Ileri Genetik Yaklaşımlar Chlamydia trachomatis

Bu prosedürün genel amacı, kimyasal mutajenez gerçekleştirerek ve genotip fenotip ilişkilerini belirleyerek klamidya tritus üzerinde genetik analiz yapmaktır. Bu, ilk olarak kimyasal mutajenez kullanılarak klamidya tracom mutant suşlarının üretilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, kimyasal olarak üretilen tüm mutasyonlar, tüm genom dizilimi ile tanımlanır ve ardından referans güdümlü genom montajı yapılır.

Daha sonra mutant suşlardaki fenotip genotip ilişkileri tanımlanır. Son olarak, fenotip genotip ilişkileri, rekombinant suşlar oluşturularak ve bunlar analiz edilerek doğrulanır. Sonuç olarak, belirli bir klamidya genindeki bir mutasyonun, klasik kimyasal mutajenez yaklaşımları ve yeni nesil Singh'in bir kombinasyonu yoluyla bir fenotipe yol açtığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Şu anda klamidyada gen replasmanı için herhangi bir yöntem mevcut değildir ve çalışması için moleküler genetik araçlar emekleme aşamasındadır. Bu yöntem, rekombinant DNA ile transformasyon veya moleküler genetik araçların geliştirilmesini gerektirmez, ancak aynı amaca ulaşır. Bu, tek tek gen ürünlerine bir işlev atamasıdır.

Kültürlenmiş hücreleri hazırlamak için, 25 santimetre başına altı vir hücrenin 10'unu yaklaşık bir kez oturtun, %10 FBS ile desteklenmiş üç mililitre DMEM'e koyun, %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler yaklaşık 24 saat sonra kaynaşmaya ulaştığında, ortamı aspire edin ve hücreleri beşte bir enfeksiyon çokluğunda klamidya ile enfekte edin. Kimyasal bir başlık altında enfeksiyondan 18 saat sonra mutajeneze başlamak için mililitre başına 200 nanogram sikloheksimid içeren toplam üç mililitre D-M-E-M-F-B-S hacminde, mililitre başına 20 miligram etil metan sülfonat veya EMS hazırlayın kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile PBS'de.

EMS güçlü bir mutajen ve kanserojendir. Bu nedenle, bertarafı için metin protokolüne bakın. Ortamı Vero hücrelerinden aspire edin ve bir kez magnezyum klorür ve kalsiyum klorür içeren üç mililitre PBS ile yıkayın.

Daha sonra üç mililitre EMS çözeltisinde ve çeker ocakta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, EMS'yi çıkarın ve kalan EMS'yi çıkarmak için hücreleri üç kez yıkamadan önce mutajeni etkisiz hale getirmek için bir molar sodyum hidroksit kabına koyun. Daha sonra altı mililitre DMEM'de, mililitre başına 200 nanogram siklo heide ve mililitre başına 25 mikrogram Gentamisin ile% 10 FBS ve 48 ila 72 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnklüzyonlar, mutajenezden yaklaşık 36 saat sonra 72 saat sonra bakteri eksikliği gösterir. İnklüzyonların yaklaşık% 10'u bakterilerle doldurulurken, geri kalanı hipotonik lizis yoluyla temel cisimleri veya EBS'yi çıkarmak için boş kalır ve ortamı tamamen aspire eder. Hücreleri çıkarmak için bir mililitre su ve 10 dakika boyunca kaya ekleyin, hücreleri en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek parçalayın.

Lizatı bir mikro füj tüpünde topladıktan sonra, bir x nihai konsantrasyona 0.25 mililitre beş x sakaroz, fosfat glutamat tamponu veya SPG ekleyin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Altı hücrenin 10'unu üç mililitre DMEM'de yaklaşık 0.4 kez tohumlayarak, altı kuyucuklu plakada birleşik mono ves hücreleri katmanlarını ayarlayın, hücrelerin önümüzdeki 24 saat içinde homojen bir tek tabaka oluşturmasına izin verin. Gelecek sonbaharda buz, mutajen klamidya'nın bir stok çözeltisi.

Daha sonra, DMEM% 10 FBS'de seyreltme başına toplam 200 mikrolitre hacimde on kat seri seyreltme tüpü hazırlayın ve bunları buz üzerine koyun. Vero hücrelerini iki kez yıkamak için PBS kuyusu başına üç mililitre kullanın. Daha sonra, altı oyuklu plaka ve 100 mikrolitre bakteri seyreltmesi için her bir kuyucuğa üç mililitre DMEM ekleyin.

Eşit karışım sağlamak için plakayı döndürün. Enfekte olmuş plakaları 2.700 GS'de 15 santigrat derecede 30 dakika döndürün. Daha sonra 37 santigrat derecede nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatörde bir ila iki saat inkübe edin.

Bu arada, önce aşağıdaki malzemeleri birleştirip karıştırarak DMEM'de %0,54 AROS hazırlayın. Daha sonra topaklanmayı önlemek için 18.9 mililitre sıcak steril,% 1.2 aros su ile karıştırın. Karışımı 55 santigrat derece su banyosunda sıcak tutun.

Bakteriyel süspansiyonu bulaşıklardan aspire edin ve altı mililitre ılık aro çözeltisi ekleyin. Davlumbazın dışındaki oda sıcaklığında tamamen katılaşmasına izin verin. Daha sonra kapakları çıkarılmış olarak biyogüvenlik davlumbazında, plakalar kuruduğunda plakaları 15 dakika daha kurutun, yedi ila 10 gün boyunca bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.

Plaklar, mutantları izole etmeden bir gün önce diseksiyon mikroskobu yardımıyla görünür olmalıdır. Kuyucuk başına 100 mikrolitrede bir kez 10 ila dört sıfır hücresine bakın. 96 oyuklu bir plakada, hücreler 24 saat içinde birleşecektir.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, toplanacak plakları işaretleyin ve ardından plak tıkaçlarını toplamak için steril bir mililitrelik bariyer pipeti kullanın. Resus, plakları mililitre başına %10 FBS 400 nanogram, siklo, heide ve mililitre başına 50 mikrogram ile desteklenmiş 100 mikrolitre DMEM içinde süspanse eder. Mutant suşları genişletmek için Gentamisin, süspansiyonu Vero hücrelerinin birleşen tek katmanları üzerine yerleştirin.

Hücrelerin% 50'sinden fazlası enfekte olduğunda, enfeksiyondan 48 saat sonra ve 14 gün kadar geç bir sürede ortaya çıkabilen hasat db'lerini inkübe etmeden önce plakaları 30 dakika boyunca 2, 700 GS ve 15 santigrat derecede döndürün. Bu enfekte hücre miktarı, enfekte olmuş hücrelerin hipotonik lizisi yoluyla EV'leri çıkarmak için yeterli sayıda canlı bakterinin depolanmasına izin verir. Ortamı 160 mikrolitre steril suda aspire ettikten sonra oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Tam lizizi sağlamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri parçalamak için bariyer uçları kullanın. Son olarak, her lizattan 160 mikrolitreyi mikro fuge tüplerine aktarın. 40 mikrolitre beş XSPG ekleyin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın, ilgilenilen fenotipler için mutantları test etmeye ve taramaya hazır olana kadar.

Mutajene maruz kalmak, muhtemelen bakteri hücre ölümü nedeniyle bakteriden yoksun görünen inklüzyonlara yol açar. Tipik olarak, serovar LGVL iki, enfeksiyondan sonraki 48 saat içinde enfekte olmuş hücreleri tamamen bitleyecektir, ancak mutajenlerle tedavi bu döngüyü 90 saatten daha uzun sürebilir ve deneylerimizde inklüzyonların yaklaşık% 10'unun iyileşmesi beklenmektedir. Mililitre EMS başına 20 miligram ile tedavi edilen enfekte Vero hücreleri, bu şekilde görüldüğü gibi tedavi edilmemiş kontrollere kıyasla enfeksiyöz döllerin iyileşmesinde% 99'luk bir azalmaya yol açmıştır.

Mutagen tedavisi ayrıca küçük plaklar da dahil olmak üzere değişmiş morfolojilere sahip plakların ortaya çıkmasına neden olmuştur. Diğer morfolojiler, burada gösterildiği gibi granüler, topaklanmış veya bal peteği şeklinde görünen plakları içerir. Bu çalışmalarda kullanılan EMS dozları, NGS tarafından deneysel olarak değerlendirildiği gibi KCL genomu başına üç ila 30 mutasyona yol açabilir.

Gradyan saflaştırılmış EBS büyük ölçüde konak hücre materyali içermemesine rağmen, konak DNA da tespit edilir ve bu prosedürü takiben genomik preparatların yaklaşık% 10 ila 15'ini oluşturur. Klamidya oluşumu ve sürdürülmesi için hangi bakteriyel faktörlerin gerekli olduğu, patojenik faktörler gibi ek soruları yanıtlamak için doku kültürü hücrelerinde bozulmuş replikasyon, biyokimyasal aktivitelerin kaybı veya bakteri morfolojilerinin değişmesi gibi fenotiplere yönelik taramalar yapılabilir.