Name: İnsan THP-1 Makrofajlarında Candida glabratanın Hücre İçi Davranışını İncelemek İçin İn vitro Sistemin Kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Keşfedin, Candida glabrata'nın insan THP-1 makrofajlarındaki hücre içi davranışını incelemek için in vitro bir kültür modeli kurmayı. Bu yöntem, fungal virülans mekanizmalarını ve makrofaj yanıtlarını değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Departmanı ve Haydarabad'daki DNA Parmak İzi ve Teşhis Merkezi'nin çekirdek fonları tarafından Yenilikçi Genç Biyoteknoloji Ödülü BT/BI/12/040/2005 ve BT/PR13289/BRB/10/745/2009 hibesi ile desteklenmiştir. MNR ve GB, Manipal Üniversitesi'nde doktora derecesi almak için Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi'nin Genç ve Kıdemli Araştırma Burslarının alıcılarıdır. SB, Manipal Üniversitesi'nde doktora derecesi almak için Biyoteknoloji Bölümü'nün Genç ve Kıdemli Araştırma Bursu'nun alıcısıdır.

C. glabrata enfeksiyon deneylerinin biyogüvenlik muhafaza seviyesi 2 (BSL-2) olan bir laboratuvarda yapılması önerilir.
<ol>
	<li>THP-1 makrofaj tek tabakasının hazırlanması.</li>
	<li>C. glabrata hücre süspansiyonunun hazırlanması.</li>
	<li>THP-1 makrofajlarının C. glabrata hücreleri ile enfeksiyonu.</li>
	<li>Koloni oluşturan birim testi ile fagositoz hızı ve hücre içi replikasyonun ölçülmesi.</li>
	<li>Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak hücre içi replikasyonun izlenmesi.</li>
</ol>
1. THP-1 Makrofaj Tek Tabakasının Hazırlanması
<ol>
	<li>THP-1, akut monositik lösemi14'ten muzdarip 1 yaşındaki bir erkek çocuğun periferik kanından türetilen bir insan monositik hücre hattıdır. Bir süspansiyon hücre hattı olan THP-1, %10 FBS (fetal sığır serumu) ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamında nemlendirilmiş %5 CO2'de rutin olarak 37 ° C'de tutulur. Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA, bir forbol ester) ile tedavi, THP-1 monositik hücrelerin makrofajlara terminal farklılaşmasına neden olur. Daha da önemlisi, PMA tedavisi hücre canlılığını etkilemez ve farklılaşmış hücreler bölünmez.</li>
	<li>RPMI-1640 tam ortamında (% 10 serum, 2 mM glutamin ve 1x antibiyotik ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamı) 100 mm'lik kültür kaplarında yaklaşık 1.5 x10 6 THP-1 monositlerini tohumlayın ve hücrelerin 2 gün boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de büyümesine izin verin.</li>
	<li>THP-1 hücreleri 8 x 105 hücre / ml yoğunluğa ulaştığında, kültür kabını hücre kültürü laminer akış başlığına aktarın ve çökelmiş hücreleri yeniden süspanse etmek için hafifçe döndürün.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu pipetleyin, 15 ml'lik steril bir tüpe yerleştirin ve 1.000 rpm'de (130 x g) 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve THP-1 hücre peletini 5 ml taze, önceden ısıtılmış, RPMI-1640 tam ortamda askıya alın.</li>
	<li>Hücreleri bir hemositometre ile numaralandırın ve hücre süspansiyonunu önceden ısıtılmış RPMI-1640 tam ortam ile 106 hücre / ml'lik bir nihai yoğunluğa seyreltin</li>
	<li>10 ml THP-1 hücre süspansiyonuna (son konsantrasyon 16 nM) 1 μl 160 mM PMA stoğu (forbol 12-miristat 13-asetat çözeltisi) ekleyin ve iyice karıştırın. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 1 ml hücre süspansiyonu dağıtın ve 12 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutulan inkübatörde inkübe etme plakası</li>.
	<li>Eski ortamı çıkarın, 1 ml önceden ısıtılmış RPMI-1640 tam ortam ekleyin ve hücrelerin% 5 CO2'de 37 ° C'de 12 saat iyileşmesine izin verin.</li>
	<li>Süspansiyondaki oval şekilli THP-1 monositik hücrelerin düzleştirilmiş, iğ şeklinde ve yapışık makrofajlara farklılaştığından emin olmak için hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin. Bu farklılaşmış hücreler artık C. glabrata enfeksiyon çalışmalarını yürütmeye hazırdır.</li>
</ol>
2. C. glabrata Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması
C. glabrata vahşi tip suşu Bg2, THP-1 makrofajlarını enfekte etmek için kullanılacaktır. C. glabrata hücreleri rutin olarak sıvı YPD (Maya özütü (% 1) -Pepton (% 2) -Dekstroz (% 2)) ortamında kültürlenir. Katı YPD besiyeri, orta otoklavlamadan önce %2 agar ilave edilerek hazırlanır.
<ol>
	<li>Bir C. glabrata kültürü hazırlamak için, steril, tek kullanımlık bir halka ile agar plakasından tek bir koloni alın ve 10 ml YPD sıvı ortama aşılayın ve 30 ° C'de çalkalanarak (200 rpm) 14-16 saat inkübe edin.</li>
	<li>Bu kültürü (1 ml) 4.000 rpm'de (1.800 x g) 5 dakika boyunca masa üstü mikrosantrifüjde santrifüjleyin, hücreleri steril PBS (fosfat tamponlu salin, pH 7.4) ile üç kez yıkayın ve hücre peletini 1 ml PBS'de askıya alın.</li>
	<li>C. glabrata hücre süspansiyonunun OD600'ünü ölçün ve 2 x 106 hücre / ml (OD600 = 0.1) yoğunluk elde etmek için uygun hacimde steril PBS ile seyreltin. Alternatif olarak, bir hemositometre kullanılarak maya hücreleri sayılarak istenen hücre yoğunluğu elde edilebilir.</li>
</ol>
3. THP-1 Makrofajlarının C. glabrata Hücreleri ile Enfeksiyonu
<ol>
	<li>0.1'lik bir MOI (enfeksiyon çokluğu) elde etmek için THP-1 makrofajlarına (24 oyuklu bir kültür plakasının oyuğu başına ekilen 10,6 hücre) 50 μl C. glabrata hücre süspansiyonu ekleyin ve plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.</li>
	<li>Canlı maya sayımlarını belirlemek için, 50 μl C. glabrata hücre süspansiyonunu steril PBS'de 100 kat seyreltin ve YPD katı ortamında 100 μl plakayı seyreltin. Plakaları 30 ° C'de inkübe edin ve 1-2 gün sonra ortaya çıkan maya kolonilerinin sayısını manuel olarak sayın. Bu sayılar bundan böyle 0 saat C. glabrata CFU'ları (koloni oluşturan birimler) olarak anılacaktır.</li>
	<li>THP-1 hücrelerinin C. glabrata hücreleri ile 2 saat birlikte kültürlenmesinden sonra, 24 oyuklu doku kültürü plakasını bir rezervuarda ters çevirerek kültür ortamını atın ve fagositozlu hücre dışı C. glabrata hücrelerini çıkarmak için önceden ısıtılmış steril PBS ile üç kez hafifçe yıkayın. THP-1 makrofaj tek tabakasına herhangi bir zarar vermeden tüm hücre dışı mayaların tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için PBS ile nazik yıkamalar kesinlikle gereklidir.</li>
</ol>
4. Koloni Oluşturan Birim Testi ile Fagositoz Hızının ve Hücre İçi Replikasyonun Ölçülmesi

<ol>
	<li>Lyse C. glabrata, THP-1 makrofajlarını 1 ml steril H 2O'da2 dakika boyunca enfekte etti, makrofaj kalıntılarını kuyudan çıkarmak için hafifçe kazıyın ve hücre lizatını bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Tam makrofaj lizizinin mikroskobik olarak doğrulanması, içselleştirilmiş tüm mayaların geri kazanımı için çok önemlidir.</li>
	<li>Steril PBS'de 100 kat seyreltme hazırlayın, YPD katı ortamda 100 μl plaka hazırlayın ve plakaları 30 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>1-2 gün sonra, YPD ortamında ortaya çıkan C. glabrata kolonilerinin sayısını manuel olarak sayın, seyreltme faktörü (2 saat CFU) ile çarpın ve aşağıdaki formülü kullanarak 2 saatlik madeni para oluşumundan sonra THP-1 makrofajları tarafından yutulan C. glabrata hücrelerinin yüzdesini ifade eden fagositoz oranını hesaplayın. 
	% fagositoz = [(2 saatteki CFU'lar)/(0 saatteki CFU'lar)] X 100</li>
	<li>THP-1 makrofajlarındaki C. glabrata hücrelerinin hücre içi replikasyon hızını ölçmek için, enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında, yani 4, 6, 8, 10, 12 ve 24 saatte, 3.3-4.3 adımlarını tekrarlayarak hücre içi mayayı toplayın.</li>
	<li>THP-1 makrofajlarındaki C. glabrata hücrelerinin kıvrım sağkalımını / replikasyonunu, herhangi bir zaman noktasındaki toplam CFU'ları 2 saattekilerle (fagositozlu maya) bölerek hesaplayın.</li>
</ol>
5. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu Kullanılarak Hücre İçi Replikasyonun İzlenmesi
<ol>
	<li>Bölüm 1'de açıklanan adımları izleyerek, iki dört oyuklu odacıklı slaytların her bir oyuğunda PMA ile muamele edilmiş 5 x 105 THP-1 hücresi tohumlayın ve 12 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Eski ortamı önceden ısıtılmış RPMI-1640 tam ortamla değiştirin ve hücrelerin PMA tedavisinden 12 saat boyunca iyileşmesine izin verin.</li>
	<li>GFP (yeşil floresan protein) etiketli C. glabrata hücre süspansiyonunu Bölüm 2'de tarif edildiği gibi hazırlayın ve THP-1 makrofajlarına 1'lik bir MOI'ye kadar enfekte edin. GFP'yi eksprese eden C. glabrata suşları mevcut değilse, FITC (floresein izotiyosiyanat) ile etiketlenmiş maya hücreleri, enfeksiyon sonrası erken olayları, yani fagositoz oranını ve 2 saatte fagolizozomal olgunlaşmayı izlemek için kullanılabilir.</li>
	<li>Slaytları 37 ° C'de% 5 CO2 ile 2 saat inkübe edin, ortamı atmak için dikkatlice ters çevirin ve 3x'i steril, önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Bir slaytın her bir odasına 500 μl önceden ısıtılmış RPMI-1640 tam ortam ekleyin ve 22 saat boyunca %5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>2 saat C. glabrata ile enfekte olmuş THP-1 makrofajlarını sabitlemek için, diğer slaytın her bir odasına 500 μl% 3.7 formaldehit (PBS'de hazırlanır) ekleyin ve karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.</li>
	<li>Slaytı PBS ile üç kez yıkayın, 500 μl Triton-X (% 0.7) ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Slaytı 3x PBS ile yıkayın, hazneyi kültür slaytından çıkarın ve karanlıkta 3-5 dakika havayla kurutun.</li>
	<li>DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol) içeren Vectashield montaj ortamını kullanarak kabarcık oluşumunu önleyerek slayt üzerine dikkatlice bir lamel monte edin. Fazla sıvıyı Kimwipe ile nazikçe çıkarın ve lamel kenarlarını tırnak cilası ile kapatın. Slaytı kullanana kadar karanlıkta 4°C'de saklayın.</li>
	<li>Enfeksiyondan 24 saat sonra THP-1 hücrelerini işlemek için 5.4 ve 5.6-5.9 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Lazer taramalı konfokal mikroskop kullanan görüntü hücreleri (60X yağa daldırma objektifi, DAPI ve GFP boyası için sırasıyla 405 nm ve 488 nm'de uyarma).</li>
</ol>

<ol><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Candidiasis%3A+a+Persistent+Public+Health+Problem%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem.</a> Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).</li>
<li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+from+the+ARTEMIS+DISK+global+antifungal+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).</li>
<li>Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+opportunistic+fungal+infections+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Overview of opportunistic fungal infections in India.</a> Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).</li>
<li>Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+by+any+other+name%3A+Candida+glabrata+and+its+interaction+with+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).</li>
<li>Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata%2C+Candida+parapsilosis+and+Candida+tropicalis%3A+biology%2C+epidemiology%2C+pathogenicity+and+antifungal+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).</li>
<li>Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+glycosylphosphatidylinositol-linked+aspartyl+proteases+is+required+for+virulence+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).</li>
<li>Seider, K., Brunke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).</li>
<li>Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+Candida+glabrata-macrophage+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction.</a> PLoS Pathog. 8 (8), e1002863(2012).</li>
<li>Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+supports+Candida+glabrata+survival+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis.</a> Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).</li>
<li>Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+THP-1+Cells%3A+an+attractive+model+for+the+assessment+of+intracellular+growth+rates+of+Mycobacterium+tuberculosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).</li>
<li>Murayama, T., Ohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Cytomegalovirus+induces+Interleukin-8+production+by+a+human+monocytic+cell+line%2C+THP-1%2C+through+acting+concurrently+on+AP-1-+and+NF-kB-binding+sites+of+the+Interleukin-8+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene.</a> J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).</li>
<li>Gross, O., Poeck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk+kinase+signalling+couples+to+the+Nlrp3+inflammasome+for+anti-fungal+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence.</a> Nature. 459, 433-436 (2009).</li>
<li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+leukemia+cell+line%2C+THP-1%3A+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li>
<li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li>
<li>Castaño, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, fırsatçı mantar enfeksiyonlarının kontrolünde önemli bir rol oynar. Makrofajlar, mantar patojeninin yutulması ve yok edilmesi yoluyla antifungal savunmaya katkıda bulunur. Bu nedenle, hayatta kalmak için gerekli olan faktörlerin aydınlatılması ve/veya makrofajların antimikrobiyal fonksiyonlarına karşı koymak, mantar virülans stratejileri hakkındaki anlayışımızı ilerletecektir. Bu bağlamda, bir insan fırsatçı mantar patojeni C. glabrata'nın konakçı fagositik hücrelerle etkileşim...

Candida türleri, bağışıklığı baskılanmış hastalarda yaşamı tehdit eden invaziv mantar enfeksiyonlarının önde gelen nedenidir1. Ortaya çıkan bir nozokomiyal patojen olan Candida glabrata, coğrafi konuma bağlı olarak Yoğun Bakım Ünitesi hastalarından en sık izole edilen ikinci veya üçüncü Candida türüdür1-3. Filogenetik olarak, haploid tomurcuklanan bir maya olan C. glabrata, patojenik olmayan model maya Saccharomyces cerevisiae ile patojenik Candida spp. C. albicans4 dahil. Bununla tutarlı olarak, C. glabrata çiftleşme, salgılanan proteolitik aktivite ve morfolojik plastisite4-5 dahil olmak üzere bazı temel mantar virülans özelliklerinden yoksundur.
C. glabrata hif oluşturmamasına rağmen, murin ve insan makrofajlarında6-8 hayatta kalabilir ve çoğalabilir, bu da benzersiz patogenez mekanizmaları geliştirdiğini düşündürmektedir. C. glabrata'nın besin açısından fakir hücre içi makrofaj ortamında hayatta kalmak ve konakçı bağışıklık hücreleri tarafından oluşturulan oksidatif ve oksidatif olmayan konak tepkilerine karşı koymak için kullandığı stratejiler hakkında sınırlı bilgi mevcuttur5. İlgili bir makrofaj model sistemi, C. glabrata'nın konakçı fagositik hücrelerle etkileşimini fonksiyonel genomik ve proteomik yaklaşımlarla tanımlamak için bir ön koşuldur. Sırasıyla insan ve murin kökenli periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM'ler), daha önce C. glabrata'nın konakçı bağışıklık hücreleri ile etkileşimini incelemek için kullanılmıştır7,9. Bununla birlikte, PBMC'lerin ve BMDM'lerin elde edilmesindeki zorluk, sınırlı ömürleri ve farklı memeli donörleri arasındaki içsel varyasyon, bu hücrelerin çok yönlü model sistemler olarak kullanımını kısıtlamaktadır.
Burada, insan monositik hücre hattı THP-1'den türetilen makrofajlarda C. glabrata hücrelerinin hücre içi davranışını incelemek için bir in vitro sistemin kurulması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolün genel amacı, konakçı-mantar patojen etkileşiminin farklı yönlerini incelemek için kolayca manipüle edilebilen basit, ucuz, hızlı ve tekrarlanabilir bir hücre kültürü model sistemini yürürlüğe koymaktı.
THP-1 hücreleri daha önce bakteriler, virüsler ve mantarlar10-12 dahil olmak üzere çok çeşitli patojenlere karşı konakçı bağışıklık tepkisini deşifre etmek için kullanılmıştır. Monositik THP-1 hücrelerinin bakımı kolaydır ve forbol ester tedavisi üzerine, insanın monosit türevli makrofajlarını taklit eden ve uygun makrofaj belirteçlerini eksprese eden makrofajlara ayırt edilebilir13. THP-1 makrofaj model sisteminin temel avantajları, kullanım kolaylığı ve karmaşık ekipman gereksiniminin olmamasıdır.
Burada sunulan protokol, diğer insan mantar patojenlerinin konakçı bağışıklık hücreleri ile etkileşimini incelemek için kolayca uyarlanabilir. Mevcut prosedür, yüksek verimli mutant ekranlar kullanarak ilgilenilen patojen için virülans faktörlerini belirlemek için de kullanılabilir. Bu kavram kanıtı, insan makrofajlarında C. glabrata'nın hayatta kalması için gerekli olan 56 genin bir setini tanımlamak için THP-1 kültür model sisteminin başarılı bir şekilde kullanılmasıyla örneklenmiştir8.

<table><tbody><tr><td>THP-1</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>TIB 202</td><td>İnsan akut monositik lösemi hücre hattı</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hidroklon</td><td>SH30096.01</td><td>THP-1 hücrelerinin bakımı için</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristat 13-asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>Dikkat: Tehlikeli</td></tr><tr><td>YPD&nbsp;</td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>Candida glabrata hücrelerinin büyümesi için</td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>C. glabrata ile enfekte THP-1 makrofajlarının fiksasyonu için</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td></td><td></td> <td>Tampon (137 mM NaCl, 10 mM Fosfat, 2.7 mM KCl,&nbsp; pH 7.4) yıkamalar için</td></tr><tr><td>Tuzlu su-sodyum sitrat (SSC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Yıkamalar için tampon (3 M NaCl, 20x konsantrasyon için 0,3 M sodyum sitrat)</td></tr><tr><td>Prehibridizasyon tamponu</td><td></td><td></td><td>Tampon (%50 formamid, 5x Denhardt' s çözeltisi, 5x SSC, %1 SDS) hibridizasyon için</td></tr><tr><td>VECTASHIELD montaj ortamı</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>Konfokal mikroskopi için slaytları monte etmek için</td></tr><tr><td>32P etiketli &alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>İmza etiketlerinin radyolinguistik etiketlemesi için</td></tr><tr><td>100 mm doku kültürü kapları</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>THP-1 hücrelerini kültürlemek için</td></tr><tr><td>24 oyuklu doku kültürü plakası</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>THP-1 makrofajlarında C. glabrata enfeksiyon çalışmaları yapmak</td></tr> için <tr><td>4 odacıklı doku kültürü ile muamele edilmiş cam slayt</td><td>BD Falcon</td><td>REF354104</td><td>C. glabrata ile enfekte THP-1 makrofajlarını görüntülemek için</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Rohem Hindistan</td><td></td><td>Hücrelerin sayımı için</td></tr><tr><td>Masa üstü mikrosantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Mikrofüj 18</td><td>Mikrotüplerdeki hücreleri döndürmek için Masa</td></tr><tr><td>üstü santrifüj</td><td>Remi</td><td>R-8C</td><td>15 ml'lik tüplerde hücreleri döndürmek için</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Amersham Biosciences</td><td>Ultraspec 10</td><td>Maya hücrelerinin emilimini izlemek için</td></tr><tr><td>Plaka inkübatörü</td><td>Labtech</td><td>Soğutmalı</td><td>C. glabrata hücrelerini büyütmek için</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı kuluçka makinesi</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 43</td><td>C. glabrata hücrelerini büyütmek için</td></tr><tr><td>Su ceketli CO2&nbsp; inkübatör</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>Forma serisi 2</td><td>THP-1 hücrelerini kültürlemek için</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>C. glabrata enfekte THP-1 makrofajlarını gözlemlemek için</td></tr><tr><td>Bileşik mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>C. glabrata ve THP-1 makrofajlarını gözlemlemek için</td></tr><tr><td>PCR makinesi</td><td>BioRad</td><td>DNA Motoru</td><td>Giriş ve çıkış genomik DNA</td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırınından</td> benzersiz etiketleri yükseltmek için <td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>Hibridizasyon için&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>Fujifilm</td><td>FLA-9000</td><td>Hibritleştirilmiş membranları taramak için</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort Radyoaktif</td><td>işaretli imza etiketlerinin denatürasyonu için</td></tr><tr><td>Jel dokümantasyon ünitesi</td><td>Alphainnontech</td><td>Alphaimager</td><td>Agaroz jellerde etidyum bromür lekeli DNA'yı görselleştirmek için</td></tr></tbody></table>

İnsan thp-1 makrofajlarında candida glabrata'nın hücre İçi davranışını İncelemek İçin İn vitro sistemin kurulması

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Bir hücre kültürü model sistemi, konakçı çevresel koşulların yakın bir taklidi ise, mikrobiyal patojen enfeksiyonunun belirli bir basamağının incelenmesi için hayvan model sistemlerine ucuz, tekrarlanabilir ve kolayca manipüle edilebilir bir alternatif olarak hizmet edebilir. Phorbol ester tedavisi üzerine makrofajlara farklılaşan bir insan monositik hücre hattı THP-1, daha önce Mycobacterium tuberculosis dahil olmak üzere birçok hücre içi patojenin virülans stratejilerini incelemek için kullanılmıştır. Burada, fırsatçı bir insan mayası patojeni Candida glabrata'nın konakçı fagositik hücrelerle etkileşimini tanımlamak için THP-1 makrofajlarını kullanan bir in vitro hücre kültürü model sistemini yürürlüğe koymak için bir protokolü tartışıyoruz. Bu model sistem basit, hızlı, yüksek verimli mutant ekranlara uygundur ve karmaşık ekipman gerektirmez. Tipik bir THP-1 makrofaj enfeksiyonu deneyi, geri kazanılan hücre içi mayanın koloni oluşturan birim bazlı canlılık analizi için zengin ortamda büyümesine izin vermek için yaklaşık 24-48 saat sürer. Diğer in vitro model sistemler gibi, bu yaklaşımın olası bir sınırlaması, elde edilen sonuçların insan konakçıda bulunan oldukça karmaşık bir bağışıklık hücresi devresine ekstrapolasyonunun zorluğudur. Bununla birlikte, buna rağmen, mevcut protokol, bir mantar patojeninin antimikrobiyal yanıttan kaçınmak / karşı koymak ve konakçı bağışıklık hücrelerinin besin açısından fakir ortamında hayatta kalmak, uyum sağlamak ve çoğalmak için kullanabileceği stratejileri aydınlatmak için çok yararlıdır.

PMA ile işlem görmüş THP-1 makrofajlarının C. glabrata vahşi tip (wt) hücrelerle enfeksiyon analizleri, 2 saatlik birlikte inkübasyon sonrası wt hücrelerin %55-65 oranında makrofajlar tarafından fagosite edildiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, C. glabrata hücreleri THP-1 makrofajları tarafından öldürülmeye karşı direnç göstermiş ve THP-1 makrofajları ile 24 saatlik birlikte kültürleme sonrası CFU'larda 5 ila 7 katlık orta düzeyde bir artış gerçekleşmiştir8. GFP eksprese eden pl...

Bu makale, mantar virülans mekanizmaları hakkındaki bilgimizi ilerletmek için yararlı bir araç olacak olan fakültatif bir hücre içi insan mantar patojeni Candida glabrata'nın insan makrofajları ile etkileşimini incelemek için bir in vitro hücre kültürü model sistemi oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir.

İnsan THP-1 Makrofajlarında Candida glabrata'nın Hücre İçi Davranışını İncelemek İçin İn vitro Sistemin Kurulması

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Bu prosedürün genel amacı, insan fırsatçı fungal bir patojenin hücre içi davranışını incelemek için bir in vitro kültür model sistemi kurmaktır. İnsan monositik hücre hattı THP-1'den türetilen makrofajlarda Candida albicans incelenmektedir. Bunu başarmak için, THP-1 monositleri önce makrofajlara farklılaşmaları için PMA ile muamele edilir.Ardından, enfeksiyondan iki saat sonra THP-1 makrofajları Candida GTA hücreleri ile enfekte edilir. Fagosite edilmemiş Candida GTA hücreleri PBS yıkamaları ile uzaklaştırılır ve enfekte makrofajların ozmozu yoluyla hücre içi e hücreleri ileri çalışmalar için geri kazanılır. Bu protokol, makrofajlardaki viral Candida GTA hücrelerini değerlendirmenin yanı sıra, Candida GTA enfeksiyonu sonrası THP-1 makrofajlarındaki fazolizozomal olgunlaşma sürecini ve sitokin yanıtını değerlendirmek için kullanılabilir.Ek olarak, bu protokol, Candida collaborator mutant kütüphanesini TSP-1 makrofajlarındaki değişmiş sağkalım profilleri açısından yarı yüksek kapasiteli bir şekilde taramak için ölçeklendirilebilir. Bu protokolün temel avantajı, nispeten düşük maliyetli, yüksek düzeyde tekrarlanabilir olması ve farklı immün hücrelerin yanı sıra fungal patojenlere kola

establishment-an-vitro-system-to-study-intracellular-behavior-candida

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İnsan THP-1 Makrofajlarında Candida glabrata'nın Hücre İçi Davranışının İncelenmesi için Bir In vitro Sisteminin Kurulması

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Bu videoda, indüklenmiş pluripotent kök hücreler kullanarak nöroblastom için mikroglial fagositoz testini gerçekleştiriyoruz. Test, nörodejeneratif hastalıklarda mikroglial fonksiyonun bozulmasını değerlendirmeye yardımcı olur.

Mikroglial Fagositoz Testi: iPSC Makrofajları Kullanılarak Nöroblastom Hücreleri için Mikroglial Fagositoz Modeli Oluşturmak İçin İn Vitro Test

Bu videoda, konfokal mikroskopi kullanarak apoptotik hücrelerin klirensini incelemek için efferositoz testini gösteriyoruz. Efferositoz, apoptotik hücrelerin fagositler tarafından yutulduğu ve efferozom adı verilen veziküller içinde parçalandığı çok aşamalı bir süreçtir. Bu protokol, tek tek apoptotik hücrelerin içselleştirilmiş ve içselleştirilmemiş kısımlarını görselleştirmek ve efferositozu ölçmek için bir yöntem sağlar.

Sabit Hücreli Efferositoz Deneyi: Floresan Mikroskobu Kullanarak Apoptotik Hücrelerin Makrofajlar Tarafından Efferositik Alımını İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu video, kemik iliği kaynaklı makrofajlardaki (BMM'ler) parazitlerin hücre içi büyümesini ölçmek için bir testi göstermektedir. Makrofaj hücreleri, sırasıyla Leishmania'nın motil ve non-motil invaziv evreleri, metasiklik promastigotlar ve amastigotlar ile enfekte olur. Parazitler makrofajları istila eder, parazitoforöz bir vakuol içinde içselleşir ve içinde çoğalır. Hücre içi parazit büyümesi, makrofaj ve parazit çekirdeklerinin floresan olarak boyanması üzerine bir mikroskop kullanılarak...

Makrofajlarda Parazitin Hücre İçi Büyümesini Ölçmek için Bir İn Vitro Test

Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri...

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Burada mikroskopve floresan boyama kullanarak canlı hücre kültüründe makrofaj ekstrasellüler tuzak (MET) üretimini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, immünoresans boyama ile spesifik MET protein belirteçlerini incelemek için daha da genişletilebilir.

Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi

Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle meydana gelen erken olayları değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Konfokal Mikroskopi ile Leishmania Fagositozunun İncelenmesi

Mantar konidiasının makrofajlar tarafından fagositozunu içeren teknik, mantarlara karşı immün yanıtların modülasyonunu değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makalenin amacı, Trichoderma stromaticum conidia ile uyarılan insan periferik kan mononükleer kaynaklı makrofajların fagositoz ve klirens yeteneklerini değerlendirmek için bir yöntem sunmaktır.

İnsan Periferik Kanı Mononükleer Kaynaklı Makrofajlar İçinde Trichoderma stromaticum Conidia'nın Canlılık Testi

Monositler ve makrofajlar, sağlık ve hastalık için çok önemli olan çok plastik ve yeniden programlanabilir bağışıklık hücreleridir. Belirli farklılaşma programları ve fenotipleri benimseyerek çok çeşitli uyaranları algılar ve bunlara yanıt verirler. Makrofaj polarizasyonunu ve yeniden programlamayı incelemek için bir in-vitro modeli standartlaştırdık ve araştırma için değerli bir araç sağladık.

İnsan Monositinden Türetilmiş Makrofajların İn vitro Tahliller için Yeniden Programlanması

Keşfedin, Candida glabrata'nın insan THP-1 makrofajlarındaki hücre içi davranışını incelemek için in vitro bir kültür modeli kurmayı. Bu yöntem, fungal virülans mekanizmalarını ve makrofaj yanıtlarını değerlendirmeye yardımcı olur.

İnsan THP-1 Makrofajlarında Candida glabrata'nın Hücre İçi Davranışını İncelemek İçin İn vitro Sistemin Kurulması

Daha fazla video keşfet