İnsan THP-1 Makrofajlarında Candida glabrata'nın Hücre İçi Davranışını İncelemek İçin İn vitro Sistemin Kurulması

Bu prosedürün genel amacı, bir insan fırsatçı mantar patojeninin hücre içi davranışını incelemek için bir in vitro kültür modeli sistemi oluşturmaktır. İnsan monositik hücre hattı TP'den türetilen makrofajlarda Canida lab ratta. Bu THP'yi elde etmek için, bir monosit önce onları makrofajlara ayırmak için dört ester ile muamele edilir.

Daha sonra, bir makrofaj, enfeksiyondan iki saat sonra canida GTA hücreleri ile enfekte olur. Fagositoz olmayan canida GTA hücreleri PBS yıkayıcıları ile uzaklaştırılır ve hücre içi e hücreleri, enfekte makrofajların ozmozu ile daha ileri çalışmalar için geri kazanılır. Bu protokol, hem makrofajlardaki viral to-canida GTA hücrelerini hem de candida GTA enfeksiyonu üzerine makro FIDS'de faiz maturasyonu Ross ve THP'deki sitokin yanıtını değerlendirmek için kullanılabilir.

Ek olarak, bu protokol, TSP bir makrofajlarda değiştirilmiş sağkalım profilleri için candida işbirlikçi mutant kütüphanesini yarı yüksek verimli bir şekilde taramak için ölçeklendirilebilir. Bu protokolün ana avantajı, nispeten ucuz olması, yüksek oranda tekrarlanabilir olması ve farklı bağışıklık hücrelerine ve mantar patojenlerine kolayca adapte olabilmesidir. Enfeksiyondan iki gün önce Prosedüre Başlamak için, THP ve monositik hücreleri birinci gün% 80 CO'ya getirin, kültür riskini çıkarın ve tüm ince hücreleri süspansiyona getirmek için yavaşça, nazikçe alın.

DHP bir monosit hücre süspansiyonunu 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Santrifüj: Hücre süspansiyonu: oda sıcaklığında dört dakika boyunca, 1000 RPM'de, Ortamı, beş ml ön API ortamında bir atık kabına, tüpe ve reus'a boşaltın. Ortamı üç dört kez nazikçe pipetleyerek THV bir hücre peletini askıya alın.

Bir hemo sitometre kullanarak hücre yoğunluğunu belirlemek için hücre süspansiyonunun 10 Mikrolitresini alın ve hücre yoğunluğunu ml başına 1 milyon hücreye ayarlayın. Hücre süspansiyonuna bir adet 60 mikromolar PMA stok çözeltisinden bir mikrolitre ekleyin, böylece nihai konsantrasyon 16 ano molar olur ve iyice karıştırın. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 1 milyon hücreye karşılık gelen bir ml hücre süspansiyonu dağıtın ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de ayarlanmış bir inkübatöre aktarın.

12 saatlik inkübasyondan sonra eski ortamı atın. Her kuyucuğa bir ml pre RPI ortamı ekleyin ve plakayı 12 saat daha inkübe edin. Bu hücreler, daha sonra gösterilecek olan Kanada Enfeksiyonu için kullanılacaktır.

Uygun mikrobiyolojik uygulamaları kullanarak, tek bir EA kolonisini ML YPD ortamı içeren bir flass içine aşılayın. İnkübasyon santrifüjünü takiben 30 Santigrat Dereceye ayarlanmış bir inkübatörde flass 14 ila 16 saat inkübe edin. Beş dakika boyunca 4.000 RPM'de bir ML Kültürü.

Sütü atın ve kabukları steril PBS ile üç kez yıkayın. Yıkama tamponunu attıktan sonra, hücre paletini nazikçe pipetleyerek bir ml steril PBS'de askıya alın. Daha sonra, 600 nanometrede bir spektro fotometrede hücre süspansiyonunun absorbansını ölçün ve hücre yoğunluğunu PBS ile ml başına 2 milyon hücreye ayarlayın.

Hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini alın ve yüz kat seyreltin PBS yayma plakasında YPD AGA ortamında yüz mikrolitre kültür. Plakayı 30 santigrat derecede inkübe edin ve bir veya iki gün sonra YPD plakasında görünen koloni sayısını sayın, sıfır saatlik koloni oluşturan birimleri hesaplamak için bu sayıyı uygun seyreltme faktörü ile çarpın. Kanada Reta'nın bu birçok koloni oluşturan birimi, makrofajlar üzerindeki DHE'yi enfekte etmek için kullanılacaktır.

Bir sonraki Adımda, 24 balina kültürü plakasındaki makrofaj mono tabakasına 50 makro Litre Kanada clater hücre süspansiyonu ekleyin. Her bir hücreyi eşit olarak dağıtmak için plakayı topraklayın ve iki saatlik inkübasyondan sonra 37 santigrat derecede inkübe edin. Kültür Plakasını bir kaba ters çevirerek ml seri PBS'de kültür Plakasının her bir kuyucuğuna kuyu kuyularının kenarı boyunca dikkatlice dikkatlice atın ve tamponu atın.

Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, İlk kuyu dışında, iki saatlik makrofaj enfeksiyonundan sonra hücre içi e hücrelerini kurtarmak için enfeksiyondan 4, 6, 12 ve 24 saat sonra kandida hücrelerinin hücre içi replikasyonunu izlemek için kullanılabilen diğer tüm kuyucuklara bir ML RPI ortamı ekleyin, fosa bir ML tahıl suyu ekleyin. İki dakika sonra, kuyunun makrofaj kalıntılarını çıkarmak için bir ML piper ucuyla kuyuyu nazikçe kazıyın.

Kuyuyu durulayın ve bir makro santrifüj balık tüpünde toplayın. PBS'de yüz kat seyreltilmiş microFIT hücre lizatı hazırlayın ve YPD AGA ortamında yüz mikrolitre plakalayın. Plakayı bir ila iki gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve koloni oluşturan birimlerin sayısını sayın.

İki saatlik enfeksiyondan sonra Fagositoz olan kanida ator hücrelerinin sayısını T iki ve makrofajlarla numaralandırmak için bu sayıyı uygun seyreltme faktörü ile çarpın. Benzer şekilde, hücre içi kanida ator hücrelerin sayısı farklı zaman noktalarında belirlenebilir. Enfeksiyon sonrası ve hücre içi replikasyon, burada gösterilen iki saatte içselleştirilen CFU'lara kıyasla 24 saatte bir artış olarak temsil edilebilir.

Tipik bir deneyin diğer sonuçları, bir makrofajın TV'ye enfekte olduğu toplam canida timsah hücresi sayısının altı çarpı 10, dörtte iki olduğu. İki saatte kurtarılan hücre sayısı 3.7, altı çarpı 10.4'tür. Böylece, e hücrelerinin 24 saatlik birlikte inkübasyon süresi boyunca% 62.66 oranında fagosite edildiğini göstermektedir.

Hücre içi e hücrelerinin sayısı 3.76 kat 10.4'ten 1.96 kat 10.5'e yükseldiği için 5.2 kat replikasyon dışındaki tüm hücreler olabilir mi? Bu deneyde, canida TER hücrelerinin hücre içi replikasyonu, bunun için konfokal mikroskop ve GFP eksprese eden E hücreleri kullanılarak da değerlendirilebilir. 24 kuyulu kültür plakası için daha önce açıklanan protokolü kullanarak THV ve makrofajları dört odacıklı bir slaytta hazırlayın ve enfekte edin.

Enfeksiyondan iki saat sonra. Slaytı, slaytın her bir haznesine 500 mikrolitre PBS'de bir atık kabına ters çevirerek ortamı atın. İyice durulayın ve PBS'yi atın.

Hücreleri sabitlemek için bu adımı 500 mikrolitre% 3.7 resmi yükseklikte iki kez daha tekrarlayın. Slaytı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin ve resmi de Yükseklik. Beş dakikalık inkübasyondan sonra 500 mikrolitre triton X'te Makrofajları mobilize etmek için her kuyu fiyatını 500 mikrolitre PBS ile yıkayın, Triton X'i çıkarın, kuyu vuruşunu PBS ile yıkayın.

Bir hazne çıkarma ve hava sürücüsü sürgüsü kullanarak hazne sürgüsünü dikkatlice sökün. Sürgünün her sektörüne bir damla DPI içeren vektör Kalkanı montaj ortamı yerleştirin, bir kapak fişi takın ve kenarları konfokal mikroskop altında tırnak boyası ile görselleştirilmiş hücrelerle kapatın. Burada, vahşi tip canida laboratuvar hücrelerini eksprese eden GFE ile enfekte olmuş bir makrofajın temsili konfokal görüntüleri gösterilmiştir, hücre içi e hücrelerinin sayısında iki ila 24 saat arasında yaklaşık altı kat artış, TP'de canida laboratuvar replikasyonunun göstergesidir, bir makrofaj imza etiketi mutajenez yaklaşımı, çok sayıda mutantın benzersiz oligonükleotid yoluyla büyüme kusurları açısından aynı anda tarandığı mikrobiyal patojenlerdeki ülans faktörlerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır sıra etiketi.

Burada, aşağıdaki üç adımdan oluşan Kanada Kütüphanesi ve mutant kütüphanesinin STM ekranı için protokolümüzü açıklıyoruz. İlk 96 plazmit. Her biri benzersiz bir oligonükleotid dizisi yığını barındıran bir naylon membran üzerinde hareketsiz hale getirilir.

İkinci adımda, 96 CANIDA ator mutanttan oluşan bir havuz, THV bir makrofajlarda değişen sağkalım profilleri için taranır, ardından sırasıyla girdi ve çıktı örnekleri olarak adlandırılacak olan YPD, büyümüş ve makrofaj içselleştirilmiş mutant e hücrelerinin geri kazanılması izlenir. Son olarak, DNA imza etiketleri, giriş ve çıkış genomik DNA örneklerinden PCI amplifiye edilir ve radyo etiketidir. PCR ürünü, benzersiz etiketlere hibritleştirilir ve zar üzerindeki radyoaktif sinyaller ölçülür ve analiz edilir.

96 12 noktalı pano aparatını monte etmek için, nemli bir değiştirilebilir rüzgar ağacı kağıdının üzerine ıslak bir naylon membran yerleştirin ve ünitenin vidalarını sıkın. Membranı steril suyla yıkayın, ardından 0.4 mu sodyum hidroksit ile yıkayın. 200 nanogram PLA BDNA çözeltisini 96 12 bloktan 0.4 molar sodyum Hidroksit yıkamasının ardından nokta kan uygulamasının karşılık gelen kuyularına aktarın.

Aktarılan plazma BDNA'yı bir UV çapraz bağlayıcıda zara geçen iki XXSC'de bir feranstan sonra zarı nokta kan aparatından çıkarın. Membran, anten ön hibridizasyon, tampon ve giriş ve UNE şişelerinde 42 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edilir. Giriş ve çıkış hücre paletlerinden ekstrakte edilen genomik DNA'yı ve benzersiz Etiketlerin ters çevrilmiş yan bölgesine karşı primerleri kullanarak PCR ile radyo seviyesi probları hazırlayın.

Radyo etiket problarını 99 Santigrat derecede beş dakika boyunca denatüre edin ve jeli buzun üzerine oturtun. De problarını giriş ve çıkış şişelerine aktarın ve 42 santigrat derecede 14 ila 16 saat inkübe edin. Hibridizasyon sonrası.

Giriş ve çıkış membranlarını protokolde anlatıldığı gibi yıkayın. Membranları şişelerden çıkarın, havayla kurutun ve bir fosfo görüntü ekranına maruz bırakın. İki ila üç saat sonra fosforlu ekranı tarayın ve görüntü elde edin.

Bu örnekte, değişmiş sağkalım için 96 canida Gatory mutantından oluşan bir havuzun taranmasını temsil eden iki hibritleştirilmiş membran filtresi gösterilmiştir. Bu durumda, bir makrofajın nicelleştirilmesi ve çıktıdaki her bir noktanın sinyal yoğunluğunun giriş zarına oranının belirlenmesi, 13, 26, 75 ve 85 etiket numaralarının çıktıda yeterince temsil edilmediğini ortaya çıkardı. Bu yığınlar kırmızı ile çevrelenmiştir ve dört farklı mutantın büyümesini yansıtır.

Buna karşılık, mutantlar, yeşil renkle vurgulanan benzersiz diziler 11 ve 81 ile yığın, çıktı örneğinde aşırı temsil edilir. Başka bir deyişle, bu ekrandan 96 mutanttan oluşan havuz, iki mutantın hayatta kalma oranını artırması gerekirken, dört mutantın makrofajlarda büyüme göstermesi gerekiyor. Böyle bir havuz ekranında tanımlanan değiştirilmiş sağkalım fenotipleri, tek enfeksiyon testlerinde doğrulanmalıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz mantar patojeninin intra büyüme profilini incelemek için in vitro oral sistemin nasıl uygulanacağını iyi anlamalısınız. Ek olarak, artık sistemi kullanarak büyük ölçekli mutant havuz taraması yapabilmelisiniz.