Arasında Cephalic Kompleksi Genetik İndüksiyon ve Benign ve İnvaziv vizüalizasyonun için Protokol Drosophila melanogaster

Bu prosedürün genel amacı, drosophila'da iyi huylu ve invaziv tümörleri indüklemek ve daha sonra larva sefalik kompleksini diseke ederek bunları görselleştirmektir. Bu, istenen suşlar arasında kurulum yapmak ve invaziv veya iyi huylu tümörleri taşıyan larva dölünü izole etmekle başlar. Bir sonraki adım, seçilen larvaları incelemektir.

Sefalik kompleksi önce üçte ikisini keserek, sabitleyerek ve sonra ters çevirerek ortaya çıkarmak. Daha sonra yağ, vücut ve bağırsak dokuları temizlenir ve daha sonra ventral sinir kordonuna ve larva epidermisine hala bağlı olan sinirler de kırılır. Son adım, sefalik kompleksi görüntülemek veya aşağı akış uygulamaları için düzeltmektir.

Sonuç olarak, sonuçlar floresan mikroskobu kullanılarak GFP etiketli invaziv veya iyi huylu tümörleri gösterebilir. Bu yöntem, kanser biyolojisindeki bazı önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, sağlam bir organizmada hangi genlerin tümörlerin ilerlemesini engelleyebileceğini anlamak isteyebilirsiniz.

Gerekli genetik stoklar elde edildikten sonra, test cihazı suşunun bir başlangıç kültürünü hazırlayın. Ayrıca test edilen stok için bir başlangıç kültürü hazırlayın. Test stoğundan 10 dişi bakireyi, test edilen stoktan 10 erkekle çaprazlayın.

Sineklerin çiftleşmesine ve 25 santigrat derecede 24 ila 48 saat yumurta bırakmasına izin verin ve ardından daha fazla döl üretmek için onları taze bir şişeye aktarın. Yumurtalar ve ilk instar larvaları için çapraz şişeleri izleyin. Yeni bir haç ayarlayın.

Toplanan şişeler zayıf yumurta birikimi gösteriyorsa. Toplanan şişeler kurumaya başlarsa, kültürü nemli tutmak için sadece üç ila dört damla otoklav damıtılmış su ekleyin. Dolaşana kadar şişeleri izlemeye devam edin.

Üçüncü instar larvaları mevcuttur. Daha sonra bunları bir floresan stereo mikroskobu altında izlemeye devam edin. Aynı prosedürü kullanarak, listelenen stokları kullanarak invaziv tümörleri taşıyan sinekleri kültür günü beş veya altıncı güne kadar toplayın, dolaşan üçüncü instar larvaları iyi huylu tümör kültürlerinden elde edilebilir.

Bununla birlikte, invaziv tümör kültürlerinden 10. güne kadar mevcut olmayacaklardır. Üçüncü instar larvalarını toplamak için, ince bir boya fırçasını damıtılmış suyla ıslatın ve şişenin duvarından kazıyın. Larvaları soğuk bir XPBS ile bir çöküntü slaytına yerleştirin ve ardından ıslak bir boya fırçası kullanın.

Epidermislerinden herhangi bir yiyecek maddesini kazıyın. Birkaç dakikalık immobilizasyon için larvaları 30 dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede tabağa yerleştirin. Daha uzun bir immobilizasyon süresi için, larvaları bir değnek üzerinde sadece sinek şekerlemesi olan bir kültür şişesine yerleştirin.

Kültür şişesini tıkayın ve 40 dakika bekletin. Daha sonra, hareketsiz hale getirilmiş larvaları bir cam slayta aktarın. Bir damla hafif halo karbonhidrat yağı ekleyin ve larvaları bir kapak camı ile örtün.

Şimdi, larvaları floresan stereo mikroskop altında gözlemleyin. GFP ifadesi için yeşil floresan larvaları seçin ve diseksiyona devam edin. İyi huylu tümör taşıyan larvalar, sefalik kompleksin bulunduğu ön bölgede yeşil renkte floresan renk verir.

İnvaziv tümörler ayrıca sefalik kompleksteki larvaların ön bölgesinde yeşil renkte floresan yayacaktır. Mümkünse, floresan tümörleri fotoğrafla belgelediğinizden emin olun. Bu nedenle larvaların yarı saydam epidermisi, tümörlerin göç derecesini gözlemlemeyi zorlaştırır ve bu yüzden tümörleri incelememiz gerekir.

Her iki tümörle birlikte taze bir larvayı transfer etmek için forseps kullanarak başlayın. Bir mililitre soğuk bir XPBS içeren bir diseksiyon kabının kuyusuna yazın. Larvaları, ön uçtan yaklaşık üçte iki mesafenin üçte ikisinde bir çift forseps kullanarak tutun.

Başka bir forseps çifti kullanarak, larvaların arka üçte birini akıllıca ayırın ve atın. Daha sonra ön üçte ikisini bıraktı. Larvaların içindeki basınç serbest bırakıldıkça, içeriği vücut boşluğundan dışarı sızacaktır.

Forseps kullanarak, vücut boşluğundan sızan dokuları çıkarın. Daha sonra, larvaların ağız kancasını tutun ve larva epidermisine itin. Diğer forseps çiftini kullanarak larvaları tamamen ters çevirin.

Şimdi forseps ile, nazikçe ve dikkatli bir şekilde, yağ gövdesini, tükürük bezlerini, bağırsakları, kanat diski kompleksini ve trakeal tüpleri çıkarın. Sefalik kompleks artık ağız kancasına bağlı olarak görülebilir. Beyin yarım küreleri ve VNC, VNC'den çıkan sinirler yoluyla larva epidermisine hala bağlıdır.

Forseps ile bu bağlantıları nazikçe kırın. Ardından, sefalik kompleksin net bir şekilde görünür hale gelmesi için fazla yağ gövdesini veya diğer dokuları çıkarın. Ağız kancalarında larva epidermisine bağlanır.

Görselleştirmeden önce daha fazla işlem için sefalik kompleksi olduğu gibi bırakın. Aksi takdirde, sefalik kompleksi doğrudan görselleştirmek için, onu epidermisten ayırın ve vektör kalkanı gibi bir damla gliserol bazlı montaj ortamına yerleştirin. Tarif edilen protokol kullanılarak, gözde tümörler indüklendi.

Anin diski, iyi huylu tümörler indüklendikleri göz anin diskine lokalize kalmıştır. GFP işaretli dokunun, 10 günlük bir larva büyümesinden itibaren invaziv tümörler taşıyan sefalik kompleksteki ventral sinir kordonu gibi bitişik organlara göç etmediğine dikkat edin. Ayrıca, kırmızı okun işaret ettiği gibi, tümörler VNC ve ağız kancaları gibi bitişik organları istila etti.

Bu videoyu izledikten sonra, iyi huylu ve invaziv tümörlerin genetik olarak nasıl indükleneceğini iyi anlamalı ve daha sonra sefalik kompleksi intra ano gastro diseksiyon yaparak bunları görselleştirmelisiniz.