Ileri Genetik Yaklaşımlar

Bu prosedürün genel amacı, kimyasal mutajenez gerçekleştirerek ve genotip-fenotip ilişkilerini belirleyerek chlamydia tritus üzerinde genetik analiz yapmaktır. Bu işlem, öncelikle kimyasal mutajenez kullanılarak chlamydia tracom mutant suşlarının üretilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, kimyasal yollarla oluşturulan tüm mutasyonlar, tüm genom dizileme ve ardından referans kılavuzlu genom montajı ile tanımlanır.

Ardından, mutant suşlardaki fenotip-genotip ilişkileri belirlenir. Son olarak, rekombinant suşlar oluşturulup analiz edilerek fenotip-genotip ilişkileri doğrulanır. Nihayetinde, klasik kimyasal mutajenez yaklaşımları ve yeni nesil dizilemenin bir kombinasyonu aracılığıyla, belirli bir chlamydia genindeki mutasyonun ilgilenilen bir fenotipe yol açtığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Şu anda chlamydia'da gen değişimi için mevcut bir yöntem bulunmamaktadır ve çalışmaya yönelik moleküler genetik araçlar henüz başlangıç aşamasındadır. Bu yöntem, rekombinant DNA ile transformasyon veya moleküler genetik araçların geliştirilmesini gerektirmez, ancak aynı amaca ulaşır. Bu amaç, bireysel gen ürünlerine fonksiyon ataması yapılmasıdır.

Kültür hücrelerini hazırlamak için, 25 santimetrekareye yaklaşık 1 × 10⁶ vir hücresini, %10 FBS ile desteklenmiş 3 mililitre DMEM içerisinde, 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit altında inkübe ederek yerleştirin. Yaklaşık 24 saat sonra hücreler konfluansa ulaştığında, besiyerini aspire edin ve hücreleri beş enfeksiyon multiplicitiesi ile chlamydia ile enfekte edin. Enfeksiyon sonrası 18. saatte mutajeneze başlamak için, 200 nanogram/mililitre sikloheksimid içeren toplam 3 mililitre DMEM-FBS hacminde işlemini gerçekleştirin; kimyasal çeker ocak altında, PBS içerisinde kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile 20 miligram/mililitre etil metansülfonat (EMS) hazırlayın.

EMS güçlü bir mutajen ve karsinojendir. Bu nedenle, bertaraf işlemi için metin protokolüne bakınız. Vero hücrelerindeki besiyerini aspire edin ve hücreleri magnezyum klorür ve kalsiyum klorür içeren üç mililitre PBS ile bir kez yıkayın.

Ardından üç mililitre EMS çözeltisi ekleyin ve çeker ocak içerisinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından EMS'yi uzaklaştırın ve hücreleri, kalıntı EMS'yi temizlemek için üç kez yıkamadan önce, mutajeni inaktive etmek amacıyla bir molar sodyum hidroksit içeren bir kaba yerleştirin. Daha sonra 200 nanogram/mililitre sikloheksamid ve 25 mikrogram/mililitre Gentamisin içeren %10 FBS'li DMEM'den altı mililitre ekleyin ve 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda 48 ila 72 saat boyunca inkübe edin.

Mutajenezden 36 saat sonra ve 72. saatte inklüzyonlar bakteriden yoksun görünür. İnklüzyonların yaklaşık %10'u bakterilerle doluyken, geri kalanı boş kalır; elementer cisimcikleri veya EB'lerilele çıkarmak için hipotonik lizis uygulayın ve medyumu tamamen aspire edin. Hücreleri yerinden çıkarmak için bir mililitre su ekleyin ve 10 dakika boyunca sallayın, hücreleri en az 10 kez pipetle yukarı aşağı çekerek lizleyin.

Lizat bir mikro santrifüj tüpüne toplandıktan sonra, 1x son konsantrasyona ulaşacak şekilde 0,25 mililitre beş x sükroz, fosfat glutamat tamponu veya SPG ekleyin ve minus 80 degrees Celsius'ta saklayın. Altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna, 3 mililitre DMEM %10FBS içerisinde yaklaşık 0,4 x 10⁶ ves hücresi ekerek konfluen monokatmanlar oluşturun ve hücrelerin sonraki 24 saat boyunca homojen bir monokatman oluşturmasına izin verin. Ardından, buz üzerinde mutajen chlamydia stok çözeltisini hazırlayın.

Ardından, DMEM %10 FBS içerisinde, dilüsyon başına toplam 200 µL hacminde on katlık seri dilüsyon şeklinde altı tüp hazırlayın ve bunları buz üzerinde bekletin. Vero hücrelerini iki kez yıkamak için kuyu başına 3 mL PBS kullanın. Daha sonra, altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 3 mL DMEM ve çift örneği şeklinde bakteriyel dilüsyondan 100 µL ekleyin.

Homojen bir karışım sağlamak için plakayı dairesel hareketlerle sallayın. Enfekte plakaları 15 °C'de 30 dakika boyunca 2.700 ×g hızda santrifüjleyin. Ardından, plakaları nemlendirilmiş %5 karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de bir ila iki saat inkübe edin.

Bu sırada, önce aşağıdaki malzemeleri birleştirip karıştırarak DMEM içinde %0,54 AROS hazırlayın. Ardından, topaklanmayı önlemek için karıştırarak 18,9 mililitre sıcak steril, suda %1,2'lik AROS ekleyin. Karışımı 55 °C'lik bir su banyosunda sıcak tutun.

Bakteri süspansiyonunu kaplardan aspire edin ve altı mililitre ılık aro çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında, çeker ocak dışında tamamen katılaşmasını bekleyin. Ardından, kapakları çıkarılmış şekilde biyogüvenlik kabininde plakaları 15 dakika daha kurutun; plakalar kuruduğunda, onları bir karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de yedi ila 10 gün boyunca inkübe edin.

Plaklar, mutantların izole edilmesinden bir gün önce bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla görünür olmalıdır. Kuyucuk başına 100 µL'de 1 × 10⁴ hücre ekleyin. 96 kuyucuklu bir plaka içinde, hücreler 24 saat içinde konfluens olacaktır.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, toplanacak plakları işaretleyin ve ardından plak tıkaçlarını toplamak için steril bir mililitrelik bariyer pipeti kullanın. Mutant suşları genişletmek için plakları, %10 FBS, 400 nanograms per milliliter cyclo, heide ve 50 micrograms per milliliter Gentamicin ile desteklenmiş 100 microliters DMEM içinde yeniden süspande edin; ardından süspansiyonu konfluen Vero hücresi monotabakaları üzerine yayın.

Hücrelerin %50'den fazlası enfekte olduğunda (bu durum enfeksiyondan sonra erken olarak 48. saatte veya geç olarak 14. günde gerçekleşebilir), hasat işlemini gerçekleştirmek için plakları 30 dakika boyunca 2.700 g ve 15 °C'de santrifüjleyin. Enfekte hücrelerin bu miktarı, enfekte hücrelerin hipotonik lizi ile EV'lerin ekstrakte edilebilmesi için yeterli miktarda canlı bakterinin depolanmasına olanak tanır. Besiyerini aspire ettikten sonra 160 µL steril su ekleyin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Tam lizis sağlamak için hücreleri birkaç kez yukarı-aşağı pipetleyerek parçalamak amacıyla bariyerli uçlar kullanın. Son olarak, her lizattan 160 µL'yi mikro santrifüj tüplerine aktarın. 40 µL beş XSPG ekleyin ve analiz yapmaya ve mutantları ilgili fenotipler açısından taramaya hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

Mutajene maruz kalma, muhtemelen bakteriyel hücre ölümü nedeniyle, bakterilerden yoksun görünen inklüzyonların oluşmasına yol açar. Tipik olarak, serovar LGVL iki, enfeksiyondan sonraki 48 saat içinde enfekte hücreleri tamamen parçalar; ancak mutajenlerle tedavi bu döngüyü 90 saatin üzerine çıkarabilir ve deneylerimizde inklüzyonların yaklaşık %10'unun iyileşmesi beklenir. Bu şekilde görüldüğü üzere, 20 mg/mL EMS ile tedavi edilen enfekte Vero hücreleri, tedavi edilmemiş kontrollere kıyasla enfeksiyöz progeninin geri kazanımında %99 oranında bir azalmaya yol açmıştır.

Mutajen uygulaması ayrıca, küçük plaklar da dahil olmak üzere farklı morfolojilere sahip plakların ortaya çıkmasına yol açmıştır. Diğer morfolojiler arasında, burada gösterildiği gibi granüler, kümeli veya petek şeklinde görünen plaklar yer almaktadır. Bu çalışmalarda kullanılan EMS dozları, NGS ile deneysel olarak değerlendirildiği üzere, KCL genomu başına 3 ila 30 arasında mutasyona yol açabilmektedir.

Gradyan ile saflaştırılmış EBS'ler büyük oranda konak hücre materyalinden arınmış olsa da, bu prosedürün ardından yapılan genomik hazırlıklarda konak DNA'sı da tespit edilmekte ve toplam içeriğin yaklaşık %10 ila %15'ini oluşturmaktadır. Chlamydia'nın oluşumu ve korunması için hangi bakteriyel faktörlerin gerekli olduğu ve patojenik faktörler gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla; doku kültür hücrelerinde bozulmuş replikasyon, biyokimyasal aktivitelerin kaybı veya değişmiş bakteriyel morfolojiler gibi fenotipler için taramalar gerçekleştirilebilir.