalan larvalardan gelen verileri gösterir. Kontrol. Yumurta suyunda yetişen larvalar, hareketli kırmızı çubukla sunulduktan sonra tabağa düşme tercihinin arttığını gösterir. Larvalar, çeşitli farmasötikleri ve toksik maddeleri 1000 x stok çözeltileri olarak çözmek için yaygın olarak kullanılan bir çözücü olan DMSO'nun mililitresinde bir mikrogram içeren yumurta suyunda büyütüldüğünde de benzer sonuçlar elde edilir.

Grafikler, şeritteki larvaların yüzdesi, şeridin sonundaki larvaların yüzdesi, şeridin kenarındaki larvaların yüzdesi, balıkların yüzme hızı arasındaki mesafe dahil olmak üzere davranışsal analizden elde edilebilecek ölçümleri göstermektedir. larvaların hızı ve larvaların dinlenme süresi. Gösterilen sonuçlar bir deneyden alınan bir örneklemedir. Bununla birlikte, tekrarlandığında, sonuçlar, yüzme hızının ve figma davranışının, insan gıdasındaki seviyeleri taklit eden düşük konsantrasyonlarda organofosfat pestisitler tarafından değiştirildiğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, görüntüleme ve görüntüleme analizi, uygun şekilde yapılırsa bir buçuk saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürün en önemli yönü, her gün yeni ortamla değiştirerek kültürel ortamı temiz tutmayı hatırlamaktır.