Yaşam Maya Hücreleri Mitokondriyal Redoks Devlet ve ATP ölçün oranlı metrik Biyosensörler

Biz canlı maya hücrelerinde hücre içi çözünürlükte mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeylerini izlemek için, GFP temel alan iki rasyometrik, genetik olarak kodlanmış biyosensör, kullanımı açıklanmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, iki yeşil floresan proteini veya GFP varyantı kullanarak canlı maya hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu ölçmektir. Redoks algılamalı GFP, protein indirgenmiş sıranın uyarma spektrumunu değiştiren geri dönüşümlü ve çevreye bağlı oksidasyon ve indirgenmeye uğrayan yüzeye maruz kalan sistinler içerir. GFP, 470 nanometrede maksimum uyarılma özelliğine sahipken, oksitlenmiş sıra GFP, 365 nanometrede artan bir uyarma eksikliğine sahiptir.

Redoc durumu, 365 nanometre uyarmada RO GFP emisyonu üzerinden 470 nanometre uyarımda RO GFP emisyonu olarak ölçülür A ekibi, F sıfır F1 A TP sentazın epsilon alt biriminin, bir perde donörü GFP ile bir perde alıcısı turuncu floresan proteini arasına sıkıştırıldığı veya bir TP'nin epsilon Alt Birimine OFP bağlanması ile sonuçlanan bir perde probudur. fret donörü ve alıcısı birbirine yakın olup, donörden alıcıya enerji transferine izin verir. A TP seviyeleri daha sonra 488 nanometrede uyarılma üzerine OFP emisyonu ve 488 nanometrede uyarılma üzerine GFP emisyonu olarak ölçülür. Fizyolojik koşullar altında meydana gelen redoks durumu veya TP seviyelerindeki değişiklikleri izleyen sonuçlar elde edilir.

Bu yöntemlerin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yol GFP ve gitme olmasıdır. Bir ekip genetik olarak kodlanmıştır ve canlı hücrelerde tanıtılabilir ve stabil bir şekilde korunabilir. Sonuç olarak, hücrelerin veya organellerin uygunluğunu etkilemeden canlı hücrelerde mitokondriyal redoks durumunu ve bir TP'yi ölçmek için kullanılabilirler.

Her iki prob da fizyolojik koşullar altında redoks durumundaki veya TP seviyelerindeki değişiklikleri izler. Sonuç olarak her iki prob da oran metriğidir. Bu problarla yapılan ölçümler, biyosensör konsantrasyonundaki veya numune aydınlatmasındaki veya kalınlığındaki değişikliklerden etkilenmez.

Her iki biyosensör de tek tek organeller düzeyinde çözünürlük sağlar. Aslında, RO GFP varyantları, pH'dan büyük ölçüde bağımsız olarak redoks durumundaki değişiklikleri tespit ettikleri mitokondri, er, endozomlar ve peroksizomları hedef almıştır. Bu yöntemler, mitokondriyal kalite kontrolü ve mitokondrinin yaşla birlikte nasıl değiştiği ile ilgili alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Görüntü analizi sırasında eşikleme ve oran adımlarının zor olması ve bu prosedüre başlamak için tutarlı tanımlanmış yönergeler kullanılarak gerçekleştirilmesi gerektiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi yararlıdır. Metin protokolünde açıklandığı gibi biyosensörlerle mayanın dönüşümünü gerçekleştirin. 15 mililitrelik konik tabanlı bir tüpte beş mililitre seçici tam bırakma ortamında hücreleri orta log fazına kadar büyütün.

Tüm deneyler için aynı medya grubunu kullanın. Bir mililitre kültürü 20 mikrolitreye konsantre ettikten sonra, yeniden süspanse edilmiş hücrelerin iki mikrolitresini bir slayta uygulayın ve hücreleri bir kapak fişi ile örtün. Daha sonra metal bir spatula üzerinde az miktarda VAP'ı eritin ve sızdırmaz hale getirmek için kapak kayma kenarları boyunca yayın.

Alternatif olarak, geniş alanlı floresan mikroskobunda mito RO GFP bir görüntüleme için şeffaf oje kullanılabilir. 100 x 1,3 NA EEC planı gibi ışığı 365 nanometrede ileten mümkün olan en yüksek sayısal açıklığa sahip bir objektif kullanın. Neo Fluor objektif lens.

Oksitlenmiş ve indirgenmiş gönye sırası GFP'yi tespit etmek için mikroskobu sırasıyla 365 ve 470 nanometrede uyaracak şekilde yapılandırın. Uyarma dalga boyunu değiştirmek için LED'leri ve GFP'ye uygun bir emisyon filtre küpünü kullanın. Uyarma filtresi çıkarıldığında, optimum uzamsal çözünürlük için kamerayı tek tek benning'e ayarlayın.

Ardından, yazılımı, her iki kanalı da her Z konumunda toplayarak, 0,5 mikrometre aralıklı 11 dilimden oluşan bir Zack elde edecek şekilde ayarlayın. Floresan probun ağartılmasını en aza indirmek için iletilen ışığı kullanarak hücrelerin odak düzlemini bulun. Ardından, görüntüleme için ayarlamak üzere 0,5 mikrometrelik bir adım boyutu kullanarak tipik bir hücrenin tüm derinliği boyunca bir Z serisi toplayın.

Spektral konfokal mikroskopta iki takım olabilir. Burada bulunan en yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip lensi kullanın. 100 x 1.49 APO çim lensi kullanılmıştır.

Mikroskobu, 488 nanometrede iki takım olan migo'yu uyaracak ve TP'ye bağlı bir 500 ila 520 nanometre ve 550 ila 580 nanometre arasında emisyon toplayacak şekilde yapılandırın. Bir TP için ilişkisiz formlar. Gerçek optimum değerler, görüntüleme sisteminin özelliklerine göre değişebilir.

İğne deliğini 1.0 alan birimine ayarlayın, ardından ayarlayın. Nyquist örnekleme sınırına yaklaşmak için yakınlaştırmayı tarayın. Görüntüleme hızını artırmak için alanı 512 x 256 piksel olarak kırpın.

Gürültüyü azaltmak için gerekirse tarama ortalamasını kullanın. Yorumlanabilir bir görüntü üretmeye devam ederken mümkün olduğunca az lazer gücü kullanın. Herhangi bir optik sistemde zaman içinde normal olarak meydana gelen lazer gücündeki değişiklikleri izlemek için dahili veya harici bir güç ölçer kullanın.

Dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için dedektör kazancını ve aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. Ancak doygunluktan kaçının. %1'den fazla doymuş piksel içeren hücreleri analiz etmeyin.

0,5 mikrometrelik bir adım boyutu kullanarak tipik bir hücrenin tutma derinliği boyunca bir Z serisi toplamadan önce iletilen ışığı kullanarak hücrelerin odak düzlemini bulun, tüm örnekleri aynı objektif lazer gücü taraması, yakınlaştırma, piksel boyutu, kazanç ve ofset kullanarak görüntüleyin. Alınan görüntüleri açın ve arka planı belirlemek için türü 32 bit olarak değiştirin. Hücre olmayan bir alanda bir ilgi alanı veya ROI çizin.

Bu ROI'deki ortalama yoğunluğu sonuçlar penceresine eklemek için seçin, analiz edin, ölçün. Bu değeri yığından çıkarmak için işlem matematiğini seçin ve çıkarın. Ardından arka plan ortalama yoğunluğunu girin ve önizlemeyi seçin.

Tamam ve evet, Eşikleme prosedürün en zor yönüdür. Başarıyı garantilemek için, elde edilen görüntü, orijinal görüntüdeki floresan nesnenin gerçek boyutunu koruyacak şekilde eşikleme parametrelerini tanımlayın. Her deney için tam olarak aynı pozlama koşullarının kullanılması, görüntü işleme boyunca tutarlı eşikleme üretilmesine yardımcı olacaktır.

Çok düşük bir eşik, arka plan piksellerini içerecektir. Çok yüksek bir eşik, çıkarılan Zack'i kullanarak mitokondrinin bazı kısımlarını analizden çıkaracak, orta dilimi bulacak ve görüntü ayarını ve eşiği seçecek ve ardından uygun bir eşik değeri bulduktan sonra mitokondriyi eşikleyecektir. Bu eşiği yığındaki tüm dilimlere uygulamak için uygula'yı tıklatın.

Ardından arka plan piksellerini NAN olarak ayarla veya bir sayı değil seçeneğini işaretleyin ve tamam'ı tıklayın ve evet, bu işlemi diğer görüntü için tekrarlayın. İşleme ve ardından görüntü hesaplayıcıya tıklayarak Z oranı yığınını oluşturun. MIT O-R-G-F-P bir analiz için indirgenmiş yığını oksitlenmiş C yığınına bölün.

Aynı protokol migo AAM iki analizi için de kullanılır. Bu durumda, A TP'ye bağlı 560 nanometre görüntüsünü A TP'ye bağlı olmayan 510 nanometre görüntüye bölün. İlgi alanı etrafında bir yatırım getirisi çizin.

Analiz araçlarını seçin. ROI yöneticisi ve ROI'yi kaydetmek için ekle'yi tıklayın, ardından daha fazla çoklu ölçüm seçin ve tamam. Son olarak, dilim numarası alanını kopyalayın ve verileri analiz için bir elektronik tabloya aktarın ve verileri bir elektronik tabloya aktarın, alan çarpılarını, ağırlıklı toplamı ve mitokondriyi hedeflenen GFP'yi ve satır GFP'yi ifade eden ağırlıklı ortalama hücrelerin ortalamasını hesaplamak için elektronik tabloyu kullanın.

Maksimum büyüme hızı, mito GFP ve MIT row GFP bir eksprese eden hücrelerde benzerdir. Ayrıca, MIT RO GF P birini eksprese eden mitokondri ve maya, ana tomurcuk ekseni boyunca hizalanan boru şeklindedir ve anne ve kız hücrelerinin uçlarında birikir. Bu normal morfoloji, MIT RO GF P'nin mitokondriyal fonksiyonu bozmadığını gösterir.

Mitz'in dinamik aralığını değerlendirmek için, FP bir orta kilit fazı, yabani tip maya hücreleri hidrojen peroksit ve dihi üç etol ile muamele edildi ve oksitlenmiş orana indirgenmiş ortalama mitokondriyal, hidrojen peroksit veya DTT ile mitokondriyal redoks durumu titrasyonunu değerlendirmek için ölçüldü, sıfırdan 10 milimolar ile sonuçlanır, doza bağlı bir değişiklikle sonuçlanır. Ortalama mitokondriyal, oksitleyici koşullar altında 0.6'dan indirgeyici koşullar altında 1.23'e kadar ölçülen bir aralıkla oksitlenmiş orana indirgenmiştir. Bu nedenle, mitg FP one, canlı hücrelerde mitokondriyal yeniden tarihlendirme analizi için etkili bir biyosensördür.

Mito RO GFP one ayrıca mitokondriyal redoks durumunun hücre altı çözünürlüğünü sunar. Bu hücre altı çözünürlük, tek tek maya hücreleri içindeki mitokondrinin nispi redoks durumunda farklılık gösterdiğini ortaya koymaktadır: ışık, yüksek yoğunluklu 400 nanometre ışığa maruz kaldığında GFP Chromo dörtte değişikliklere neden olabilir, GFP, düşük yoğunluklu uyarma kullanılarak farklı bir emisyon spektrumuna sahip bir türe foto dönüşüme uğrar. Analiz edilen dönemde önemli bir fotoğraf dönüşümü yoktur.

Foto dönüşümü azaltmanın tercih edilen yolu, 365 nanometrede oksitlenmiş satır GFP formunu uyarmaktır, MIGO AAM iki, mayada DAPI lekeli mitokondriyal DNA ile birlikte lokalize olur ve yabani tip maya mitokondrilerine özgü boru şeklindeki yapılarda bulunur. Ek olarak, MIGO AAM iki eksprese eden hücrelerin büyüme hızı, hem glikoz hem de gliserol ortamında mitokondri hedefli GFP'yi eksprese eden hücrelerinkine benzer. Bu nedenle, migo A iki'nin ekspresyonu, migo A iki'nin mitokondriyal A TP seviyelerindeki değişikliklere yanıt verip vermediğini test etmek için hücreye veya mitokondriye zararlı görünmemektedir, hücreler mitokondriyal A TP üretimini inhibe eden bir ajan olan antimisin A ile tedavi edilmiştir.

Antimisin ile tedavi edilen hücrelerde medyan fret oranı azalır. İlginç bir şekilde, ön veriler, aynı hücre içindeki farklı mitokondrilerde TP seviyelerinde farklılıklar olabileceğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir.

Ayrıca, bu prosedürü denerken, hücreleri mitokondriyal parçalanma ve diğer fototoksisite belirtileri açısından izlerken görüntüleme parametrelerini sabit tutmak önemlidir. Foto ağartmadan kaçının ve eşikleme için tutarlı kriterler geliştirin. Bu biyosensörler, canlı bitki mantarları ve memeli hücrelerindeki mitokondriyal değişiklikleri izlemek için kullanılabilir.

Ayrıca nörodejenerasyon, metabolik hastalık ve mitokondriyal fonksiyonlardaki kusurlarla ilişkili diğer hastalıklardaki mitokondriyal değişiklikleri izlemek için de kullanılabilirler. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerde mitokondriyal redoks durumunu ve bir TP'yi izlemek için mitokondri hedefli oran metrik floresan boyaları kullanabilmeniz gerekir.