Name: Üretim ve Farelerde arteriyel Lezyonlarının 3-Boyutlu kantitasyonu Optik Projeksiyon Tomografi ile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Öğrenin farelerdeki arteriyel lezyonların optik projeksiyon tomografi ile üç boyutlu görselleştirilmesi ve kantitatif analizi yöntemini. Bu teknik aterosklerotik ve neointimal lezyon hacmini ölçerek kardiyovasküler hastalık mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

(; Henry Dryerre şeması LL) ve finansman İngiliz Kalp Vakfı (PWFH, BRW, DJW; Bu çalışma Edinburgh Üniversitesi (NSK) ve Carnegie Trust studentships tarafından desteklenen RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) ve Wellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08314 / Z / 07 / Z). Yazarlar Kardiyovasküler Bilim Merkezi&#39;nin Araştırma Mükemmellik ödülü BHF-finanse Merkezi tarafından sağlanan çalışmaları için desteklemek için minnettarız. Yazarlar neointimal lezyon üretiminin cerrahi modellerinin kurulmasına ilişkin Profesör Masataka Sata (Tokushima Üniversitesi) ve (Mount Sinai Tıp Okulu Dr Ernane Reis&#39;in grubunda) Dr. Igor Chersehnev tavsiye için özellikle minnettarız. Video üretilen ve SATA ve arkadaşları tarafından sunulmuştur. (http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) özellikle yararlı olmuştur.

Fare Femoral Arter içinde neointimal Lezyonlarının 1. Cerrahi İndüksiyon <ol><li> Hayvanları kullanarak deneyler ulusal ve kurumsal etik şartlarına uygun olarak yapılmalıdır. Tüm cerrahi uygun aseptik teknik kullanılarak yapılmalıdır. Neointimal lezyonların indüksiyonu Roque ve ark., 12 ve SATA ve ark., 13 tarafından tarif edilen tekniğin bir modifikasyonu kullanılarak elde edilir. </li><li> Erkek C57BL6 / J fareler tartılır (Yaş 10-12 hafta, ağırlık 25-30 g) indüksiyon odasında% 4-5 izofluran sunarak uyuşturan. Anestezinin sonra, 37 ° C &#39;de vücut ısısını korumak için ısıtılmış mata fare aktarın. Maske ile izofluran (% 2-3) &#39;in uygulanmasını devam edin. </li><li> Anestezi uygun bir düzeyde (ayak tutam tepki olmaması) neden sonra, buprenorfin uygulanması ile analjezik örtü sağlamak (0.1 mg / kg-1). Sonra sırtüstü pozisyon An fare koyunsol hindlimb ventral yüzeyi tıraş d. </li><li> Popliteal arter ve karın duvarı ile çatallanma arasında, femoral sinir femoral arter ve ven izole etmek künt diseksiyon kullanın, üst hindlimb kasları ortaya çıkarmak için bir kesi yapmak ve. / V lignokain% 1 w kullanarak gerektiği gibi yarayı yıkayın. </li><li> (Popliteal arter hemen dalı altında) (karın duvarına yakın) ve distal proksimal femoral arter ve kan akışını kontrol etmek için ven etrafında geçici birleşik harfleri (6/0 Mersilk) yerleştirin. Sonra (femoral arter ile şubeye uzak yaklaşık 2-5 mm) popliteal arteri izole ve distale Arter. Popliteal arter altında ikinci bir çözdü bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> Proksimal geçici ligature basınç uygulayarak kanamayı önleyen femoral arter dal hemen distalinde popliteal arterde küçük bir kesi (Arteriyotomi), emin olun. Düz Advance, 0.014 &quot;kılavuz teli çoğaldığınıKarın duvarı yönünde femoral arter boyunca 1-1.5 cm ve 30 saniye (Şekil 1A) yerinde bırakın. </li><li> Kılavuz teli çıkarın ve bu amaçla yerleştirilen bitişik harfleri kullanarak ve femoral arter tıkamak için özen, arteriotomi üzerinde popliteal arteri Arter. NOT: ligasyon kaynaklı yaralanma için. Intraluminal yaralanma olmadan neointimal biçimlenme femoral veya popliteal arter (Şekil 1B ve 1C) bağlanarak tarafından uyarılan edilebilir. Bu takip 1,1-1,5 adımları elde etmek için. Ancak, arteriyotomi yapmazlar ama ya (i) (adım 1.6 kaçınarak) popliteal arter ile şube noktada femoral arter veya (ii) Arter femoral arterin hemen distalinde popliteal arteri Arter. Sonra adım 1.8 ile devam edin. </li><li> Geçici bitişik harfler çıkarın süreksiz dış sütür (5/0 Mersilk) ile yarayı kapatmak ve EMLA krem ​​(% 2.5 lidokain,% 2.5 prilokain) uygulanır. Hayvanlar yeniden izin ver<html> bilinç (genellikle 5-10 dk) kazanmak ve onların kafes etrafında serbestçe hareket ediyor emin olun (hafif topallık etkilenen bacakta belirgin olabilir ama bu ameliyattan sonra ilk 2-3 gün içinde çözmelidir) oda tutan dönmeden önce. Fareler ameliyat sonrası tek başına ev sahipliği zorunda değilsiniz. </li><li> Hayvanlar kadar 3 ay boyunca kurtarmak için izin verin. Küçük lezyonlar 7 gün tel yaralanma sonrası ~ görünmeye başlayacak ve 21-28 gün sonra ~ istikrarlı bir maksimum boyutu ulaşacaktır. </li></ol> Apolipoprotein E Aterosklerotik Lezyonlarının 2. İndüksiyon - / - Fareler <ol><li> 12 hafta boyunca erkek, 6 hafta (evde yetiştirilen) eski ApoE boş fareler için, batı diyet (Araştırma Diyetler, ABD% 0.2 kolesterol) uygulayınız. </li><li> Aterosklerotik lezyonlar genellikle aort kavsi ve onun büyük dalları (Şekil 2) brüt inceleme üzerine görebilir. </li></ol> 3. Analiz Arter Lezyonları kullanarak Optik Projeksiyon Tomografi (OPT) nt &quot;&gt; NOT: fare femoral arter ve aortik ark örneklerinde lezyonların OPT görüntüleri optik projeksiyon tomografleri kullanılarak elde edilmiştir. <ol><li> % 10 nötr tamponlu formalin, ardından heparinize (10 U / ml) fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile terminal anestezi (80 mg / kg sodyum pentobarbital) kapsamında transkardiyak perfüzyon tespit ve kanları tümüyle alınarak fareler öldürülür. </li><li> Uygun şekilde femoral arter veya aort arkı ve ana dalları (sol karotid arter, sol subklavyen arter, brakiyosefalik gövde), yalıtmak ve yabancı peri-adventisyal malzeme çıkarmak. Gerekli olana kadar% 70 etanol içinde depolamadan önce% 10 tamponlu formalin ile O / N sonrası düzeltme. </li><li> % 1.5 düşük erime noktalı agaroz gömme arterler, Whatman 113 V kağıt ile ön-filtre edildi. Manyetik OPT her örnek takın mount o doğrultusunda damar ekseni ile siyanoakrilat yapıştırıcı ile monte edilir. Konik şekle aşırı agaroz Trim. En az 12 saat süre ile% 100 metanol içinde kurutmak. </li><li> Cbenzil alkol ve benzil benzoat karışımı içinde (12-24 saat) daldırılarak emizle kaplar (1: 2 h / h). </li><li> Kalibre tomografi temizlenir örnekleri yerleştirin. 1024 x 1,024 çözünürlüğü ayarlayın ve ilgi tüm alanı görülebilir sağlayan bir optik büyütme belirler. OPT hacim Z ekseni aynı çözünürlüğe yeniden bir izotropik (yani, 1.024 x 1,024 x 1,024), voksel boyutu ~ 200 mikron. Imar eserler olması muhtemel olduğu gibi bu kararın aşırı tahminini temsil edebilir. O parlak alan, iletim kanalı içinde görüş alanının merkezinde kendi ekseni üzerine döner, böylece örnek konumunu ayarlayın. </li><li> GFP1 filtre emisyon kanalı (uyarma filtresi 425 nm bant geçiren nm 40 ile; emisyon filtresi: 475 nm uzun geçiş) ise, numune odak ve elde edilen görüntünün dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için pozlama süresini ayarlamak (aşırı doygunluk kaçının). 0.9 ° dönme adım, sadece GFP1 emisyon kanalında gemi tarayın. &lt;/ Li&gt; <li> Bitiminde DataViewer yazılımı kullanarak veri toplama kalitesini teyit etmektedir. Tarayıcıdan numune çıkarın. </li><li> Işlem, normal olarak mum, parafin önce, sonraki histolojik analiz,&gt; 24 saat boyunca% 100 metanol içinde yer örneği sağlamak için. </li></ol> 4. Görüntü İmar ve Analizi Filtre edilmiş geri yansıtma ile Tomografi yeniden yapılandırılması NRecon yazılım veya benzeri kullanılarak gerçekleştirilir. Rekonstrüksiyonları gruplar halinde, sahipsiz yapılabilir. <ol><li> Kaymaları dengeleyebilir ve görüntü yoğunluk seviyelerini ayarlayarak görüntü kalitesini artırmak. </li><li> DataViewer yazılımını kullanarak görüntü rekonstrüksiyon kalitesini kontrol edin. </li><li> Analiz için numune uygun bölümü belirlenmesi. Lümen boyutları kaydedildi isteniyorsa gemiler arasında tutarlı Bu uzunluk tutun. </li><li> El her 50 yeniden inşa kesitler içinde 1 uygun sınır izleme tarafından lezyonların taslağını tanımlayın. </li><li> Bilgisayar tarafından oluşturulan interpolations doğru olduğundan emin olmak için her Interleaved kesite edin. Gerektiğinde el ile sınır ayarlayın. </li><li> Yalnızca lezyon seçilir, böylece gri-seviyeli eşiğini ayarlayın ve ölçüm veri ihracat. </li><li> Her tarama için, lezyon içeren bir ilgi dikey bölgesini tanımlamak ve medya ve neointimaya arasındaki sınırı iz (yani., Internal elastik lamina pozisyonu) her 50 inci tarama hattı için. Yazılımda interleaved tarama hatları için intima / media sınırları katmak ve doğrulamak ve gerektiğinde uygun düzeltin. Daha fazla kademeli bu beyaz piksel neointima temsil siyah piksel lümen temsil ettiği bir ikili görüntü setini üretmek için elle tanımlanmış yoğunluğu eşiğine üç boyutlu hacmi tanımlanır. </li><li> Alınan ölçümler şunlardır: toplam lezyon hacmi (nesne hacmi), lümen hacmini (toplam hacim - nesne hacmi) ve lezyonun ve çapraz mezhep lümen dağılımıçalışılan kabın eksenel uzunluğu boyunca uğratarak alanı. </li></ol>

<ol><li>Luis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li>
<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%E2%80%93an+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis–an inflammatory disease.</a> N Engl J Med. 340, 115-126 (1999).</li>
<li>Deuse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+In-Stent+Restenosis%3A+An+Inexpensive%2C+Reliable%2C+and+Rapid+Preclinical+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Ex%22%5BJournal%5D)">Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model.</a> J Vis Ex. (31), (2009).</li>
<li>McAteer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+3D+reconstruction+of+atherosclerotic+plaque+components+in+apolipoprotein+E+knockout+mice+using+ex+vivo+high-resolution+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification and 3D reconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 2384-2390 (2004).</li>
<li>Martinez, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+Computed+Tomography-Based+Virtual+Histology+for+Visualization+and+Morphometry+of+Atherosclerosis+in+Diabetic+Apolipoprotein+E+Mutant+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Microscopic Computed Tomography-Based Virtual Histology for Visualization and Morphometry of Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotein E Mutant Mice.</a> Circulation. 120, 821-822 (2009).</li>
<li>Langheinrich, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+Lesions+at+Micro+CT%3A+Feasibility+for+Analysis+of+Coronary+Artery+Wall+in+Autopsy+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic Lesions at Micro CT: Feasibility for Analysis of Coronary Artery Wall in Autopsy Specimens.</a> Radiology. 231, 675-681 (2004).</li>
<li>Ambrosi, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+the+human+heart+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of the human heart using optical coherence tomography.</a> J Biomed Opt. 14, 054002(2009).</li>
<li>Ku, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+microscopy+with+2-micron+transverse+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic microscopy with 2-micron transverse resolution.</a> J Biomed Opt. 15, 021302(2010).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography.</a> Annu Rev Biomed Eng. 6, 209-228 (2004).</li>
<li>Kirkby, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3-Dimensional+Imaging+of+Murine+Neointimal+and+Atherosclerotic+Lesions+by+Optical+Projection+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3-Dimensional Imaging of Murine Neointimal and Atherosclerotic Lesions by Optical Projection Tomography.</a> PloS ONE. 6 (2), e16906(2011).</li>
<li>Roque, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+femoral+artery+denudation+injury+associated+with+the+rapid%2C+accumulation+of+adhesion+molecules+on+the+luminal+surface+and+recruitment+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid, accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 335-342 (2000).</li>
<li>Sata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+vascular+injury+that+induces+rapid+onset+of+medial+cell+apoptosis+followed+by+reproducible+neointimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia.</a> J Mol Cell Cardiol. 32, 2097-2104 (2000).</li>
<li>Richards-Kortum, R., Sevick-Muraca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+spectroscopy+for+tissue+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis.</a> Annu Rev Phys Chem. 47, 555-606 (1996).</li>
<li>Kirkby, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-endothelial+cell+endothelin-B+receptors+limit+neointima+formation+following+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Non-endothelial cell endothelin-B receptors limit neointima formation following vascular injury.</a> Cardiovascular Research. 95, 19-28 (2012).</li>
<li>Kipari, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((11-hydroxysteroid+dehydrogenase+type+1+deficiency+in+bone+marrow-derived+cells+reduces+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">11-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 deficiency in bone marrow-derived cells reduces atherosclerosis.</a> FASEB J. 27 (4), 1519-1531 (2013).</li>
<li>Mackinnon, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+galectin-3+reduces+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice.</a> Glycobiology. 23 (6), 654-663 (2013).</li>
<li>Kumar, A., Lindner, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+with+neointima+formation+in+the+mouse+carotid+artery+after+cessation+of+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).</li>
<li>Walls, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+artefacts+in+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Correction of artefacts in optical projection tomography.</a> Phys Med Biol. 50, 4645-4665 (2005).</li>
<li>Walls, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+improvement+in+emission+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution improvement in emission optical projection tomography.</a> Phys Med Biol. 52, 2775-2790 (2007).</li>
<li>Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+methods+for+three-dimensional+reconstructions+from+confocal+images%3A+I.+tissue+shrinking+and+axial+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. tissue shrinking and axial scaling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 100, 135-143 (2000).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
</ol>

Yazarların rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

3-boyutlu analiz değiştirilmesi veya hala arteriyel lezyon oluşumu soruşturmaların çoğunluğu temelini 2 boyutlu histolojik teknikler ekleyerek için büyük bir potansiyele sahiptir. İşte OPT (muhtemelen bu tekniği kullanarak başarılı bir şekilde analiz edilebilir en küçük gemiler temsil fare femoral arterler ile), küçük fare arterlerde gösterilir. Ayrıca, bununla birlikte, damar (ve lezyonlar), küçük ve orta büyüklükteki gemiler, insan da dahil olmak üzere diğer türlerden gelen ile kullanım için uygundur; Grubumuzun başarıyla tavşan aort lezyonları analiz tekniği kullandı (Bezuidenhout ark;. yayımlanmamış). OPT geleneksel histoloji ile karşılaştırıldığında daha hızlı analiz ve artan yapısal bilgiler vaat ve histolojik ve immünohistokimyasal hem tekniklerini kullanarak numunenin sonraki analizlere engellemediğini avantajına sahiptir. OPT kullanılarak üretilen görüntüler lezyon oluşumu siteleri gösteren anatomik detay verdive bu alanda lezyon boyutu. Bu araştırmalarda kullanılan arterler nedenle (muhtemelen rotasyon hiza, eksik takas, yansıma / kırılma agaroz köşelerinde ve odaklama sorunlardan kaynaklanan) eserler belirli bir dereceye kadar bozulur tekniği ve görüntü kalitesi için çözünürlük sınırı muhtemelen yakın . Buna rağmen, gerekli bilgileri (örneğin, damar duvarının tabakalar) ayırt edilebilir kalır ve bu nedenle, teknik, tek tek tabakaların ölçümü için son derece yararlıdır. Gerçekten de, resim örneğinde seçilen alanlarda kabın plaka taşıyan bölümlerde lezyon ve luminal miktarlarının yanı sıra, lezyonun kesit alanları ve lümen sağlamak için hızlı ve yeniden üretilebilir bir miktarı olabilir. Büyük (aort) ve orta ölçekli (femur, karotid, subklavyen) sıçangil arterler - bu, genellikle farelerde aterosklerotik lezyon oluşumu ve neotintimal analizi için kullanılan - başarılı idiBu yöntemi kullanarak analiz edildi. Nitekim biz şimdi aterosklerotik lezyon ve neointimal boyutuna farmakolojik girişimler ve genetik manipülasyon etkisini göstermek için OPT kullandık. Vasküler endotel endotelin B reseptörü seçici silme 15 vermedi oysa Örneğin, endotelin reseptör blokajı neointimal lezyon oluşumu değişmiş. Ateroskleroz eğilimli farelerde, genetik enzimlerin silinmesi 11β-HSD1 16 veya galektin 3 17 aterosklerotik lezyonların boyutunu azaltmak için gösterildi. Lezyon hacmi miktarının OPT bariz bir faydadır. Genellikle histolojik yöntemlerle elde edilen daha bir arter 4 toplam lezyon yükünün daha detaylı şekilde göstermektedir. Tüm lezyonu analiz eden bir geminin ayrık bölümleri analiz için seçilen zaman kaçınılmaz oluşacak seçim yanlılığı ve hatayı azaltır. Boyuna lezyon profillerinin üretimi OPT bir başka gücüYaralanma 13,16 farklı (Şekil 5) tarafından uyarılan lezyonlar açısından vurgulanmıştır. Örneğin, tam ligasyonu ve tel yerleştirme hem femero-popliteal çatallanma yakın neredeyse tam tıkanıklık kaynaklı. Tel yaralanması, arter ligasyonu ile uyarılmış lezyonlar hızlı küçülmüş ve yok ise, taranan bölümünün bütün uzunluğu boyunca uzanan, ancak, üretilen lezyonlar. Bu model, anjiyoplasti, kılavuz telin yerleştirilmesi kaynaklanan yaralanma büyük ölçüde uyumludur. Histolojik kesitler kullanılarak benzer sonuçlar üreten pahalı, zaman alıcı ve emek yoğun. OPT avantajları (biz rutin günde 20 gemileri taranmış var) ürettiği görüntülerin kalitesini ve göreceli hız ve basitlik bulunmaktadır. Görüntü kalitesi 3 boyutlu görüntüler oluşturmak için diğer yöntemlere üstün veya en azından kıyaslanabilir görünür ex vivo, y (örneğin MR ve BT mikro gibi)et OPT (çalışmalarımız / resim genelde 1-2sec oldu entegrasyon süresi) ve daha az pahalı kısa tarama süreleri gerektirmektedir. Örnek hazırlama birkaç gün boyunca uzanır, ancak çok az iş gücü, gemi gruplar halinde hazırlanabilir gerektirir ve verileri tek bir oturumda elde edilebilir. Sonuç olarak, çıktı yüksektir ve tarayıcı genişletilmiş kullanımını gerektirmez. Önemlisi, OPT tahribatsız doğası immünohistokimyasal inceleme için ilgi siteleri belirlemek için kullanılabileceği anlamına gelmektedir; Bu şekilde kesme miktarını azaltmak ve gerekli boyama. Bu yüksek çözünürlüklü ultrason gelişme arterlerde lezyonlar bu boyutta hacimsel ölçümü için alternatif bir yöntem sağlamak olasıdır, ancak yazarlar bu uygulamayı gösteren herhangi yayınların farkında değiller. Belki şaşırtıcı, OPT görüntü kalitesi (tabii ki, yalnızca küçük örnekler üzerinde yapılabilir) mikroskobik tekniklerine geridedir. Önerilen iyileştirmeler reconstructio içinVerilerin n görüntü kalitesi 19,20 gelecekteki gelişme izin vererek bu sınırlama hitap edebilir. Başka bir metodolojik endişe doku işleme örneğinin özelliklerini değiştirir olmasıdır. Örneğin temizleme ajanı lipofilik doğası, benzil alkol / benzil benzoat (BABB), tabii ki, dehidrasyon ve lipid temizleme adımları da bir özelliği vardır, her ne kadar önceden dehidrasyon (daralmasına neden olabilir iken, aterosklerotik lezyonlar lipid çıkarmak olasıdır parafin gömme için numune hazırlama). BABB (örneğin, gliserol 21), morfoloji sadece küçük değişiklikler olur hidrofilik temizleme maddeleri ile karşılaştırıldığında, bu araştırmada kullanılmıştır. Özellikle kilit hücrelerin 3 boyutlu düzenleme, izleme ve arteriyel yeniden rol oynayan faktörleri sinyalizasyon konusunda OPT daha da gelişmesi ve arıtma için çeşitli olasılıklar vardır. örneğin a, atardamar dokusu güçlü otofloresansı,Anatomik görüntülerin nesil n avantaj, ağartma 22 mevcut yöntemlerle söndürülür değildir ve RNA ve protein dağıtım modellerini değerlendirmek için floresan probların kullanımını kısıtlayabilir. İletim görüntüleme ile görüntülendi kolorimetrik probların kullanımı (örneğin β-galaktosidaz) bu sınırlamanın üstesinden gelebilir. Sonuç olarak, OPT fare intimanın lezyonların 3 boyutlu görüntüleme için büyük bir potansiyele sahiptir. Genel olarak emek yoğun ve etkili bir şekilde, toplam lezyon hacmini temsil etmez 2 boyutlu yöntemler üzerinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. OPT nispeten hızlı, rahat ve tahribatsız. Görüntü analizi yeni gelişmeler daha da tekniğin gücünü ve yarar artırmak için söz veriyorum.

arteriyel lezyonların oluşumu kardiyovasküler hastalık 1 ile ilişkili yüksek morbidite ve mortalite merkezindedir. Lezyon oluşumu yaralanması 2 arteriyel dizginsiz bir inflamatuvar yanıt kaynaklandığı düşünülmektedir. Restenotik lezyonlar hızla (stent implantasyonu sonrası, örneğin), akut mekanik hasar takip geliştirmek oysa Aterosklerotik lezyonlar arter duvarına kronik zedelenme yanıt yavaş yavaş oluşturur. Arteriyel lezyonu gelişimine katkıda mekanizmaları genellikle ilgili genetik manipülasyonlar 1 ile kombinasyon halinde, uygun bir hayvan modelinde kullanılması ile önemli ölçüde açıklığa kavuşturulmuştur. Bu, in vivo ve ex vivo saptanması ve küçük hayvanların lezyon analizi için geliştirilmiş yöntemlere gelişimi ile değişmektedir, ancak lezyon boyutu ve bileşimi analizi, klasik (ex vivo 2 boyutlu dokusu üzerine yoğun bir şekilde bağlı olan &lt;sup&gt; 3). Arteriyel lezyonların Histolojik analiz emek yoğun, zaman alıcıdır ve 3-boyutlu yapının sınırlı bilgi içerir. Örneğin, lezyon yükü genellikle bir lezyonun enine kesit alanı ölçülerek değerlendirilir (ya rastgele seçilen alanlarda veya maksimum tıkanma yerinde). Bu genel lezyon yükünün eksik analizini sağlar. 3 boyutlu görüntüleme teknolojisi bu soruna olası bir çözüm sağlar ama şaşırtıcı birkaç uygun yaklaşım tarif edilmiştir tüm montaj. Bu manyetik rezonans görüntüleme (MRG) 4 ve X-ray bilgisayarlı tomografi (BT) 5 için tek foton konfokal mikroskopi için çok büyük ama çok küçük fare arterlerin boyutu ağırlıklı olarak bağlı olabilir. Farelerde aterosklerotik lezyonların çalışma ex vivo MR uygulanması ve mikro CT hatta nispeten büyük damarlarda sınırlı çözünürlük sunan göstermektedir. Bu eklendi, nispeten uzun kazanım süreleri gerekliverimi sınırlayan (ve tarama maliyetlerini artırmak) 4,6. (Örneğin optik koherens tomografi 3,7 ve fotoğraf-akustik tomografi 8 gibi) yeni optik görüntüleme yöntemlerinin geliştirilmesi fare arterlerde lezyonların görüntüleme geliştirmek için çok potansiyel sunmaktadır. Benzer bir potansiyel fare embriyoları analizini sağlamak için geliştirilen optik projeksiyon tomografi (OPT) ile gösterilir. OPT çapı 9 ~ 0,3-10 mm arasında değişen görüntü örneklerinde için tasarlanmıştır. İletim görüntüleme polikromatik görünür ışığa yarı saydam örnek opaklığını kaydeder ve anatomik yapıların tanımlanması için de kullanılabilir. Endojen belirli dalga boyunda (örneğin, kolajen, elastin) ve örnek eksojen fluorophores uyarma sonrasında ışık yayılmasının görüntülenmesi kayıt emisyonu. Farklı doku bileşenleri türü ve otofloresan türlerinin yoğunluk farklı olabilir, çünkü bu, aynı zamanda (anatomik bilgi sağlayabilirMevcut). Buna ek olarak, immüno veya gen ifadesi dağılımı, uygun floresan probları 10 kullanımı ile tespit edilebilir. Her iki görüntüleme modu (iletim veya emisyon), ışık örnek dönerken (0.9 ° &#39;lik artışlarla genellikle 400 görüntü) olarak iteratif görüntü yakalama izin vermek için bir şarj çiftli cihaza odaklanmıştır. Bunlar (örneğin koni algoritması kullanarak filtre arka projeksiyon () veya yinelemeli rekonstrüksiyonu gibi) standart tomografik rekonstrüksiyon yöntemleri ile hacminin hesaplanması için kullanılabilir. Daha önce Kirkby ve ark., 11&#39;de tarif edildiği gibi bu, video, aterosklerotik ve neointimal lezyon, hızlı bir şekilde ölçülebilir ve uygun maliyetli 3 boyutlu analiz için tercih bizim yeni bir uygulamasını göstermektedir. tekniği üç yaygın olarak kullanılan model lezyon büyüklüğü ölçülmesi için uygun olduğu gösterilmiştir: (i) femoral arter tel yaralanması; Apolipoprotei (ii) femoral arter bağlanması, ve (iii) diyetin neden olduğu aterosklerozunn E eksikliği (apo - / -) fareler.

<table><tbody><tr><td>Ameliyat Mikroskobu</td><td>Zeiss, Almanya</td><td></td><td>OPMI Pico i</td></tr><tr><td>Anestezik Makinesi</td><td>Vet Tech, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluovac</td><td>Harvard Aparatı İngiltere</td><td>340387</td><td></td></tr><tr><td>Fluosorber</td><td>Harvard Aparatı İngiltere</td><td>340415</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk Sterilizatörü</td><td>Güzel Bilim Aletleri, İngiltere</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>Isıtmalı Mat</td><td>İnce Sceince Tools, UK</td><td>21061-10</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS1602S</td><td>PB1502 veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Sütürler</td><td>Ethicon, UK</td><td></td><td>5/0 Mersilk</td></tr><tr><td>Guidewire</td><td>Cook Inc, ABD</td><td>C-PMS-251</td><td>0.014"</td></tr><tr><td>Sütür İpek</td><td>Güzel Bilim Aletleri, İngiltere</td><td>18020-60</td><td>6/0 Mersilk</td></tr><tr><td>Cerrahi Aletler</td><td>Güzel Bilim Aletleri, İngiltere</td><td>14058-09</td><td>Toughcut İris makası</td></tr><tr><td>Cohan-Vannas Bahar Makası</td><td>Güzel Bilim Aletleri, İngiltere</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forseps</td><td>Güzel Bilim Aletleri, İngiltere</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Moria Iris Forseps</td><td>Güzel Bilim Aletleri, İngiltere</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Sivrisinek Hemostat</td><td>Güzel Bilim Aletleri, İngiltere</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Bulldog klipsleri</td><td>Güzel Bilim Aletleri, İngiltere</td><td>18050-35</td><td></td></tr><tr><td>Biyotonik 3001 Tomografi ve nbsp;</td><td>Bioptonics, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic OPT Mount</td><td>Bioptonics, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell Inc, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Gilson</td><td>F117606</td><td>Minipuls 3</td></tr><tr><td>DataViewer yazılımı&nbsp;</td><td>Skyscan, Belçika</td><td>v.1.4.4</td><td></td></tr><tr><td>NRecon yazılımı&nbsp;</td><td>Skyscan, Belçika</td><td>v.1.6.8</td><td></td></tr><tr><td>CTan yazılımı</td><td>Skyscan, Belçika</td><td>v.1.12</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial Hayvan Sağlığı Ltd, İngiltere</td><td>AP/İlaçlar/220/96</td><td>%100 Soluma buharı, sıvı</td></tr><tr><td>Tıbbi Oksijen</td><td>BOC Medikal, Birleşik Krallık</td><td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td>Veterjezik</td><td>Alstoe Hayvan Sağlığı Ltd, İngiltere</td><td></td><td>0.3 mg / ml</td></tr><tr><td>% 1 Lignokain</td><td>Hamlen İlaç, İngiltere</td><td>LD1010</td><td>10 ml ampul</td></tr><tr><td>EMLA Krem</td><td>Astra Zeneca, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Pentobarbital</td><td>Ceva Hayvan Sağlığı Ltd, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Batı Diyet</td><td>Araştırma Diyetleri, ABD</td><td>D12079B</td><td>%0.2 kolesterol</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Sigma UK</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Heparin (Mukoza)</td><td>Leo Laboratuvarları, İngiltere</td><td>PL0043/003GR</td><td>250.000</td></tr><tr><td>Birim Nötr Tamponlu Formalin</td><td>Sigma, İngiltere</td><td>HT501128</td><td>%10</td></tr> <tr><td>Etanol</td><td>VWR BDH Prolabo, İngiltere</td><td>20821.33</td><td>Mutlak AnalaR&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen, Birleşik Krallık</td><td>16020050</td><td>Düşük erime noktalı</td></tr><tr><td>Filtre Kağıdı</td><td>GE Healthcare, Birleşik Krallık</td><td>113v</td><td>Whatman</td></tr><tr><td>Siyanoakrilat yapıştırıcı</td><td>Henkel, Birleşik Krallık</td><td>4304</td><td>Loctite</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma, UK</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma, İngiltere</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR BDH Prolabo, İngiltere</td><td>20856.296</td><td>%100</td></tr></tbody></table>

Üretim ve farelerde arteriyel lezyonlarının 3-boyutlu kantitasyonu optik projeksiyon tomografi ile

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

uygun hayvan modellerinde üretim ve vasküler lezyonların analizi lezyon oluşumu patogenezi ve yeni tedavilerin eylem hakkında önemli bilgiler üreten, kardiyovasküler hastalık araştırmalarına bir köşe taşıdır. Ateroskleroz eğilimli farelerde lezyon indüksiyon cerrahi yöntemler ve diyet modifikasyonu kullanımı dramatik hastalık gelişimi ve yeni tedavilerin potansiyeline katkıda bulunan mekanizmaların anlaşılmasını geliştirdi. Klasik, lezyonların analizi 2 boyutlu histolojik teknikler kullanılarak ex vivo yapılır. Bu makalede, arteryel lezyonların 3 boyutlu kantitatif optik yansıtma tomografi (OPT) uygulanmasını tarif etmektedir. Bu teknik, tahribatsız olarak, standart histolojik ve immünohistokimyasal analizler bir yardımcı olarak kullanılabilir. Neointimal lezyonlar fare femur sanat tel yerleştirilmesi veya ligasyonu ile uyarılan edildiAterosklerotik lezyonların iken ery apo-eksikliği olan farelerde bir aterojenik diyet uygulaması ile elde edildi. Lezyonlar tamamlayıcı histolojik ve immünohistokimyasal analizi ile takip autofluorescent emisyonunun OPT görüntüleme kullanılarak incelenmiştir. Altta yatan vasküler duvar açıkça ayırt lezyonlar OPT. Lezyon boyutu lezyon hacmi ve maksimum enine kesit alanına hesaplanmasına imkan veren, planimetrisi kullanılarak 2-boyutlu bölümler içinde hesaplanmıştır. OPT kullanılarak oluşturulan veriler tekniğin doğruluğunu ve analiz geleneksel yöntemlerle (yerine alternatif daha) bir tamamlayıcısı olarak potansiyel teyit histoloji kullanılarak elde edilen ölçümler ile uyumlu idi. Bu çalışma aterosklerotik lezyonların ve neointimal görüntülenmesinde OPT potansiyelini gösteriyor. Bu vasküler yeniden rutin 3 boyutlu ölçümü için hızlı, çok gerekli ex vivo tekniği sağlar.

Sağlıklı (lezyonsuz) fare femoral arterlerin ön tarama (n = 5) iletim görüntüleme yararlı görüntüleri vermedi gösterdi. Yayılan sinyalin hiçbir absorbans / saçılma olduğu gibi bu iletim imaging.However için çok şeffaf (yerine çok opak) olma temizlendi arterlerin bir sonucuydu, bu emisyon görüntüleme için faydalıdır. Bunun aksine, femoral arter (14 elastin için 410 nm eksitasyon zirve ile tutarlıdır) 405-445 nm&#39;de uyarma sonrasında büyük sinyal ile emisyon kanalına güçlü autofluoresce. Bu görüntülerden yeniden 2 boyutlu dilim açıkça lümenin ve adventisyanın ve lümen medya ayırt. Murin femoral arter 28 gün telsiz sonra (n = 6) ya da ligasyonu (n = 5) neden olduğu hasarı neointimal koyulaştırıcı olmayan tomografik salım çıkıntılar belirgindi (Şekil 3A) hasat edildi. Yeniden 2-DIMENS olarakional dilimleri, eş neointimal lezyonlar zayıf emisyon (Şekil 3B ve Şekil S1) tarafından medya ayırt edilebilir. Aterosklerotik farelerin OPT emisyon arkus tüm montaj örnekleri görüntüleri ve ana dalları (n = 8) ön görülen anatomik dağılım ile özdeşleşmiş lezyonlar (örn., Aort kavsi, brakiyosefalik arter ve kökenleri daha az eğrilik sol karotis ve sol subklavian arterlerin (Şekil 4A). kesit görüntüleri bu (Şekil 4B, S2 ve S3 Rakamlar), tipik olarak eksantrik lezyonlar ve kolayca medya ve lümen ayırt olduğunu göstermiştir. OPT aşağıdaki histolojik analiz için İşleme arterler başarıyla histolojik (Amerika Birleşik Devletleri Trichrome, Picr kullanılarak boyanan kesitler ile OPT tahribatsız doğa doğruladıosirius kırmızı) ve immünohistokimyasal (α-SMA, Mac-2) teknikleri (Şekil 3C ve 4C). OPT ile lezyon boyutu ölçümü aynı arter 11 alınan histolojik kesitlerin görüntü analizi kullanılarak elde edilen ölçümler ile uyumlu olduğu gösterilmiştir. Telsiz (R 2 = 0.92) ve ligasyon kaynaklı (R 2 = 0.89) neointimal lezyonlar ve aterosklerotik plakların (R = 0.85 2) için OPT ve lineer regresyon ile yakından ilişkili histoloji ile elde edilen lezyon alanının planimetrik ölçümleri. OPT önemli bir faydası 3 boyutlu analizini sağlamak için yeteneğidir. Bu teknikle lezyonların hacimsel ölçümü geliştirerek, telsiz lezyon hacimleri kaydetmek başardık (0,1100 ± 0,0091 mm, 3, n = 6) ve ligasyon-yaralı femoral arter (0,0200 ± 0.0089 mm 3, n = 5) ve aynı zamanda aterosklerotik brakiyosefalik arterlerde (0.180 ± 0.018 mm 3; n = 8). Ölçümler son derece tekrarlanabilir (sırasıyla varyasyon% 5,4 katsayıları,% 11.4 ve% 4.8, n = 4) olan lezyonun her türlü. Tel hasarlı damarların neointimal lezyon önceki açtığı hasar daha yüksek derecede uyumlu ligasyon ile üretilen, daha büyük (p &lt;0.0001) vardı. oluşturulan veriler de (Şekiller bkz S1 - S3) lezyon profillerinin (Şekil 5) olarak ifade edilir ve dinamik, nitel değerlendirme için render olabilir. Bu yaklaşım açıkça farklı yaralanma prosedürlerine yanıt lezyon oluşumu kapsamını gösterdi ve yaralı damarlarda lezyon oluşumu düzensiz dağılımı vurguladı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig1.jpg" /> Şekil 1: fare femoral arter lezyon oluşumunu başlatmak için Yöntemler &amp; #.160; popliteal arter bir arteriyotomi vasıtasıyla femoral artere kılavuz tel, bir anjiyoplasti (A) retrograd yerleştirme hasarı ve endotelyumun çıkarılması germek için yanıt olarak lezyon oluşumunu teşvik eder. Kan akışı, yaralı damar bölgesinden bölümü üzerine yeniden kurulur. Intraluminal streç, soyulma ya da kan akışına kesinti olmadan (B) neointimal proliferasyon femoral veya femoral arter bifurkasyonunun hemen distalinde popliteal arter ya bağlanarak tarafından uyarılan edilebilir. (C) daha şiddetli olmayan denuding yaralanma / çoğalması tepkisi femoral arter dal noktası üzerinde femoral ve popliteal arterler hem bağlanarak tarafından uyarılan edilebilir. Bu teknik aynı zamanda femoral arterin distal kısmına kan akışını engeller. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50627/50627fig2.jpg" /> Şekil 2:. 12 hafta arkus ve ana dallarında lezyon birikimi karakteristik desen geliştirmek için fare arkus içinde aterom karakteristik çökelme eğilimli Ateroskleroz (Apolipopotein E yoksun fareler), yüksek kolesterol batı diyet ile beslenen. Gösterildiği gibi, lezyonlar aort arkı, brakiyosefalik arterde, bir mikroskop altında brüt muayene ile, görünür (oklar), ve sol karotis arter ve sol subklavyen arter deliklerinin içinde. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50627/50627fig3.jpg" /> Şekil 3:. Sol femoral arter ligasyonu aşağıdaki Lezyon oluşumu (netlik artırmak için ters - karanlık bölgeler daha güçlü emisyon karşılık) (A) Sigara tomografik floresans emisyon görüntüleri intimal kalınlaşma tanımlanmasına izin (kırmızı arrowhereklamlar). (B) Farklı vasküler bölgeler ve lümen tomografik rekonstrüksiyonlarında ayırt edilebilir. (C) histolojik analizi (Amerika Birleşik Devletleri trichrome) OPT kullanılarak elde görüntüleri ile açık benzerlik vurguluyor. (AC) Ölçek çubukları 200 mm&#39;dir. Kirkby ark. (AC) 11 Ölçek çubukları uyarlanmıştır 200 mikron bulunmaktadır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50627/50627fig4.jpg" /> Şekil 4:. Aortik arkın (koyu bölgeler, böylece berraklığını geliştirmek, daha güçlü bir emisyon göstermektedir, böylece ters) ateroskleroz eğilimli farelerin aortik arkında ateromanın Görüntüleme (A) ateromlar (kırmızı ok başları), hali hazırda olmayan tomografi belirgindir siteleri (Şekil 2) ışık mikroskobu altında incelenmesi ile ateroma-yatak olarak öngördü. (B) dağılım Bu model tomografik cr teyit edilmiştiross-kesitler. (C) histolojik (Amerika Birleşik Devletleri trichrome) boyama lezyon analizi, geleneksel yaklaşımlara OPT tamamlayıcı doğasını birkaç farklı antikorları vurgulayan kullanarak yakın tomografik kesitler ile benzerlik ve immunohistokimyasal gösterir. (A-B) &#39;de Ölçek çubukları 1 mm; (C) &#39;deki ölçek çizgisi 250 mm. RSA, sağ subklavian arter; RCA, sağ karotid arter; LCA, sol karotid arter; LSA, subklavian arter sol; BCA, brakiyosefalik arter; AAo, asendan; Dao, inen aorta. Kirkby ark uyarlanmıştır. 11 <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50627/50627fig5.jpg" /> Şekil 5: lezyon ve lümen profillerinin analizi arteriyel yaralanma farklı yöntemler cevaben neointimal çoğalma ölçüde değişen belirtir Optik projeksiyon tomografi lezyonu izin verir ve lümen kesit ÖLÇME çapraz.ts femoral arter boyunca mesafeye karşı çizilecek. Bu açık bir şekilde, toplam bağlanma (C), ligasyon yerinde tam t üretir ancak lezyon arter boyunca kadar uzanmaz, oysa bir zarar görmemiş arter (A), kısmi ligasyonu (B) ile karşılaştırıldığında, küçük, nispeten ayrı lezyonlar, göstermektedir . Lumen kablo hasarı (D) hemen hemen tamamen numunenin uzak kısmını emen ve arter taranmış bölümünün bütün uzunluğu boyunca uzanan bir lezyon verir. Kirkby ark uyarlanmıştır. 11 Şekil S1. Ligasyon yaralanmasını izleyen bir fare femoral arterden alınan kesit görüntüleri Hareketli rekonstrüksiyonu. Animasyonlu resim Bu tip hem kalitatif ve kantitatif analiz için yararlıdır. Animasyon arterin distal bölümlerine proksimal bir tıkayıcı neointimaya kademeli gelişimini hareket ettikçe, disklumen ve ortamdan ernible, hali hazırda belirgindir. Yan dallar kolaylıkla tespit edilebilir ve belirgin lümen tıkanıklığı ve boyutu lezyon arttıkça arterin dışa biçimlenme vardır. Ligasyon site ulaşıldığında geminin tam tıkanma meydana gelir. Kirkby ark uyarlanmıştır. 11 .. (- Ilk göründüğünde sol) ve azalan (sağ) aort Şekil S2, bir ateroskleroz eğilimli fare aort arkın kesit görüntüleri Hareketli yeniden canlandırma yükselen kesitleri ile başlar. Küçük lezyonlar arkus yönünde tarama hamle olarak çıkan aorta görünür. Görüntüler daha sonra brakiyosefalik (solda), sol karotis (orta) ve sol subklavian (sağ) arterlerin ağır lezyonlu ostiumları göstermek için kemer dolaşmak. Tarama Bu dalların boyunca distal hamle olarak lezyonlar yavaş yavaş subc ilk azaltmak ve yoklavian arter, daha sonra karotid ve son olarak brakiyosefalik arter. İlginçtir ki, bu geminin gibi akış bölücü üzerine brakiyosefalik arter hamlede lezyon sağ karotis ve sağ subklavian arterlerin ayrılır. Kirkby ark uyarlanmıştır. 11 Şekil S3. Animasyon, bir ateroskleroz eğilimli fare aort arkın hacim görüntü render. Optik projeksiyon tomografi bir apolipoprotein E eksik fare aortik arkında lezyon dağılımını gösteren bu durumda, 3 boyutlu görüntülerin nesil verir. (A) Aterom (sol karotis ve subklavian arterlerin çıkımının ve arkus daha az eğrilik, brakiyosefalik arter boyunca) beklenen siteler mevcuttur. Orijinal görüntünün üzerine bindirilmiş zaman kesitler taşıyan (B) Segmentasyon ve (kırmızı ile gösterilen) lezyon oluşturma plakların dağılımını vurguluyor.Kirkby ark uyarlanmıştır. 11

Kardiyovasküler hastalığın hayvan modellerinden arteriyel lezyonların ex vivo analizi klasik olarak histolojik ve immünohistokimyasal tekniklere dayanır. Bunlar 3 boyutlu lezyonlarda 2 boyutlu ölçümler sağlar. Bu el yazması, optik projeksiyon tomografisi kullanılarak 3 boyutlu kantitatif analiz için arteriyel lezyonların oluşumunu açıklamaktadır.

Üretim ve Farelerde arteriyel Lezyonlarının 3-Boyutlu kantitasyonu Optik Projeksiyon Tomografi ile

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Bu prosedürün genel amacı, optik projeksiyon tomografisinin faredeki ateroslerotik ve neointimal lezyonların görselleştirilmesi ve üç boyutlu kantitasyonu için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle farelerde ya cerrahi olarak ya da ateroskleroz geliştirmeye yatkın farelere yüksek kolesterollü diyet verilerek arteriyel lezyonlar oluşturularak gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, hedef arterin izole edilmesi ve optik projeksiyon tomografisi kullanılarak taranmasıdır.Son aşamalar; görüntü yeniden yapılandırmasının gerçekleştirilmesi, lezyonun tanımlanması ve lezyon hacminin ölçülmesidir. Nihayetinde sonuçlar, görüntü analizi yoluyla lezyonun anatomik yeniden yapılandırmalarını ve lezyon hacmi ile arteriyel daralmanın miktar tayinini gösterebilir. Grubumuz, kalp krizi ve inme gibi yaşamı tehdit eden komplikasyonlara yol açan arteriyel daralmaya neden olan lezyonların oluşumunun altında yatan mekanizmaları anlamakla ilgilenmektedir.Optik projeksiyon tomografisinin bu uygulaması, grubumuzda Dr. Lucy Lowe ile birlikte çalışan Dr. Nicholas Kirkby tarafından geliştirilmiştir ve laboratuvarlarımızda çalışan doktora sonrası araştırmacı Dr. Jung Shi Wu tarafından gösterilecektir. Bu tekniğin histoloji ve immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha az emek gerektirmesi ve iki boyutlu yerine üç boyutlu analize olanak sağlamasıdır. Femoral arter lezyonlarını indüklemek için kullanılan bu teknik, R ve arkadaşları ile Sada ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntemlerden modifiye edilmiştir.Metin protokolü, diyet manipülasyonu ile aterosklerotik lezyonların nasıl indükleneceğini açıklamaktadır. 25 ile 30 gram arasında ağırlığa sahip, 10 ila 12 haftalık bir C 57 black six fare ile başlayın. Fare anestezi altındayken, vücut sıcaklığını korumak için onu sıcak bir ped üzerine yerleştirin ve burun konisi aracılığıyla %2 ila 3 oranında isoflurine sağlayın.Fare ayak parmağı sıkıştırmasına yanıt vermediğinde, kilogram başına 0.1 miligram buprenorfin uygulayın. Ardından, fareyi sırt üstü yatırın ve sol arka ekstremitenin ventral yüzeyini tıraş edin. Daha sonra, popliteal arterin çatallanması ile abdominal duvar arasında kalan üst arka ekstremite kaslarını açığa çıkarmak için bir insizyon yapın.Prosedür boyunca femoral siniri, femoral arter ve venden ayırmak için künt diseksiyon yapın. Dokuları %1 ağırlıkça hacimce li canine ile nemli tutun. Ardından, abdominal duvarın yakınına ve popliteal arterle olan dallanmanın hemen altına femoral arter ve ven etrafına geçici 6.0 Mers ipek ligatürler yerleştirin.Bunlar kan akışını kontrol etmek içindir. Ardından, femoral arterle birleştiği branşın iki ila beş milimetre distalinden popliteal arteri izole edin ve popliteal arterin altından ligasyon yapın. İkinci bir ligatür yerleştirin.Şimdi, popliteal arterde, femoral arter ile birleştiği dalın hemen distalinde, tel yerleşimi için küçük bir insizyon yapın. İnsizyondan sızan kanamanın femoral arter üzerinden abdominal duvara doğru ilerlemesini önlemek için proksimal geçici ligatüre basınç uygulayın. Yaklaşık 1 ila 1,5 santimetre boyunca 0.014 inç G tel yerleştirin.30 saniye boyunca yerinde bırakın ve ardından çıkarın. Daha sonra ligatürleri kullanarak, insizyonun üzerindeki popliteal arteri bağlayın. Femoral arteri tıkamamaya dikkat edin.Şimdi geçici ligatürleri çıkarın. Yarayı 5.0 mercal kullanarak kesintili sürekli sütürlerle kapatın. Ardından EMLA krem uygulayın.Hayvanı ana kafesine döndürmeden önce, iyileşme kafesinde bilincinin ve hareket kabiliyetinin geri kazanmasını bekleyin. Bacakta iki veya üç gün boyunca topallık görülmesi beklenir, ancak bu durum farenin izole edilmesi gerektiği anlamına gelmez. OPT için fare, pentobarbital ile terminal anestezi uygulanarak ötanize edilmelidir.Ardından, kan boşaltma işlemiyle birlikte transkardiyak perfüzyon fiksasyonu yapın. Şimdi femoral arterleri veya aortik arkı ve dallarını izole edin. İşlem sırasında çevredeki tüm yabancı materyalleri temizleyin.Ardından dokuyu %10 nötral tamponlu formalinde gece boyunca sabitleyin. Ertesi gün dokuyu %70 etanolde saklayın veya arterleri filtrelenmiş %1,5 LMP aeros içerisine gömme işlemine geçin. Dokuyu yaklaşık 40 °C sıcaklıktaki erimiş aeros içerisine yavaşça daldırın.Konik bir şekil oluşturmak için aerosları kesin. Şimdi bu preparatı %100 methanol içinde en az 12 saat boyunca dehidre edin. Dehidrasyon tamamlandıktan sonra, kapları bir iki oranında benzo alkol ve benzo benzoat karışımı ile şeffaf hale getirin.Kapların bu solüsyonda 12 ila 24 saat boyunca inkübe edilmesini sağlayın. Ertesi gün, temizlenmiş örneği önceden kalibre edilmiş olan tomografa yükleyin. Çözünürlük 1024 olarak ayarlanmıştır.1024 piksel tarafından. İlgilenilen alan için büyütmeyi ayarlayın. Z ekseni otomatik olarak aynı çözünürlüğe ayarlanacaktır.Voksel boyutu yaklaşık 200 mikron olacaktır. Ardından, Brightfield kanalı kullanılarak numunenin, görüş alanının merkezinde kendi ekseni etrafında dönecek şekilde konumlandırılmasını sağlayın. GFP filtresi emisyon kanalını kullanarak odaklamayı yapın ve görüntünün dinamik aralığını maksimize etmek için pozlama süresini ayarlayın.Aşırı doygunluktan kaçının. Şimdi kabı sadece GFP 1 emisyon kanalında 0,9 derecelik adımlarla tarayın. Örnekler daha sonra, parafine gömülmeden önce en az 24 saat boyunca %100 metanolde bekletilmelidir.Histolojik analiz için, elde edilen görüntüleri veri görüntüleyici yazılım kullanarak n recon yazılımında veya benzeri bir yazılımda açın. Görüntü rekonstrüksiyon kalitesini kontrol edin, görüntü kalitesini artırın, görüntü yoğunluğunu ayarlayın ve yazılımın numunenin ideal rotasyon ekseninden herhangi bir kaymasını telafi etmesini sağlayın. Her tarama için lezyonu içeren dikey ilgi alanını tanımlayın.Her 50. tarama satırında, medya ile internal elastik lamina konumu arasındaki sınırı çizin. Yazılım daha sonra bu sınırı diğer tüm taramalarda enterpole edebilir; bu enterpolasyonları manuel olarak kontrol edin ve gerektiğinde düzeltin. Şimdi, beyaz piksellerin neointimayı ve siyah piksellerin patent lümeni temsil ettiği bir ikili görüntü seti oluşturun.Bu işlem, yoğunluk eşiklerinin tanımlanmasıyla gerçekleştirilir. Bu işlem tamamlandığında, nesne hacmi toplam lezyon hacmini; lümen hacmi ise toplam hacimden nesne hacmi çıkarıldığında elde edilen değeri temsil eder. Böylece, lezyon ve lümenin aksiyal uzunluk boyunca dağılımı değerlendirilir.Fare femoral arterleri, tel ile indüklenen veya ligasyonla indüklenen yaralanmadan 28 gün sonra toplandı. Rekonstrüktif iki boyutlu slaytlardaki emisyon projeksiyonlarında neointimal kalınlaşma belirgindi. Konsantrik neointimal lezyonlar ayırt edilebildi.APOE eksik bir fareden alınan tüm aort arkının optik projeksiyon tomografi emisyon görüntüleri; aort arkının küçük eğrisinde, brakiyosefalik arterde, sol karotid ve subklavyen arterlerin başlangıç noktalarında beklenen lezyonları belirlemiştir. Aynı lezyon segmente edilmiş ve kırmızı renkle görselleştirilmiştir. Orijinal görüntü üzerine bindirildiğinde plakların dağılımını vurgulamak için, kesit görüntülerinde media ve lümen ayırt edilebilmiş ve bunların eksantrik lezyonlar olduğu gösterilmiştir.Burada, tarama bu dallar boyunca distal yöne doğru ilerledikçe, lezyonlar kademeli olarak azalır ve önce subclavian arterde, ardından carotid arterde ve son olarak brachiocephalic arterde kaybolur. İlginç bir şekilde, brachiocephalic arterdeki bu lezyon, bu damarın sağ carotid ve sağ subclavian arterlere ayrıldığı akım ayırıcıya (flow divider) doğru ilerler. OPT prosedürünün ardından, lezyonun bileşimi nedir gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla histoloji ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, vasküler araştırma alanında çalışan bilim insanlarının, neointimal ve aterosklerotik lezyonların gelişiminde endotel reseptörlerinin, lektinlerin ve steroid metabolize eden enzimlerin rolünü araştırmalarının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, optik projeksiyon tomografisi kullanarak rine arterlerinden lezyonların nasıl elde edileceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir kavrayışa sahip olmalısınız.

generation-3-dimensional-quantitation-arterial-lesions-mice-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

MicroCT tarafından Kontrastlı küçük hayvan damar görüntüleme seri için hızlı, düşük maliyetli ve yüksek verimli...

Kontrast Geliştirilmiş Gemi Görüntüleme MicroCT kullanarak

Koroner damarların görüntülenmesi kardiyovasküler hastalıkların bizim anlayışın geliştirilmesi için çok önemlidir. Burada mikro-Bilgisayarlı Tomografi (μCT) görüntüleme için hazırlık, bir radyoopak silikon kauçuk (Microfil) ile sıçan koroner damar perfüze için bir yöntem açıklanmaktadır.

Mikro Bilgisayarlı Tomografi Görüntüleme için hazırlık olarak retrograd perfüzyon ve Fare Koroner damarları doldurulması

Histokimyasal ve immünohistokimyasal analizle birlikte aort sinüsünün ve çıkan aortun hassas kesitini kullanarak fare modellerinde aterosklerotik lezyonları ölçmek ve karakterize etmek için prosedürleri açıklıyoruz.

Murin Aort Sinüsünde Aterosklerotik Lezyonların Kantitatif Analizi ve Karakterizasyonu

Floresan aracılı tomografi (FMT) ile mikro bilgisayarlı tomografiyi (μBT) birleştiren hibrit görüntüleme için bir protokol tarif ediyoruz. Füzyon ve rekonstrüksiyondan sonra, floresan dağılımının kantitatif ölçümlerini çıkarmak için etkileşimli organ segmentasyonu gerçekleştiriyoruz.

Hibrid uCT-FMT görüntüleme ve görüntü analizi

Otolog ve allojenik kemik greft implantasyonu önemli kraniofasial kemik kaybını tedavi yaklaşımları kabul teşkil. Oysa neovaskülarizasyon, hücre farklılaşması ve kemik oluşumu arasındaki etkileşime greft bileşiminin etkisi belirsizdir. Biz greft yakınlık anjiyogenez-osteogenesis bağımlılığın aydınlatmak için amaçlandığı multimodal görüntüleme protokol mevcut.

Bilgisayarlı Tomografi ve Osteogenezi-anjiyogenez bağlamalar Optik Görüntüleme Kranial Kemik Otogreftlerin ve allogreft Entegrasyon değerlendirmek için

Bu protokol serebral emboli görselleştirmek için kombine yakın kızılötesi floresan (NIRF) görüntüleme ve mikro-bilgisayarlı tomografi (mikroBT) uygulanmasını açıklar. Bu teknik trombüs yükü ve evrim ölçümü sağlar. MikroBT'lerin tekniği altın nanopartiküller kullanarak canlı hayvan içinde trombüs görüntüler ise NIRF görüntüleme tekniği floresan, eksize beyinde trombüs etiketli görselleştirir.

Doğrudan Serebral emboli görselleştirme için Kombine Yakın kızılötesi Floresan Görüntüleme ve Mikro bilgisayarlı Tomografi

Burada, damar oluşumu içinde vivo görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve gerçek zamanlı olarak 3D İskele tarafından multiphoton mikroskobu. Genetiği değiştirilmiş iskele anjiogenez bir fare grefti kritik Kemik defekti modelinde incelenmiştir. Daha fazla yeni kan damarları tedavi grubunda denetimlerde tespit edildi.

Angiogenez Multiphoton mikroskobu In Vivo genetiği değiştirilmiş 3D-PLGA/nHAp İskele tarafından grefti kritik Kemik defekti tamir için görselleştirme

Ateroskleroz murine modelleri, moleküler düzeyde patojenik yolları araştırmak için yararlı araçlardır, ancak lezyon gelişimi için standartlaştırılmış bir ölçmek gerektirir. Bu protokol, aort kökü, Aort kemer ve brachioksefalik arter dahil olmak üzere ana arter damarlarında lezyon boyutunu belirlemek için optimize edilmiş bir yöntem açıklanmaktadır.

Fareler içinde ateroskleroz ölçümü

Burada, mikro-X-ışını bilgisayarlı tomografi kullanarak murine arka eks uzuv damarları için bir görselleştirme ve niceleme yöntemini açıklıyoruz.

Murine Hind-limb Damarlarının Bilgisayarlı Tomografi Tabanlı Üç Boyutlu Görselleştirilmesi için Örnek Hazırlık

Burada, murin aortunu üç boyutlu (3D) olarak görüntülemek için optimize edilmiş doku temizleme protokolleri sunuyoruz. Aterosklerozda adventiti ve aterosklerozda periferik sinir sisteminin aterosklerotik plaklarla anatomik yakınlığını tanımlamak amacıyla immün boyama, optik temizleme ve görüntüleme için son teknoloji prosedürleri betimliyoruz.

Aterosklerozda Aort Dokularının Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Öğrenin farelerdeki arteriyel lezyonların optik projeksiyon tomografi ile üç boyutlu görselleştirilmesi ve kantitatif analizi yöntemini. Bu teknik aterosklerotik ve neointimal lezyon hacmini ölçerek kardiyovasküler hastalık mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Üretim ve Farelerde arteriyel Lezyonlarının 3-Boyutlu kantitasyonu Optik Projeksiyon Tomografi ile

Daha fazla video keşfet