Name: Yaşam Maya Hücreleri Mitokondriyal Redoks Devlet ve ATP ölçün oranlı metrik Biyosensörler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Öğrenin, yaşam maya hücrelerinde mitokondriyal redoks durumu ve ATP seviyelerini orantılı GFP biyosensörleriyle ölçme yöntemini. Bu teknik, hücresel metabolizma ve mitokondriyal sağlık araştırmalarında gerçek zamanlı analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma HHMI 56006760 dan (GM45735, JDV, DMAW için Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) (2 1 TL RR 24.158-6), ve Ellison Tıp Vakfı (AG-SS-2.465) ve NIH ödül tarafından desteklenen GM45735S1 ve GM096445) LP. GM45735S1 Amerikan Kurtarma ve yeniden yatırım Yasası 2009 altında NIH yayınlandı. Bu çalışmalar için kullanılan mikroskoplar bir NIH / NCI hibe (5 P30 CA13696) ile kısmen desteklenmiştir.

1. Biyosensörler ile Maya Hücreleri Dönüşüm <ol><li> Lityum asetat yöntemi 27 kullanarak plazmid taşıyan mito-roGFP veya mitGO-ATeam2 ile istenilen maya suşu Transform. </li><li> Plazmid kaynaklı biyosensör ile dönüşüm onaylamak ve plazmid kaybını önlemek için, seçin ve uygun seçici sentetik tam orta (mito-roGFP için SC-Ura, veya mitGo-ATeam2 için SC-Leu) üzerinde transformantlar korumak. Floresan prob burada tarif edilenden farklı bir plazmide alt klonlanmıştır ise, uygun seçici orta kullanın. Onlar floresan biyosensör ifade onaylamak ve normal mitokondriyal morfoloji sergilemek floresan mikroskobu ile transformantlar gözünüzde canlandırın. </li></ol> 2. Görüntüleme için Hücreler ve Hazırlık Büyüme Hücre fonksiyonu ve ilaç tedavisine yanıt hücre yoğunluğu ve metabolik aktivite son derece bağlıdır. En iyi sonuçlar elde edilir; hücreaktif (- 1 x 10 7 hücre / ml orta-log fazı, ~ 0.5) bölünmesi vardır. Tutarlı yoğunluğu orta log fazı kültür oluşturmak için en güvenilir yolu sabit bir faz öncesi kültürden aşılamak için. <ol><li> Bir sabit faz ön-kültür hazırlanması: bir tabaktan dönüştürülmüş hücrelerin tek bir koloni almak ve seçici sıvı ortam (50 ml konik bir tüp içinde alt-5 mi) inoküle. 600 nm (OD 600) de kültürün optik yoğunluk bir plato (24-48 saat) ulaşıncaya kadar 225 rpm&#39;de sallayarak ile 30 ° C de büyür. </li><li> Gözlem için bir orta log fazı kültürü hazırlanması: 50 ml konik bir tüp içinde alt-seçici ortam 5 ml inoküle etmek üzere ön-kültür, uygun hacmi kullanın. YPD ortamı autofluorescent ve bu çalışmalar için kullanılmamalıdır. Sentetik tam, glukoz tabanlı, bırakma (SC-Ura) ortamları kullanın. Onlar orta-log fazı (- 1 x 10 7 hücre / ml ~ 0.5) ulaşana kadar, 4-16 saat, 225 rpm sallayarak, 30 ° C&#39;de hücreleri büyütün. Hücre yoğunluğu belirlenebilirOD 600 ölçerek, doğru OD 600 okuma belirlemek için spektrofotometre kalibre. Bizim Beckman DU530 (IN Beckman Coulter, Indianapolis,) On, orta-log fazı 0.1-0.3 bir OD 600 karşılık gelir. </li></ol> Mito-roGFP1 metabolik değişimler nedeniyle organelde duyuları dalgalanmalar. Örneğin, bu deneyde, mitokondriyal redoks durumu değişiklikleri maya fermente edilebilir karbon kaynağı (örneğin glükoz, SC medya gibi) karşı olmayan fermente edilebilir karbon kaynağı (örneğin, gliserol gibi SGlyc medya) büyümeye ne zaman ve hatta aynı farklı kısımlarındaki medya. Bu nedenle, tüm deneyler için aynı ortam toplu kullanın. <ol start="3"><li> Hiçbir tedavi yapılıyorsa Hücreler konsantrasyon hazır (adım 2.4) ve görüntüleme vardır. Hücreleri tedavi ediliyor, uygun tedavi ile hücreleri inkübe ve bir sonraki adıma geçin. </li><li> 15 saniye boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj ile kültüre 1 ml konsantre veOrtam 20 ul hücre pelet yeniden süspanse. Bu koşullar, görüş alanında ayırt hücrelerin sayısını en üst düzeye çıkarmak. </li><li> Bir slayt için yeniden süspanse hücre 2 ul uygulayın. Bir lamel (No 1.5, tercihen yüksek performanslı 170 ± 5 mikron kalınlığında) ile kaplayın, ve net oje veya valap (Reaktifler bakınız) ile lamel kenarları mühür. Valap ile mühür, lamel kenarları boyunca küçük bir miktar yayılır sonra, bir Bunsen beki alev üzerinde tutarak bir metal spatula üzerinde küçük bir miktar eritebilir. </li><li> Görüntüleme sırasında 30 ° C&#39;de hücreleri koruyun. Görüntüleme için kullanılan 100x immersiyon yağı lens hakkında objektif bir ısıtıcı bu uygulama için iyi çalışır. Bu koşullar altında, mitokondriyal morfolojisi, redoks durumu ve ATP seviyeleri 10-15 dakika boyunca görüntüleme sırasında değişmeden kalır. </li></ol> 3. Görüntüleme Kurulum <ol><li> Bir geniş alan floresan mikroskop görüntüleme mito-roGFP1 için Kurulum Burada adımlar AxioObse uyarlanmışrver.Z1 mikroskop bir Colibri LED uyarma kaynağı, bir geniş alan Orca ER kamera ve Axiovision toplama yazılımı ile donatılmıştır. Mito-roGFP1 okside her iki kanal ve Fotoçevrim photobleaching cıva ark lambası aydınlatma (bkz. aşağıda) ile karşılaştırıldığında LED aydınlatma kullanılarak önemli ölçüde azalır. Sinyal ve çözünürlük en üst düzeye çıkarmak için, amacı mümkün olan en yüksek sayısal diyafram ve yeterli uzaysal çözünürlük sağlayan en düşük büyütme kullanın. Buna ek olarak, mito-roGFP görüntüleme için, objektif 365 nm de iletir doğrulayın. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar objektif (Zeiss) bu uygulama için iyi çalışır. Yükseltgenmiş ve indirgenmiş mito-roGFP1 tür yakalamak için toplama yazılımı yapılandırın. Biz şu şartları kullanılabilir. <ol><li> Dahil excitatio ile, mito-roGFP gibi HE (Zeiss) set filtre 38 olarak 365 nm (% 100 LED güç) ve GFP için uygun bir emisyon filtresi, de uyarma kullanmak okside için kanal yapılandırman filtre küp kaldırıldı. Eksitasyon filtresi çıkarılması böylece ulaşılabilir zaman çözünürlüğü artan, filtreleri geçmek için gerek kalmadan 365 nm ve 470 nm hem de uyarma sağlar. </li><li> Yukarıda da belirtildiği gibi, 470 nm (% 100 LED güç) de uyarma kullanımı ve düşük mito-roGFP için kanal yapılandırma, aynı emisyon filtresi küp okside mito-roGFP için kullanılır. Uzaysal çözünürlüğü optimize etmek için 1x1 binning için kamera ayarlayın. </li><li> Her z pozisyonda kanalları hem toplama, 0.5 mikron aralığı ile 11 dilim oluşan az yığını elde etmek için yazılım ayarlayın. Satın alma Bu mod da her z yığını elde daha yavaş, ama yükseltgenmiş ve indirgenmiş kanal satın arasındaki mitokondriyal hareket kaynaklanan eserler önler. </li><li> Görüntü birkaç hücreleri güçlü değil doyurarak sinyal üreten, uygun bir pozlama süresi belirlemek için. Tüm deney için okside ve mito-roGFP1 azaltılmış için pozlama süreleri oranı korumak için önemlidirs. Örneğin, için pozlama süreleri okside ve mito-roGFP1 mito-roGFP1 okside için maruz kalma süresi, daha sonra sırasıyla, 300 ve 100 milisaniye olan azaltılmış ise 3 kez olması gerektiğini tüm deneyler için mito-roGFP azaltılmış için. </li></ol></li><li> Bir spektral konfokal mikroskop görüntüleme mitGO-ATeam2 için Kurulum MitGO-ATeam2, GFP (emisyon maksimum 510 nm) floresan kullanarak ATP düzeylerini ölçmek için OFP (emisyon maksimum 560 nm) gelen bu ayırt edilmelidir. Bu fluorophores yayılan floresan çözmek floresan filtre setleri vardır. Ancak, konfokal mikroskoplar tarama birçok lazer geçerli bir spektral dedektör,, bu uygulama için en uygun bulmak. Bir spektral dedektör dalga boyuna göre çok bileşen (genellikle 32 veya daha fazla) içine floresan emisyon ayırır. Birkaç komşu dalga boyu bantları bir resim kanal birleştirilebilir. Birleştirilmek üzere dalga boylarında çok deneysel G sinyali en yüksek olarak seçilirKarıştırabileceklerinden sinyalinin çapraz kaçınarak FP ve OFP ölçüm FRET. Mevcut en yüksek sayısal açıklık objektif kullanın. Bir 100x/1.49 veya 60x/1.49 Apo-TIRF objektif kullanın. Biz NIS Elements yazılımı çalıştıran Nikon A1R konfokal mikroskop kullanın. ATP bağlı ve ATP-ilişkisiz mitGO-ATeam2 tür yakalamak için toplama yazılımı yapılandırın. Biz şu şartları kullanılabilir. <ol><li> Sistemimizde yaklaşık 0.42 mikron az çözünürlüğe karşılık 1.0 Airy birimleri (AU), için iğne deliği ayarlayın. </li><li> Görüntüdeki mekansal bilgi en üst düzeye çıkaracak Nyquist örnekleme sınırı, yaklaşım tarama zoom ayarlayın. Sistemimizde piksel boyutu 0.12 mm. </li><li> Mitokondri görüntüleme sırasında hareket edebilir, çünkü 512 x 256 piksel alanı kırpma tarafından görüntüleme hızını artırmak için yararlı olabilir. Sistemimizde görüntü bir kare için gereken toplam süre 2 kat tarama ortalama dahil olmak üzere, 1.0 sn. İstenen uzaysal çözünürlüğü bağlı olarak, alanında daha da increas kırpılmış olabilire zaman çözünürlüğü. </li><li> 488 nm&#39;de Excite ve 500 emisyon toplamak - GFP için 520 nm ve 550 - OFP için 580 nm. Gerçek en iyi değerleri görüntüleme sistemi özellikleri ile değişebilir. </li><li> Sistemimiz için en uygun lazer gücü 6.0 ve% 6.4 arasındadır. En uygun lazer gücü her mikroskop sistemi için değişir, ama yine de bir yorumlanabilir görüntü üretirken ideal mümkün olduğunca düşük olacaktır. Herhangi bir optik sistem zaman içinde normal meydana lazer güç değişiklikleri, izlemek için bir dahili veya harici güç ölçer kullanın. </li><li> Piksel değerlerinin tespit aralığı en üst düzeye çıkarmak ancak mümkün olduğu kadar çok hücreler olarak için, doyurarak sinyal önlemek için dedektör kazanç ve aydınlatma ışık yoğunluğunu ayarlayın. % 1&#39;den fazla doymuş piksel içeren herhangi bir hücre analiz yok. Aynı amaç, lazer gücü, tarama zoom, piksel boyutu, kazanç ve ofset kullanarak görüntü tüm örnekler. </li></ol></li></ol> 4. Resim Alma <ol><li> Odak pla bulun<html> floresan prob beyazlatma en aza indirmek için iletilen ışık kullanarak ilgi hücrelerinin ne. </li><li> Ilgi çekici bir veya daha fazla hücre bulduktan sonra, 0.5 mikron arasında bir adım boyutu ile tipik bir cep (yaklaşık 7 um), bütün derinliği boyunca z-dizi toplamak. </li><li> Resim diğer slayt faiz hücreleri, ancak görüntü 15 dakikadan fazla tek bir slayt yok. Slayt üzerinde 15 dakika sonra, hücre canlılığını kaybeder. </li></ol> 5. Analiz Mitokondrial ATP seviyesinde 510 nm &#39;de olduğu için 560 nm&#39;de mitGO-ATeam2 emisyon oranını ölçerek belirlenir 27 organel redoks durumu Mito-roGFP bölgesinin (T / O) okside oranı düşürülür olarak ölçülür;. Yani 365 nm uyarma üzerine 510 nm emisyon bölünmesiyle 470 nm uyarma üzerine 510 nm emisyon. Oranı hesaplamadan önce, biz arka plan çıkarma ve floresan mitokondri ait piksel için bir eşik değerini belirlemek. çadır &quot;&gt; Kamu malı (örneğin ImageJ 30) veya yazılım mito-roGFP1 veya mitGO-ATeam2 analizi. görüntü elde etmek için kullanılan yazılıma bağlı olarak ve analiz için kullanılabilir (örneğin Volocity, Perkin-Elmer) ticari, görüntüleri İlk analiz yazılımı onları açmadan önce, TIFF gibi, başka bir biçime dönüştürülmesi gerekebilir. görüntüler dönüştürülür, bu piksel değerleri dönüşüm sırasında değiştirilmez doğrulamak için gereklidir. mito-roGFP1 veri analizi kullanarak her iki program aşağıda açıklanmıştır. her menü içinde seçmek için Program menüleri ve seçenekleri koyu ve italik olarak vurgulanır. 5.1 ImageJ analizi <ol><li> Açık görüntüleri ve değişim tipi 32 bit için: Görüntü → tipi → 32 bit. </li><li> Hiçbir hücre vardır bir alanda ilgi (ROI) bir bölge çizin. Bu yatırım getirisi ortalama yoğunluğu hesaplayın: → Tedbir analiz edin. </li><li> Yığından hesaplanan ortalama arka plan çıkarma: Süreç → Matematik → Çıkart. </li><li> Çıkarılır z-yığını kullanarak, mitokondri üzerinde orta dilim ve eşik bulmak: Resim → Ayarla → Eşik ve Eşik penceresinde Uygula&#39;yı tıklatın. Yığın tüm dilimleri için geçerlidir. NaN arka plan pikseller ayarlayın kontrol edin. </li><li> Oranı oluşturma z yığını: Süreç → Görüntü Hesaplama mito-roGFP1 analizi için okside z yığını tarafından azaltılmış yığını bölün. MitGO-ATeam2 analizi için (ATP ilişkisiz) görüntü 510 nm ile 560 nm (ATP bağlı) görüntü bölün. </li><li> Ilgi alanı etrafında bir ROI çizin. → Araçlar → ROI Müdürü analiz seçin ve ROI kaydetmek için Ekle&#39;yi tıklatın. Birden fazla bölge yöneticisi saklanabilir. ROI Yöneticisi, tüm ROI seçin, sonra M seçincevher → Tüm yığın dilimleri ölçmek için Birleştirilmiş. Analiz için bir elektronik tabloya veri verir. </li></ol> 5.2 Volocity analizi <ol><li> Bir Volocity kütüphaneye görüntüleri aktarmak ve 2 kanallı bir görüntü dizisi oluşturun. </li><li> Hiçbir hücre vardır bir alanda ilgi (ROI) bir bölge çizin. Seçin: Araçlar → Oranı. </li><li> ROI itibaren alın: arka hesaplamak için Volocity kullanın. </li><li> Mitokondriyal yapıları içerecek şekilde eşik ayarlayın. </li><li> Oranı kanala bir gökkuşağı LUT uygulamak için seçeneğini işaretleyin. Yoğunluk ayarlı kanal sunum için daha az gürültülü görüntüleri oluşmasına neden olabilir, ama ortalama oranı kantitatif için kullanılmamalıdır. </li><li> Ölçüm sekmesini seçin bu oran kanalı seçin ve ilgi alanı etrafında bir ROI çizin. Sıfır değerleri hariç oranı kanal ölçün. Çoğul bölgeler ve ölçülebiliraynı zamanda. Analiz için bir elektronik tabloya veri verir. </li></ol>

<ol><li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li>
<li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li>
<li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+radical+generation%2C+oxidative+stress%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology & Medicine. 29 (3-4), 222(2000).</li>
<li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+next+%28neurode%29generation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li>
<li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li>
<li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins%3A+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li>
<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide%3A+A+key+role+of+%5Balpha%5D-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li>
<li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li>
<li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li>
<li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li>
<li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide%2Fglutathione+couple%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li>
<li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li>
<li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells%3A+Assessment+of+the+ATP%2FO+values+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li>
<li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li>
<li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+triphosphate%3A+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li>
<li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li>
<li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManfredi%2C+G+%22Methods+in+Cell+Biology%2C+Mitochondria%22">Methods in Cell Biology, Mitochondria</a>. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).</li>
<li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Areas+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li>
<li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li>
<li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li>
<li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li>
<li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li>
<li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP%3AADP+Ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada, maya hücreleri canlı mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeylerini değerlendirmek için biyosensör olarak mito-roGFP1 ve mitGO-ATeam2 kullanımı yöntemleri açıklanmaktadır. Biz nicel mitokondriyal morfolojisi veya dağıtım veya hücresel büyüme oranları üzerinde herhangi bir belirgin etki olmadan, mitokondri için hedef olarak plazmid kaynaklı mito-roGFP1 veya mitGO-ATeam sonuçlarının bu ifade bulabilirsiniz. 3 Mito-roGFP1 yüksek gelen mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri algılayabilir son derece dü...

Mitokondri amino asitler, yağlı asitler, heme, demir sülfür, kümeleri ve pirimidinlerin ATP üretimi, biyosentezi için gerekli organellerdir. Mitokondri de kalsiyum dengesinin önemli rol oynarlar ve apoptoz düzenlenmesinde. Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı, Amyotrofik lateral skleroz ve Huntington hastalığı gibi yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıklara mitokondri Artan 1 kanıt bağlantılar. 2 kişi ile bütün hayatlarını yaşarken nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili protein, mitokondriyal mutasyonlar, hastalık semptomları ileri yaşlarda ortaya çıkar. Bu değişiklikler ortaya hastalık patolojisi izin yaşla birlikte mitokondri meydana gösterir. Gerçekten de, mitokondriyal spor genel hücre sağlığı ve ömrü maya ve memeli hücreleri ile ilişkilidir. Burada 3,4, biz mitoc iki kritik özellikleri değerlendirmek için genetik olarak kodlanmış, rasyometrik floresan biyosensörler nasıl kullanılacağı açıklanmaktadırmaya hücreleri canlı hondria: redoks devlet ve ATP seviyeleri. Aerobik enerji seferberlik içinde mitokondriyal fonksiyonu iyi bilinmektedir. Mitokondriyal redoks devlet NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutatyon / glutatyon disülfit (GSH / GSSG) ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) dahil olmak üzere, organel türlerin azaltılması ve oksitleyici bir ürünüdür. Mitokondri veya hipoksi ayrılması mitokondriyal solunum faaliyeti etkiler ve NAD oranı + organelde NADH için değiştirir. Iç mitokondriyal zarın bir elektron nakil zincirinin kompleksleri, hem de aminlerin deaminasyon gelen dış mitokondriyal membranın monoamin oksidaz ile 5, hasar lipidler, proteinler ve nükleik asitler arasındaki yetersiz elektron transferinden imal edilmiştir ve ROS 6,7,8 yaşlanma ve yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. ROS, aynı zamanda m sinyal transdüksiyonu bir rol oynayabiliritochondria, GSH oksidasyonu ile. Örneğin, NADH dehidrogenaz ROS üretimine katkıda değil, aynı zamanda glutatyon havuzu 9,10 ile etkileşim yoluyla düzenlenir. α-Ketoglutarat dehidrogenaz ve asonitaz, TCA döngüsü bileşenleri, ortamlar 11,12 oksitleyici azalmış aktivite gösterirler. Gerçekten de, asonitaz faaliyet redoks bağımlı düzenleme bakterilerden memelilere 13,14 için korunur. Böylece, redoks devlet ve mitokondri ATP seviyeleri izleme hastalığı patoloji kendi işlevini ve rolünü anlamak için çok önemlidir. Biyokimyasal yöntemler redoks devlet veya tüm hücrelerin ATP düzeylerini değerlendirmek için kullanılan ya da mitokondri izole edilmiştir. Bütün hücrelerde ya da redoks durumunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan yöntemler mitokondri izole redoks çifti GSH / GSSG 15 seviyelerinin ölçülmesi dayanmaktadır. Lusiferin-lusiferaz sistemi yaygın mitokondriyal ölçmek için kullanılırMitokondri permeabilize bütün hücreler veya izole edilmiş ya da ATP seviyeleri. 16,17,18,19,20 Bu deneyde, lusiferaz orantılıdır ATP ye bağlanan ve oksitlenmesi ve luciferase ikinci kemilüminesans katalize eder. 21 yayılan ışık şiddeti Reaksiyon karışımı, ATP. 22 Bu yöntemler, örneğin Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar, anormal derecede düşük olan hastalarda ATP seviyeleri bulgu da dahil olmak üzere, mitokondriyal fonksiyonu, ilgili temel bilgiler ortaya konmuştur. 23 Bununla birlikte, görüntü canlı, sağlam hücreler için kullanılamaz. Ayrıca, tüm-hücre analizine dayalı yöntemler redoks durumu ya da hücrenin tüm bölümlerinde ATP seviyelerinin bir ortalaması sağlar. Mitokondriyal redoks devlet veya ATP seviyeleri hücre içi fraksiyon sırasında değişebilir çünkü izole organeller ölçümler potansiyel sorunlu. Son olarak, laboratuar ve diğerlerinden son çalışmalar gösteriyor kitek tek hücreler içinde mitokondri da anne ve yavru hücrelerin ömrünü etkiler, fonksiyon heterojendir. 3 Bu nedenle, hücre içi çözünürlüğe sahip canlı hücrelerde mitokondriyal ATP seviyeleri ve redoks ölçmek için bir ihtiyaç vardır. Her iki GFP dayalı mitokondriyal fonksiyon için biyosensör Burada anlatılan. Redoks-duyarlı GFP (roGFP) 24,25 yüzeye maruz kalan sisteinler molekülüne ilave edildiği bir GFP çeşididir. roGFP, yabani tip GFP gibi, iki uyarma tepeler (~ 400 nm ve 480 nm &#39;de ~) ve ~ 510 nm&#39;de emisyon tepe vardır. ~ 400 nm&#39;de eksitasyon artışa roGFP sonuçlarında sistein kalıntıları oksidasyonu. Bu sistein azaltılması ~ 480 nm uyarma yanadır. Böylece, 480 nm ve 400 nm dalga boyunda roGFP uyarma üzerine 510 nm emisyon oranı fluorofor en ortamının redoks durumunu yansıtan azalır ve okside roGFP, göreli miktarını ortaya koymaktadır. İki versroGFP iyonları yaygın olarak kullanılır: roGFP1 ve roGFP2. Her ikisi de aynı sistein eklemeleri içerir. roGFP1 yabani tip GFP esas alınmaktadır ve roGFP2 wtGFP 24 göre 400 nm ile 480 nm ve daha az etkili bir uyarma daha verimli bir uyarım var S65T GFP esas alınmaktadır. roGFP1 roGFP2 ve dinamik aralığı düşük bir kapsama alanı içine daha fazla genişletir daha duyarlı daha az pH olduğunu. Böylece, roGFP1 daha azaltılması gibi mitokondri gibi bölmeleri veya sitoplazmada ve bu endozomlar gibi değişken pH, ile bölmeleri izlenmesi için daha yararlı olabilir. roGFP2 parlak sinyal ve, bazı çalışmalarda, roGFP1 24,26 daha büyük bir dinamik aralık sunuyor. Arabidopsis thaliana çalışmalar redoks değişikliklere yanıt için gereken zaman her iki sensörden (t ½ oksidasyonu için, 65 ve 95 sn ve t ½, sırasıyla roGFP1 ve roGFP2 için azaltılması, 272 ve 206 saniye,) için benzer olduğunu gösterir. 26 MitGO-ATeam2 minimal invaziv, güvenilirtomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae mitokondriyal ATP ölçer sensör. GO-ATeam donör ve alıcı floresan proteinleri (GFP ve turuncu (OFP) protein floresan, sırasıyla) FRET F o arasında sıkışmış F 1-ATP sentaz ε alt birimi oluşan bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) prob. 27 getirmek proteinin konformasyonel değişiklikler ε altbirim sonuçlarına ATP bağlama alıcı yakın FRET donör ve alıcı vericiden enerji transferini sağlar. GO-ATeam, GO-ATeam1 ve GO-ATeam2 iki türevleri vardır. GO-ATeam2 genellikle daha düşük mitokondride sitoplazmada karşılaştırılmıştır [ATP]. 27 ölçüm için daha uygun hale GO-ATeam1 daha MgATP için daha yüksek bir afiniteye sahiptir Mitokondriyal redoks araştırmak için, bir lider dizisi ATP9 kaynaşmış roGFP1 oluşan bir füzyon proteini (mito-roGFP1) inşand güçlü gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (gpd) promoteri (p416GPD, Addgene) kontrolü altında, bir sentromer plazmid bazlı (düşük kopya sayısı) maya ekspresyon eksprese. Bu model mantar, Saccharomyces cerevisiae yaşlanma bağlamında mitokondri redoks statüsü araştırmak için kullanılan roGFP1. Biz roGFP1 yaşlanma sırasında ve besin durumu tepki olarak ortaya ama maya hücreleri üzerinde belirgin bir olumsuz etki yapar mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri algılamak bulabilirsiniz. Biz de tek tek canlı maya hücrelerinin içinde mitokondri redoks durumu değişkenlik, hücre içi mekansal çözünürlükte bir biyosensör önemini vurguluyor bir bulgu bakın. MitGO-ATeam2 GO-ATeam2 en amino ucunda takılı sitokrom c oksidaz alt ünite VIIIA en mitokondriyal sinyal dizisi vardır GO-ATeam2, bir çeşididir. 27 Biz mitGO-ATeam2 prob (lütfen H. laboratuvar tarafından sağlanan modifiye Noji, Enstitüsü of Bilimsel ve düşük kopya plazmid olan maya ifade vektörü pAG415GPD-ccdb (Addgene, Cambridge, MA, USA) içine Xba1 ve HindIII bölgeleri yoluyla alt klonlama ile Mayada kullanım için endüstriyel araştırma, Osaka Üniversitesi, Japonya), güçlü kurucu GPD organizatörü içeren. Biz tomurcuklanan maya mitGO-ATeam2 ifade ve mitokondriyal ATP düzeylerinde fizyolojik değişiklikleri ölçmek için etkili bir prob olarak hizmet vermektedir bu mitokondri için sadece lokalize DNA bağlayıcı boya DAPI,, ile counterstaining tarafından, bulabilirsiniz. roGFP ve GO-ATeam genetik olarak kodlanmış her ikisi de. Sonuç olarak, ortaya ve sabit bir şekilde tutulmuş sağlam hücreler ve redoks durumu ya da tek tek, canlı hücrelerdeki ATP seviyeleri hakkında bilgi alınabilir. Ayrıca, her iki biyosensör fizyolojik koşullar altında redoks devlet veya meydana ATP seviyelerinde değişiklikleri izlemek. 28 Her iki prob da rasyometrik bulunmaktadır. Bunun sonucu olarak, bu sonda ile yapılan ölçümler Cha etkilenmezbiyosensör konsantrasyon veya numune aydınlatma veya kalınlığında nges. Son olarak, her iki biyosensör hücre içi uzaysal çözünürlüğü sağlar. Gerçekten de, roGFP mitokondri, ER için hedeflenmiştir, endozomlar ve 24 peroksizomlar, ve pH büyük ölçüde bağımsız Bu parçaların her birinin redoks durumu değişiklikleri, algılayabilir.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td> <td>1397-94-0</td><td>Etanol içinde 2 mg / ml'lik bir stok çözeltisine çözülür.</td></tr><tr><td>SGlyc (sentetik gliserol bazlı) maya büyüme ortamı * SGlyc-Ura için atlayın ** SGlyc-Leu</td><td></td><td></td> için atlayın <td>H 2 O'da çözün NaHCO3 ile pH'ı 5.5'e ayarlayın. Otoklav. İçindekiler: 0.67% Amino asitsiz maya azot bazı %3 Gliserol %0.05 Glikoz 2 mg/ml adenin 2 mg/ml urasil* 1 mg/ml L-arginin 1 mg/ml L-histidin 1 mg/ml L-lösin** 3 mg/ml L-lizin 2 mg/ml L-metiyonin 4 mg/ml L-fenilalanin 2 mg/ml L-triptofan 3 mg/ml L-tirozin</td></tr><tr><td>SC (sentetik tam, glikoz bazlı) maya büyüme ortamı *SGlyc-Ura için atlayın **SGlyc-Leu'yu</td><td></td><td></td><td>atlayın H2O'da çözün. NaHCO3 ile pH'ı 5.5'e ayarlayın. Otoklav. İçindekiler: %0.67 Amino asitsiz maya azot bazı %3 Glikoz 2 mg/ml adenin 2 mg/ml urasil* 1 mg/ml L-arginin 1 mg/ml L-histidin 1 mg/ml L-lösin** 3 mg/ml L-lizin 2 mg/ml L-metiyonin 4 mg / ml L-fenilalanin 2 mg / ml L-triptofan 3 mg / ml L-tirozin</td></tr><tr><td>Valap</td><td></td><td></td><td>Malzemeleri 1: 1: 1 (w: w: w) oranında birleştirin. 70 dereceye daldırarak eritin; C H 2 O banyosu. Aliquot cam petri kaplarına. Oda sıcaklığında saklayın. İçindekiler: Vazelin vazelin, sert parafin, lanolin</td></tr> <tr><td>ve nbsp;</td><td></td><td></td><td>< güçlü > Ekipman ve Yazılım< / güçlü ></td></tr> Önceden <tr><td>Temizlenmiş Altın Mühür Rite-on Mikro Slaytlar</td><td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td><td>3050</td><td>Boyut: 25 x 75 mm; Kalınlık: 0,93 ila 1,05 mm</td></tr><tr><td>Yüksek performanslı lameller, No. 1,5, 18x18 mm</td><td>Zeiss (Thornwood, NY)</td><td>474030-9000-000</td><td>Bunların kalınlığı daha az değişkendir (170&plusmn; 5 &mu; m) standart lamellere göre, küresel sapmayı azaltır ve 3D görüntüleme performansını iyileştirir</td></tr><tr><td>Fisherbrand Mikroskop Kapak Camı, No. 1.5</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td><td>12-545E</td><td>Boyut: 22 x 22 mm, No. 1.5 kalınlık (170 & mu; m)</td></tr> <tr><td>Spektral dedektörlü A1 lazer taramalı konfokal mikroskop ve 100x/1.49 NA Apo-TIRF objektif</td><td>Nikon (Melville, NY)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objektif (Zeiss) ve Orca ER soğutmalı CCD kamera (Hamamatsu) ile donatılmış ve Axiovision yazılımı Zeiss (Thornwood, NY) tarafından kontrol edilen AxioObserver.Z1 mikroskobu</td><td>; Hamamatsu (Hamamatsu Şehri, Japonya)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Volocity 3D Görüntü Analiz yazılımı</td><td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td><td></td><td>Dekonvolüsyon için restorasyon modülü; Oran hesaplama ve ölçüm için kantitasyon modülü</td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri (Bethesda, MD)</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td></tr></tbody></table>

yaşam maya hücreleri mitokondriyal redoks devlet ve atp ölçün oranlı metrik biyosensörler

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Mitokondri enerji metabolizması ve hücre ömrü ve programlanmış hücre ölümü kontrol etmek için kalsiyum homeostazı, birçok hücresel süreçlerde rol oynarlar. Bu süreçler etkiler ve redoks durumu ve mitokondri tarafından ATP üretimi etkilenir. Burada, maya hücreleri canlı hücre içi çözünürlükte mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeyini algılar iki rasyometrik, genetik olarak kodlanmış biyosensör kullanımını tarif. Mitokondriyal redoks devlet mitokondrial matriks hedeflenmektedir redoks duyarlı Yeşil floresan proteini (roGFP) kullanılarak ölçülür. Mito-roGFP da protein uyarma spektrumu değiştirebilir geri ve çevre-bağımlı oksidasyon ve redüksiyon, tabi pozisyonlar 147 ve GFP 204, de sistein içerir. MitGO-ATeam F o ε altbirim F 1-ATP sentetaz arasına sıkıştırılmış olduğu bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) probu, donör ve alıcı Fluo FRETrescent proteinler. Getirmek protein konformasyonunun olarak ε altbirim sonuçlarına ATP bağlama yakın verici ve alıcı ve verici FRET gelen alıcı için floresans rezonans enerji transferi için izin verir.

Mito-roGFP ile mitokondriyal redoks devlet Ölçme Burada, mito-roGFP1 maya hücre büyümesi veya mitokondriyal morfolojisi etkilemeden, maya hücreleri canlı azalmış tamamen okside gelen mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri algılamak için dinamik menzile sahip olduğunu göstermektedir. İlk olarak, mitokondri hedefli GFP ve roGFP1 ifade hücreleri normal tarifeler (Şekil 1A) büyümesi bulabilirsiniz. Olarak log-faz büyüme ve maksimum büyüme oranı ulaşmak için zaman içinde büyüme ...

Biz canlı maya hücrelerinde hücre içi çözünürlükte mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeylerini izlemek için, GFP temel alan iki rasyometrik, genetik olarak kodlanmış biyosensör, kullanımı açıklanmaktadır.

Yaşam Maya Hücreleri Mitokondriyal Redoks Devlet ve ATP ölçün oranlı metrik Biyosensörler

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Bu prosedürün genel amacı, iki yeşil floresan proteini veya GFP varyantı kullanarak canlı maya hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu ölçmektir. Redoks algılamalı GFP, protein indirgenmiş sıranın uyarma spektrumunu değiştiren geri dönüşümlü ve çevreye bağlı oksidasyon ve indirgenmeye uğrayan yüzeye maruz kalan sistinler içerir. GFP, 470 nanometrede maksimum uyarılma özelliğine sahipken, oksitlenmiş sıra GFP, 365 nanometrede artan bir uyarma eksikliğine sahiptir.Redoc durumu, 365 nanometre uyarmada RO GFP emisyonu üzerinden 470 nanometre uyarımda RO GFP emisyonu olarak ölçülür A ekibi, F sıfır F1 A TP sentazın epsilon alt biriminin, bir perde donörü GFP ile bir perde alıcısı turuncu floresan proteini arasına sıkıştırıldığı veya bir TP'nin epsilon Alt Birimine OFP bağlanması ile sonuçlanan bir perde probudur. fret donörü ve alıcısı birbirine yakın olup, donörden alıcıya enerji transferine izin verir. A TP seviyeleri daha sonra 488 nanometrede uyarılma üzerine OFP emisyonu ve 488 nanometrede uyarılma üzerine GFP emisyonu olarak ölçülür. Fizyolojik koşullar altında meydana gelen redoks durumu veya TP seviyelerindeki değişiklikleri izleyen sonuçlar elde edilir.Bu yöntemlerin mevcut yönte

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Vakuolar ve sitozolik pH canlı maya ölçülebilir...

Vakuolar ve sitosolik pH Ölçümü<em&gt; In Vivo</em&gt; Maya hücre süspansiyonlarında

Hidrojen peroksit (H2O2) hem oksidatif hasar kaynağı hem de bir sinyal molekülüdür. Bu protokol, canlı mayada genetik olarak kodlanmış bir oransal biyosensör olan mitokondri hedefli HyPer7 (mtHyPer7) kullanılarak mitokondriyalH2O2'ninnasıl ölçüleceğini açıklar. Ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımı kullanarak görüntüleme koşullarının nasıl optimize edileceğini ve kantitatif hücresel ve hücre altı analizin nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılarıyla açıklar.

Mitokondriyal Peroksit için Oransal Bir Biyosensör olan mtHyPer7'nin Canlı Maya Hücrelerinde Görüntülenmesi

Maya bütün hücrelerinde mitokondriyal solunum, hücre biyoenerjiğinin değerli bir göstergesidir. Burada, farklı maya türleri için geçerli olan bu fenotipi ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Maya Bütün Hücrelerinde Mitokondriyal Solunum Miktar Tayini

Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) kullanarak mitokondriyal sağlığı izlemek için invaziv olmayan, gerçek zamanlı bir yöntem sunuyoruz. Mitokondriyal redoks durumlarını nicelendirmek için RRS kullandık ve mitokondriyal sağlık için bir metrik geliştirdik; Rezonans Raman azaltılmış mitokondriyal oranı (3RMR), bu ölçüm oksijenlenme değişikliklerine geleneksel kan gazı analitlerinden daha hızlı yanıt verdiğini gösteriyor.

Rezonans Raman Spektroskopisi Kullanarak Mitokondriyal Fonksiyonun Gerçek Zamanlı, İnvaziv Olmayan Değerlendirmesi

"E-DNA" sensörleri, reagentless, kan ve diğer karmaşık matrisler doğrudan meydan bile iyi bir performans elektrokimyasal biyosensörler, nükleik asit, protein ve küçük molekül analitler geniş bir algılama için adapte edilmiştir. Burada bu tür sensörlerin üretimi ve kullanımı için genel bir prosedür mevcut.

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) görüntü ortamı ve spesifik proteinlerin ve canlı hücreler boyaların etkileşimi önemli bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan moleküler rotor flim canlı hücreler viskozitenin haritalama sağlar.

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Işık tarafından küçük GTPaz aktivitesinin yerleşim-zaman kontrolü için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, rapamisin indüklenen FKBP-FRB heterodimerization ve foto-kafes sistemleri dayanmaktadır. Işık ışınlama Optimizasyonu Subselüler düzeyindeki küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon sağlar.

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Bu makale ayrıntıları Multiplex microneedle tabanlı sensör yapımı. Aygıt bir hızlı ve seçici bir şekilde birden fazla analitlerin in situ numune alma ve elektrokimyasal analizi için geliştirilmektedir. Biz klinik tıp tasavvur ve biyomedikal araştırmalar, bu microneedle tabanlı sensörler için kullanır.

Multiplexed Transdermal Elektrokimyasal Algılama Hollow microneedle tabanlı Sensör

İn vitro hücre kültürlerinin elektriksel aktivitesinin görünür ışıkla uyarılması için organik yarı iletken polimerlerin kullanımına dayalı bir yöntem tarif edilmiştir.

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Öğrenin, yaşam maya hücrelerinde mitokondriyal redoks durumu ve ATP seviyelerini orantılı GFP biyosensörleriyle ölçme yöntemini. Bu teknik, hücresel metabolizma ve mitokondriyal sağlık araştırmalarında gerçek zamanlı analiz sağlar.

Yaşam Maya Hücreleri Mitokondriyal Redoks Devlet ve ATP ölçün oranlı metrik Biyosensörler

Daha fazla video keşfet