Üretim ve Farelerde arteriyel Lezyonlarının 3-Boyutlu kantitasyonu Optik Projeksiyon Tomografi ile

Bu prosedürün genel amacı, optik projeksiyon tomografisinin faredeki aterosklerotik ve neointimal lezyonların görselleştirilmesi ve üç boyutlu kantitasyonu için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bu, ilk olarak farelerde arteriyel lezyonlar oluşturarak, cerrahi olarak veya ateroskleroz geliştirmeye yatkın farelere yüksek kolesterol diyeti verilerek gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, hedef arteri izole etmek ve optik projeksiyon tomografisi kullanarak taramaktır.

Son adımlar, görüntü rekonstrüksiyonu yapmak, lezyonu tanımlamak ve lezyon hacmini ölçmektir. Sonuç olarak, sonuçlar lezyonun anatomik rekonstrüksiyonlarını ve görüntü analizi yoluyla lezyon hacminin ve arteriyel daralmanın niceliğini gösterebilir. Grubumuz, kalp krizi ve inme gibi yaşamı tehdit eden komplikasyonlara yol açan arteriyel daralmaya neden olan lezyonların oluşumunun altında yatan mekanizmaları anlamakla ilgilenmektedir.

Bu optik projeksiyon tomografisi uygulaması, grubumuzda Dr.Lucy Lowe ile birlikte çalışan Dr.Nicholas Kirkby tarafından geliştirilmiştir ve laboratuvarlarımızda çalışan doktora sonrası bilim adamı Dr.Jung Shi Wu tarafından gösterilecektir. Bu tekniğin histoloji ve immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, daha az emek yoğun olması ve iki boyutlu analizden ziyade üç boyutlu analize izin vermesidir. Femoral arter lezyonlarını indüklemek için bu teknik, R ve şirketi ve Sada ve şirketi tarafından olanlardan modifiye edilmiştir.

Metin protokolü, diyet manipülasyonu ile aterosklerotik lezyonların nasıl indükleneceğini açıklar. Ağırlığında 25 ila 30 gram arasında olan 10 ila 12 haftalık bir C 57 siyah altı fare ile başlayın. Anestezi uygulandıktan sonra, vücut ısısını korumak için fareyi ılık bir pedin üzerine yerleştirin ve bir burun konisi aracılığıyla% iki ila 3 oranında flor sağlayın.

Fare bir ayak parmağı tutamına yanıt vermediğinde, kilogram başına 0.1 miligram buprenorfin uygulayın. Ardından, fareyi sırtına koyun ve sol arka bacağın ventral yüzeyini tıraş edin. Daha sonra, popliteal arterin çatallanması ile karın duvarı arasındaki üst arka ekstremite kaslarını ortaya çıkarmak için bir kesi yapın.

İşlem boyunca femoral siniri femoral arter ve damardan izole etmek için künt bir diseksiyon yapın. Dokuları hacimce% 1 ağırlıkça li köpek ile nemli tutun. Daha sonra, karın duvarına yakın femoral arter ve ven çevresinde ve popliteal arter ile dalın hemen altına geçici 6.0 Mers ipek ligatürleri yerleştirin.

Bunlar kan akışını kontrol etmek içindir. Daha sonra, femoral arter ile dalın iki ila beş milimetre distalinde olan popliteal arteri izole edin ve popliteal arteri popliteal arterin altına bağlayın. İkinci bir bitişik harf yerleştirin.

Şimdi, femoral arter ile dalın hemen distalindeki popliteal artere tel yerleştirilmesi için küçük bir kesi yapın. Kesiden ve karın duvarına doğru femoral artere kanamayı önlemek için proksimal geçici ligatüre baskı uygulayın. Yaklaşık bir ila 1,5 santimetre arasında 0,014 inçlik bir G kablosu yerleştirin.

30 saniye yerinde bırakın ve ardından çıkarın. Daha sonra ligatürler ligate, insizyonun üzerindeki popliteal arter kullanılarak. Femoral arteri tıkamamaya dikkat edin.

Şimdi geçici bağları çıkarın. Yarayı 5.0 merkal kullanarak kesintili çalışan dikişlerle kapatın. Ardından EMLA kremi uygulayın.

Hayvanı ev kafesine geri göndermeden önce kurtarma kafesinde bilincini ve hareketini yeniden kazanmasına izin verin. Bacağın iki veya üç gün boyunca topallık göstermesi beklenir, ancak bu farenin izole edilmesi gerektiği anlamına gelmez. OPT için, fare ötenazi edilmeli, pentobarbitalden terminal anesteziye neden edilmelidir.

Daha sonra kan kaybı ile trans kardiyak perfüzyon fiksasyonu yapın. Şimdi femoral arterleri veya aort kemerini ve dallarını izole edin. İşlem sırasında herhangi bir yabancı periyal materyali çıkarın.

Daha sonra dokuyu gece boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin. Ertesi gün ya dokuyu %70 etanolde saklayın ya da arterleri filtrelenmiş %1.5 LMP aeroslarına gömerek devam edin. Dokuyu yaklaşık 40 santigrat derecede erimiş aeros'a yavaşça indirin.

Konik bir şekil elde etmek için aeroları kesin. Şimdi bu preparatı en az 12 saat% 100 metanol içinde kurutun. Susuz kaldıktan sonra, damarları bir ila iki benzo alkol ve benzo benzoat karışımında temizleyin.

Damarların bu çözeltide 12 ila 24 saat inkübe etmesine izin verin. Ertesi gün, temizlenmiş numuneyi önceden kalibre edilmesi gereken tomografiye yükleyin. Çözünürlük 1024 olarak belirlendi.

1024 piksele kadar. İlgilenilen alan için büyütmeyi ayarlayın. Z ekseni otomatik olarak aynı çözünürlüğe ayarlanacaktır.

Voksel boyutu yaklaşık 200 mikron olacaktır. Ardından, Parlak Alan kanalını kullanarak örneği, görüş alanının merkezinde kendi ekseni etrafında dönecek şekilde konumlandırın. GFP tek filtre emisyon kanalını kullanarak, görüntünün dinamik aralığını en üst düzeye çıkarmak için odağı ayarlayın ve pozlamayı ayarlayın.

Aşırı doygunluktan kaçının. Şimdi GFP bir emisyon kanalındaki kabı sadece 0,9 derecelik adımlarla tarayın. Numuneler daha sonra balmumuna gömülmeden önce en az 24 saat boyunca %100 metanole geri döndürülmelidir.

Histolojik analiz için, elde edilen görüntüleri veri görüntüleme yazılımı kullanarak n keşif yazılımında veya benzer bir yazılımda açın. Görüntü rekonstrüksiyonunun kalitesini kontrol edin, görüntü kalitesini iyileştirin, görüntü yoğunluğunu ayarlayın ve yazılımın, numunenin ideal dönme ekseninden herhangi bir yanlış hizalanmasını telafi etmesini sağlayın. Her tarama için, lezyonu içeren dikey ilgi bölgesini tanımlayın.

Her 50. tarama çizgisinde, ortam ile iç elastik laminanın konumu arasındaki sınırı izleyin. Yazılım daha sonra diğer tüm taramalarda kenarlığı enterpolasyon yapabilir, bu enterpolasyonları manuel olarak kontrol edebilir ve gerektiğinde düzeltebilir. Şimdi, neointimayı temsil eden beyaz pikseller ve patent lümenini temsil eden siyah pikseller ile ayarlanmış bir ikili görüntü oluşturun.

Bu, yoğunluk eşiklerini tanımlayarak gerçekleştirilir. Bu gerçekleştirildikten sonra, nesne hacmi toplam lezyon hacmidir ve luminal hacim toplam hacimdir, nesne hacmi daha azdır. Böylece, lezyon ve lümenin eksenel uzunluk boyunca dağılımı değerlendirilir.

Murin femoral arterler, tel kaynaklı veya ligasyona bağlı yaralanmadan 28 gün sonra hasat edildi. Neointimal kalınlaşma, yeniden yapılandırılmış iki boyutlu slaytlardaki emisyon projeksiyonlarında belirgindi. Konsantrik neointimal lezyonlar ayırt edilebilir.

APOE eksikliği olan bir fareden alınan tüm aortik arkın optik projeksiyon tomografisi emisyon görüntüleri, aort arkının daha küçük eğriliğinde, brakiyosefalik arterde ve sol karotis ve subklavyen arterlerin kökeninde beklenen lezyonları tanımladı. Aynı lezyon segmentlere ayrıldı ve kırmızı renkte görüntülendi. Orijinal görüntünün üzerine bindirildiğinde plakların dağılımını vurgulamak için, bunların eksantrik lezyonlar olduğunu gösteren kesitsel görüntülerde ortam ve lümen ayırt edilebilir.

Burada, tarama bu dallar boyunca distal olarak hareket ettikçe, lezyonlar önce subklavyen arterde, daha sonra karotiste ve son olarak brakiyosefalik arterde yavaş yavaş azalır ve kaybolur. İlginç bir şekilde, brakiyosefalik arterdeki bu lezyon, bu damar sağ karotis ve sağ subklavyen arterlere bölünürken akış bölücüye geçer. OPT prosedürünü takiben, lezyonun bileşimi nedir gibi ek soruları yanıtlamak için histoloji ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Bu nedenle, geliştirilmesinden sonra, bu teknik, vasküler araştırma alanında çalışan bilim adamlarının neointimal ve aterosklerotik lezyonların gelişiminde endotel reseptörlerinin, lektinlerin ve steroid metabolize edici enzimlerin rolünü araştırmalarının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, optik projeksiyon tomografisi kullanarak rine arterlerinden lezyonların nasıl elde edileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.