Mikroalglerden yağlı asit içeriği ve bileşimi analizi

Bu prosedürün genel amacı, mikroalglerdeki toplam yağ asidi içeriğini ve kompozisyonunu ölçmektir. Bu işlem, öncelikle bilinen miktarda liyofilize alg biyokütlesi içeren bir numunenin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise mikroalg biyokütlesinin parçalanmasıdır.

Ardından, lipofilik bileşenler ekstrakte edilir ve izole edilir. Son adım, ACell lipidlerinin yağ asidi metil esterlerine transesterifikasyonudur. Nihayetinde, yağ asitlerini miktarlandırmak için gaz kromatografisi kullanılır.

Bu tekniğin trik tayinleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok hassas olması ve tüm yağ asitleri ile diğer tüm lipofilik bileşenleri spesifik olarak ölçmesidir. Prosedürü, laboratuvarımızdan teknisyen NDI Afer gerçekleştirecektir. Bu prosedüre başlamadan önce, listedeki referansta ayrıntıları verildiği üzere, kültür sıvısındaki alglerin litre başına gram cinsinden kuru ağırlık konsantrasyonunu belirleyin. Beş ila 10 mg alg kuru ağırlığı içeren bir hacimde kültür sıvısını cam santrifüj tüpüne aktarın.

Daha önce belirlenen biyokütle konsantrasyonunu kullanarak transfer edilen kesin biyokütle miktarını hesaplayın; örneği 1200 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanın bir kısmını atarak tüpte yaklaşık 0.25 mililitre bırakın. Ardından, pellet'i pipetle nazikçe aşağı yukarı çekerek algleri kalan süpernatanda yeniden süspanse edin ve hücre karışımını bir bead beater tüpüne aktarın.

200 µL'lik bir pipet kullanarak, santrifüj tüpünü ve pipet ucunu ± 0,15 mL milli-q su ile durulayın ve sıvıyı boncuklu parçalayıcı (bead beater) tüpüne aktarın. Tüpün tabanında hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için boncuklu parçalayıcı tüpü maksimum RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. İşlem tamamlandığında, tüpteki materyali buna uygun olarak liyofilize edin.

Kloroform ve metanolün güçlendirilmiş hacim oranında, 50 miligram litrede trip Penta Deano çözeltisi hazırlayın. Pozitif deplasmanlı bir pipet kullanarak, boncuklu tüpe bir mililitre tripod, no çözeltisi ekleyin. Boncuk dövücü tüpün kapağının içinde boncuk kalmadığından emin olun, aksi takdirde tüpün boncukları sızacaktır.

Boncuklu tüpü, her seferinde 60 saniye sürecek şekilde, her boncuklama işlemi arasında 122 saniyelik bir ara vererek 2,500 RPM hızda sekiz kez çalıştırın. Ardından, boncuklu çözeltiyi boncuklu tüpten, Teflon insertli vidalı kapağı olan temiz, ısıya dayanıklı 15 mililitrelik cam santrifüj tüpüne aktarın. Boncuklu tüpü bir mililitre tripod, no çözeltisi ile yıkayın ve yıkama sıvısını cam santrifüj tüpüne aktarın.

İşlemi iki kez daha tekrarlayın. Numuneyi beş saniye boyunca vorteksleyin ve ardından 10 dakika boyunca sonike edin. Sonikasyonun ardından, santrifüj tüpüne 50 millimolar triss ve bir molar sodyum klorür içeren, pH yedi milli cube su çözeltisinden 2.5 milliliters ekleyin.

Numune vortekslenip ikinci kez sonikasyona tabi tutulduktan sonra, 1200'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. İşlem tamamlandığında, alt kloroform fazını bir cam pastör pipeti kullanarak dikkatlice temiz bir cam tüpe aktarın ve ekstraksiyonu bir mililitre kloroform ile tekrarlayın. İşlem bittiğinde, kloroform fazını bir cam pastör pipeti kullanarak toplayın ve ilk kloroform fraksiyonu ile birleştirin.

Kurutulmuş ekstrakte lipidleri elde etmek için kloroformu bir azot gazı akımı kullanarak uçurun. Ardından, kurutulmuş ekstrakte lipidleri içeren tüpe %5 sülfürik asit içeren üç mililitre metanol ekleyin ve tüpü sıkıca kapatın. Numuneyi beş saniye boyunca vorteksleyin.

Numuneleri bir blok ısıtıcıda 70 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Numunelerin kaynamadığından periyodik olarak emin olun ve her kontrol sonrası tüpü vorteksleyin. Numune oda sıcaklığına soğuduğunda, tüpe 3 mL milli-Q su ve 3 mL n-hekzan ekleyip vorteks ile karıştırın.

Numuneyi bir tüp rotatörü ile 15 dakika boyunca karıştırın. Numuneleri tüp rotatöründen çıkardıktan sonra, 1200 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Cam bir past pipet kullanarak, üstteki heksan fazından iki mililitre toplayın ve bunu temiz bir cam tüpe aktarın. Toplanan heksan fazını yıkamak için cam tüpe iki mililitre milli Q su ekleyin.

Ardından örneği beş saniye boyunca vorteksleyin ve beş dakika santrifüjleyin. 1200 Gs hızında, heksan fazını cam tüpten bir cam pastör pipeti kullanarak bir GC şişesine aktarın. Daha sonra GC şişesinin kapağını kapatın ve solvent buharlaşmasını önlemek için iyice sıkın.

Numune şişesini GC fit cihazının otomatik örnekleyicisine yerleştirin. Son olarak, 20 milliliters per minute toplam akış hızı ve one microliter enjeksiyon hacmi kullanarak, yeni bir kapiler kolon ile numuneyi cihazda analiz edin. Kolon spesifikasyonları ve kromatografik koşullar için metin protokolüne bakınız.

Bu işlem yoluyla elde edilen tipik bir kromatogram burada gösterilmiştir. Yağ asidi metil esterleri, GC kolonu tarafından boyutlarına ve doygunluk derecelerine göre ayrılır; kullanılan protokolde daha kısa zincir uzunluğuna sahip yağ asitleri ve daha doygun yağ asitleri daha kısa alıkonma sürelerine sahiptir. Kullanılan GC kolonu ve protokolü yağ asidi izomerlerini ayırmayı amaçlamamaktadır, ancak bu durum farklı bir GC kolonu ve protokolü kullanılarak gerçekleştirilebilir.

C Desus UEX 3 93'ün hem azot yeterli hem de azot yoksunu koşullardaki yağ asidi içeriği ve bileşimi burada gösterilmiştir. Toplam yağ asidi içerikleri, sırasıyla azotça zengin ve azot yoksunu kültürel koşullar altında 8.6 ± 0.5% ve 44.7 ± 1.7% olarak belirlenmiştir. Bu değerler, yağ asidi bileşiminin ve içeriğinin azot açlığından yüksek derecede etkilendiğini kanıtlamaktadır.

ESBL'de en bol bulunan iki yağ asidi palmitik asit ve oleik asittir. Yağ asidi içeriğinin ve kompozisyonunun hesaplanmasına ilişkin ayrıntılar için metin protokolüne bakınız. Hem nitrojen açısından yeterli hem de yetersiz koşullar altında Odum Trico UEX 6 4 0'ın yağ asidi içeriği ve kompozisyonu burada gösterilmiştir.

Eğik UUs'lara benzer şekilde, yağ asidi içeriği ve kompozisyonu azot açlığından yüksek düzeyde etkilenir. Azotun yeterli olduğu ve yoksun olduğu koşullar altında toplam yağ asidi içerikleri sırasıyla 11.7 ± 0.9% ve 30.5 ± 1.1% olarak belirlenmiştir. P trium ayrıca I csap ve Penta IC acid gibi yüksek düzeyde doymamış yağ asitlerini de önemli miktarlarda üretir.

Ek olarak, lignerik asit gibi çok uzun zincirli yağ asitleri de bu yöntemle tespit edilebilir. Bu prosedür, protokol metnindeki referanslarda açıklandığı üzere, mikro LG'nin lipid sınıf kompozisyonu hakkında ek bilgi edinmek için lipid ekstraksiyonu ile transesterifikasyon adımı arasına bir lipid pıhtı ayırma adımı eklenerek genişletilebilir.