Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, gram-negatif bakterilerin dış yüzeyinden lipopolisakkarit izole etmek ve tandem MS protokolleri kullanarak lipid A kısmını yapısal olarak karakterize etmektir. Bu işlem, lipopolisakkaritin bakteri hücre yüzeyinden kimyasal ekstraksiyonu ve ardından lipid A'yı lipopolisakkaritin polisakkarit kısmından serbest bırakmak için gerçekleştirilen hafif asit hidrolizi ile sağlanır. İkinci adımda, lipid A çözeltisi elektrospray iyonizasyon MSMS ile analiz edilir.

Prosedürümüzde, lipid A'nın yapısal karakterizasyonu için çarpışma kaynaklı çözünme veya ultraviyole fotodisosyasyon tabanlı MS MS yöntemiyle analiz yapılır. Sonuçlar, çarpışma kaynaklı çözünme veya ultraviyole fotodisosyasyon tabanlı MS MS protokollerinden elde edilen kütle spektrumlarındaki fragmantasyon modellerinde farklılıklar olduğunu ve UVPD'nin daha bilgilendirici bir fragmantasyon modeli sunduğunu göstermektedir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tandem kütle spektrometrisinin diagnostik fragmantasyon modellerinin yorumlanmasına dayanarak hedef analitlerin aydınlatılmasına olanak tanımasıdır.

Ultraviyole fotodisosyasyon, özellikle çarpışma ile indüklenen disosyasyon gibi mevcut tekniklere kıyasla daha çeşitli fragman iyonları üreten yüksek enerjili bir MSMS yöntemidir. Kullanılan UVPD kütle spektrometrisi yöntemi henüz ticarileştirilmediği için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Ayrıca, bu işlem başlatılmadan önce yöntem, özel modifikasyonlar aracılığıyla bir kütle spektrometresine entegre edilmiş bir lazer kullanmaktadır.

250 ml'lik bir bakteriyel kültürden hücreleri hasat edin ve hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 10,000 ×g kuvvetinde santrifüjleyin. Ardından medya süpernatantını dökün ve hücre peletini 50 ml 1X PBS ile yıkayın. Hücreleri yeniden peletlemek için santrifüjledikten sonra süpernatantı dökün.

Ardından, hücreleri 40 ml 1X PBS içerisinde yeniden süspanse edin ve iki adet 250 ml'lik Teflon santrifüj tüpüne paylaştırın. Tek fazlı bir karışım elde etmek için her tüpe 25 ml kloroform ve 50 ml metanol ekleyin. Ters çevirerek karıştırın ve oda sıcaklığında en az 20 dakika inkübe edin.

Tam hücre lizini sağlamak için karışımı oda sıcaklığında 2000 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın. LPS peletini yaklaşık 100 ml tek fazlı Bly dire karışımı ile yıkayın. 2000 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın.

LPS pelletine 27 ml hafif asit hidroliz tamponu ekleyin ve sadece küçük partiküller kalana kadar pipetajla karıştırın; homojen bir şekilde yeniden süspande etmek için prob uçlu sonikatör ile sonikasyon uygulayın. LPS pelletini, %50 çıkış gücünde, sabit bir görev döngüsünde 20 saniye boyunca çözeltide süspande edin. Numunenin sonikasyon işlemini, her patlama 20 saniye sürecek ve patlamalar arasında yaklaşık beş saniye ara verilerek iki kez tekrarlayın.

Ardından numuneleri bir benmari banyosunda 30 dakika boyunca kaynatın. Tüpleri benmari banyosundan çıkarın ve numunelerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Hidroliz sonrası lipid A ekstraksiyonuna geçmeden önce; inversiyonla karıştırılmış ve santrifüjlenmiş bir kloroform metanol, hafif asit hidroliz tamponu karışımı için 30 ml kloroform ve 30 ml metanol ekleyerek SDS çözeltisini iki fazlı bir BLY direkt karışımına dönüştürün.

S örneğini 2000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Bir cam pipet kullanarak, alt fazı temiz bir Teflon santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, önceden dengelenmiş iki fazlı bir karışımın 30 ml alt fazını örnek tüpündeki üst faza ekleyip ters çevirerek karıştırın ve 10 dakika boyunca 2000 ×g'de santrifüjleyerek ikinci bir ekstraksiyon gerçekleştirin. Alt fazı cam pipetle çekin ve daha önce ekstrakte edilen alt faz ile birleştirin.

114 ml önceden dengelenmiş BLYdire üst faz ekleyerek birleştirilmiş alt fazları yıkayın; ters çevirme yöntemiyle karıştırarak iki fazlı bir BLYdire karışımı oluşturun ve santrifüjleyin. Cam transfer pipetiyle 10 dakika boyunca 2000 ×g ile santrifüjleyin. Alt fazı temiz bir cam döner evaporatör balonuna aktarın ve örneği döner evaporasyon kullanarak kurutun.

Ardından, döner balona beş ml kloroform metanol karışımı ekleyin ve balonun kenarlarındaki lipid A'nın süspansiyonuna yardımcı olmak için en az 30 saniye boyunca sonikasyon banyosunda tutun. Lipidi, A-P-T-F-E astarlı fenolik vidalı kapaklı temiz bir cam tüpe aktarmak için cam transfer pipeti kullanın.

Numuneyi bir nitrojen kurutucu kullanarak nitrojen akımı altında kurutun. Kurutulmuş lipidi bir ml kloroform metanol karışımında yeniden süspande edin. Solvent eklendikten sonra, tam yeniden süspansiyonu sağlamak için karışımı vorteksleyin.

Küçük bir cam numune şişesine aktarın ve azotlu kurutucu kullanarak kurutun. Kurutulmuş numuneyi, sonraki TLC veya MS analizine kadar -20 °C'de saklayın. Numune, sonraki analize kadar -20 °C'de saklanabilir.

Numune hazırlandıktan sonra, boş küçük bir cam numune şişesinde 200 µL HPLC sınıfı metanol ile 200 µL HPLC sınıfı kloroformu karıştırın; kloroform metanol çözücü karışımından 200 µL'yi lipid A içeren şişeye aktarın ve şişe içeriğini beş dakika boyunca veya tüm materyal çözünene kadar sonikasyona tabi tutun. Ardından kütle spektrometresini negatif mod elektrosprey iyonizasyon için ayarlayın ve 250 µL'lik bir şırıngayı lipid A çözeltisiyle doldurun.

Şırıngayı bir şırınga pompasına yerleştirin ve seyreltilmiş lipidi doğrudan infüze edin. Örneği dakikada 2,0 ila 3,5 microliters akış hızında uygulayın. İyon optiğini ayarlayarak lipid iyon sinyalini optimize edin ve artırın.

Lipidin kütle spektrumunu toplayın. Bir tür izole edin ve MSM yöntemi olarak CID'yi seçerek hedef lipid A'yı aktive edin. Ardından, öncül lipid parçalanana kadar CID voltajını veya normalize edilmiş çarpışma enerjisini artırın.

Bir türün göreceli bolluğu, en yüksek ürün iyonuna kıyasla yaklaşık %10 olduğunda, yeterli sinyal-gürültü oranı elde edilene kadar spektrumları toplayın ve ortalamasını alın. Ürün iyonları için, numuneyi ve kütle spektrometresini önceki bölümde açıklandığı şekilde hazırlayın. Kütle spektrometresine bağlı lazeri açın.

MS detayları için metin protokolüne bakınız; iyonlar HCD hücresine girdiğinde lazerin eksimer lazerini tetiklemesi için cihaz yazılımını ayarlayın, ardından lazerin her iki milisaniyede bir darbe vermesi için darbe jeneratörünü açın. MS MS yöntemi olarak HCD'yi seçerek bir lipid öncül iyonunu izole edin ve çarpışma enerjisini %1 normalize edilmiş çarpışma enerjisine ayarlayın; lazer enerjisini artırarak ve lazer darbe sayısını (genellikle on adet 6 mJ darbe) ayarlayarak izole edilen lipid iyonunu aktive edin. Son olarak, yeterli sinyal-gürültü oranı elde edilene kadar spektrumları edinin ve ortalamasını alın.

UVPD ürün iyonları için; E. coli K 12 suşu W 3 110'dan elde edilen lipid A'nın negatif iyon MALDI TOF kütle spektrumu, temel gözlemlenen tür olarak 1796.2 kütle/yük oranında tek bir deprotone tür verir. MALDI-TOF analizinin ayrıntıları metin protokolünde tartışılmıştır.

Alternatif olarak, aynı lipid örneğinin negatif mod ESI'ya tabi tutulması, 898,1 ana yük oranında ağırlıklı olarak çift deprotonasyona uğramış lipid iyonları verir; 1796,20 ana yük oranında tek deprotonasyona uğramış lipid iyonları gözlemlenebilir ancak çift deprotonasyona uğramış türlere göre göreli bollukları daha düşüktür. CID veya 193 nanometre UVPD ile tek deprotonasyona uğramış lipid iyonunun fragmantasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu teknikler, özellikle lipidlerin kimyasal yapılarını daha iyi belirlemek için kullanılabilir.

Karmaşık modifikasyon kombinasyonları içeren veya daha önce karakterize edilmemiş kimyasal modifikasyonlara sahip bir tür. Fragmantasyon profilleri, kesilme bölgelerini temsil eden kesik çizgilerle gösterilmiştir ve her bir yapı verilen altındaki ana yük oranı değerleriyle eşleştirilmiştir. Kırmızı yazı tipiyle vurgulanan ana yük oranı değerleri ve kesilme bölgeleri, UVPD 32 P işaretli lipid ile ilişkili benzersiz ürün iyonlarını temsil eder.

İki farklı E. coli K12 suşundan izole edilen Lipid A, TLC ile analiz edilmiştir. Bu işlem için izlenecek protokol, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. K12 W3110 suşu çoğunlukla bisfosforile ve trisfosforile lipid A içerir veya 32P lipid ile daha karmaşık bir TLC paterni gözlemlenir.

E. coli WD 1 0 1 suşundan izole edilen A. WD 1 0 1 lipid üretir. Rabino ve fosfoetanolamin ile yoğun şekilde modifiye edilmiştir.

Hem bir hem de dört prim fosfat modifikasyona açık olduğundan, WD 1 0 1'den elde edilen lipid A, herhangi bir fosfatta yalnızca bir el amino arabinoz veya fosfoetanolamin içeren tekli modifiye veya her iki fosfatın kombinatoryal bir şekilde modifiye edildiği çiftli modifiye olarak tanımlanabilir. Bir ve dört prim fosfatlardaki modifikasyonlara ek olarak, palmitat eklenmesi de gözlemlenmiş olup bu çözücü sistemindeki lipid a türlerinin RF değerini artırmaktadır. Bu protokol, mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların, lipid a modifikasyonlarının gram-negatif bakterilerin biyolojisini nasıl etkilediğine ilişkin yapı-fonksiyon ilişkilerini daha derinlemesine incelemelerinin önünü açmıştır.

Ayrıca, glikanlar, proteinler, nükleik asitler ve diğer kompleks lipidler gibi biyolojik açıdan önemli moleküllerin yapılarını karakterize etmek için UVPD tabanlı MS'in gücüyle oldukça ilgilenmekteyiz ve bunu kanıtlamış bulunmaktayız. Organik çözücüler, biyolojik olarak tehlikeli materyaller ve lazerlerle çalışmanın son derece riskli olabileceğini unutmayın. Çözücülerin havalandırmalı kimyasal çeker ocaklarda kullanılması gerektiğinin vurgulanması önemlidir.

Eldiven ve koruyucu gözlük gibi uygun koruyucu ekipmanlar her zaman kullanılmalı ve UVPD için kullanılan lazer uygun şekilde ekranlanmalıdır.