Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, bir ilaç iletim sisteminin veya terapötik ajanın transportunu değerlendirmektir. Bu ajan, oral ilaç iletimiyle ilgili olan gastrointestinal epitelyum modeli gibi hücresel bir bariyer boyunca taşınır. Bu işlem, öncelikle hücre farklılaşmasına ve bir hücre monokatmanının oluşumuna izin vermek için transwell insertleri üzerinde caco two hücrelerinin kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir.

İkinci adım, transepitelyal elektriksel direncin ölçülmesi, hücre bağlantılarının immün boyanması ve saptanabilir bir izleyici molekülün pasif geçirgenliğinin değerlendirilmesi yoluyla bu modelin bir geçirgenlik bariyerini temsil ettiğinin doğrulanmasıdır. Bir sonraki adım, ilaç taşıma sisteminin hazırlanmasıdır; bu örnekte hedeflenmiş polimer nanotaşıyıcılar kullanılmıştır. Taşıyıcılar ilaç yükü içerebilir veya içermeyebilir; ayrıca hedeflenmemiş taşıyıcılar veya serbest ilaç gibi kontroller çalışmaya dahil edilmelidir.

Bu elementler, tespit edilebilmelerini sağlamak için radyoizotoplarla işaretlenir. Ardından taşıyıcılar, inkübasyon sonrası hücre monotabakasının üzerindeki apikal bölmeye eklenir. Farklı zaman noktalarında taşıyıcılar apikal bölmeden, bazolateral bölmeden ve hücre monotabakasından toplanır ve işaretli bileşenin olası degradasyonu açısından test edilir.

Taşıma mekanizmasını incelemek için son olarak hücre monotabakası boyunca nanotaşıyıcı taşınımı hesaplanır. Benzer deneyler, hücreler arası transitozun farmakolojik inhibitörleri veya hücreler arası parasellüler taşınım raporlayıcılarının varlığında yürütülmelidir. Burada tanımladığımız teknik, vücuttaki hücre bariyerlerini temsil eden kültür ortamındaki hücre monotabakaları boyunca ilaçların ve ilaç nanotaşıyıcılarının taşınım hızını ve mekanizmasını değerlendirmek için kullanılan, iyi yapılandırılmış yöntemlerin bir uyarlamasıdır.

Burada odaklandığımız örnek, hedeflenmiş polimer nanoparçacıkların gastrointestinal epitel modelindeki taşınmasını doğrulasay da, benzer yöntemler farklı ilaç iletim sistemlerinin bu veya farklı hücre tek tabakalarından geçişini incelemek için de uygulanabilir; örneğin, kan akışı ile dokular ve organlar arasında tipik olarak bir bariyer oluşturan endotel hücreler gibi. Kan beyin bariyeri örneğinde olduğu gibi, bu yönteme yeni başlayan kişiler, özellikle ilaç iletim sistemleri hücreler üzerinden ve düşük miktarlarda taşındığında, bu çalışmaları uygun şekilde izlemek için etiket seçimindeki zorluklar nedeniyle güçlük çekeceklerdir.

Bu hususta, çalışmalarımızda ilaç taşıyıcı sistemleri işaretlemek için radyoizotoplar kullanacağız; bir diğer önemli konu ise model hücre bariyerinin bütünlüğünü doğrulamak ve deneyler aracılığıyla bunu kanıtlamak için uygun kontrolleri kullanmaktır. Bu işlem, steril bir biyogüvenlik seviyesi iki hücre kültürü davlumbazında gerçekleştirilir ve davlumbaza giren tüm malzemeler etanol ile sterilize edilmelidir; forseps kullanarak 0,8 µm gözenekli polietilen tereftalat transwell insertleri, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin.

Her bir deneysel koşul için en az dört tekrar gereklidir. İnsan epitelyal kolorektal adenokarsinom veya caco two hücrelerini önceden hazırlanmış hücre besiyerinde seyreltin. Hücre solüsyonundan 200 ila 400 µL'yi transwell'in üst veya apikal haznesine yerleştirin.

Santimetrekare başına 1,5 x 10⁵ hücre yoğunluğunda ekim yapın. Alt veya bazolateral bölmeyi 700 ila 900 µL hücre kültür ortamı ile doldurun; hücreleri 37 °C, %5 CO₂ ve %95 nem altında 16 ila 21 gün boyunca tutun ve her üç ila dört günde bir üst ve alt bölmelerdeki ortamı yenileyin.

Hücre tek tabakasının üzerindeki basıncı korumak için besiyerini şu sırayla değiştirin: önce alt haznedeki besiyerini aspire edin, ardından üst haznedeki besiyerini aspire edin. Epitel geçirgenlik bariyerini katmanlar halinde doğrulamak için üst hazneyi 200 ile 400 µL taze besiyeri ile ve alt hazneyi 700 ile 900 µL taze besiyeri ile doldurun. Voltmetreyi direnç ayarına getirin ve elektrotları transwell insert içeren bir kuyucuğa dikey olarak yerleştirin.

Kısa elektrot üst bölmede, uzun elektrot ise alt bölmede kuyruğun tabanına değecek şekilde bulunmalıdır. Voltmetre okuması stabilize olduğunda, her biri için direnç değerini ohm cinsinden kaydedin. TEER değerleri maksimuma çıkıp, geçirgenlik bariyerinin oluştuğunu gösteren bir platoya ulaşana kadar ölçümleri her bir ila iki günde bir tekrarlayın; bu süreç genellikle hücre ekimi anından itibaren iki ila üç hafta sürer.

Hücre tek tabakalarındaki sıkı bağlantıların varlığını doğrulamak için öncelikle hücreleri fikse edin, her iki bölmedeki medyumu aspire edin ve hücreleri ılık DMEM ile üç kez yıkayıp soğuk %2 paraformaldehit ile 15 dakika inkübe edin. 15 dakika sonra paraformaldehiti uzaklaştırın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, her birine mililitre başına bir mikrogram anti-okludin ekleyin.

Bariyer oluşumu için düşük sızıntılı kuyucuklar negatif kontrol olarak kullanılacaktır. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, hücreleri tekrar PBS ile yıkayın ve ardından her kuyucuğa 7,5 µg/mL etiketli sekonder antikorlar ekleyip oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, hücreleri PBS ile yıkayın ve sabitlenmiş tek tabakanın yapışık olduğu filtre membranını dikkatlice kesin; epi-floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntüleme yapmak üzere lamların üzerine yerleştirin.

Bu prosedür, hedefleme antikorunun iyot 1 25 ile işaretlenmesi ve daha önce yayınlanmış protokoller kullanılarak işaretli antikorun spesifik aktivitesinin dakika başına sayım başına mikrogram cinsinden hesaplanmasıyla başlar. Bu örnekte, hedefleme antikoru, özgünlüğü kontrol etmek amacıyla insan hücreler arası adezyon molekülü bir'e karşı geliştirilmiş bir fare monoklonal antikoru veya anti ICAM bir'dir. Terapötik bir yükün taşınmasını incelemek için hedeflenmemiş kaplamalı nanotaşıyıcılar hazırlamak amacıyla iyot 1 25 ile işaretlenmiş fare IgG kullanılacaktır.

Kargo ayrıca iyot 1 25 ile işaretlenmiştir. Bu örnekte kargo, genetik bir lizozomal depolama hastalığı olan Fabry hastalığının tedavisi için kullanılan terapötik bir enzim olan alfa galakto SASE veya Alpha G'dir. Bu prosedürün en zor yönlerinden biri, taşınan materyallerin yeterli düzeyde tespit edilmesini sağlamaktır.

Başarıyı sağlamak için, nanotaşıyıcı bileşenler yüksek spesifik aktiviteye sahip yeterli miktarda izotop ile işaretlenmelidir. Bir sonraki adım, işaretli anti-ICAM'ın nanotaşıyıcıların yüzeyine bağlanmasıdır. Bu durumda, spesifik olmayan kontrol için bir model olarak, iyot 1 25 ile işaretli anti-ICAM'ı 100 nanometre çapındaki polistiren nanoboncuklarla basitçe karıştırıyoruz.

İyot 125 ile işaretlenmiş IgG kullanın ve bir kargonun taşınmasını izlemek için anti-ICAM ile iyot 125 ile işaretlenmiş Alpha G kombinasyonunu kullanın. Yüzey absorbsiyonunun gerçekleşmesi için karışımları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; bir saat sonra 13.000 g'de üç dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanttaki kaplanmamış karşılıkları aspirasyon pipeti ile uzaklaştırarak, kaplanmış nano taşıyıcıları içeren peleti %1 Sığır serum albümini içeren PBS içinde süspande edin; ardından potansiyel partikül agregatlarını parçalamak için düşük güçte sonikasyon uygulayın. İyot 125 işaretli anti-ICAM nano taşıyıcıları, konfluent Caco-2 tek katmanlarının üzerindeki üst hazneye yüksek konsantrasyonda ekleyin. Konsantrasyonu ölçtükten sonra prosedürü spesifik olmayan ve terapötik karşılıklar için tekrarlayın.

İstenen bir veya daha fazla zaman aralığı boyunca 37 °C'de inkübe edin. İnkübasyon sonrası yırtılmayı tekrar ölçün. Yırtılma ölçümleri, nano taşıyıcıların geçirgenlik bariyeri üzerindeki etkilerini değerlendirmek içindir.

Üst ve alt bölmelerden medyumu toplayın. Üst bölmeyi 37 °C'de 0.5 mL DMEM ile, alt bölmeyi ise 1 mL deiyonize su ile yıkayın. Hücre fraksiyonunun ölçümü için gama sayacı kullanarak toplam radyoizotop içeriğinin belirlenmesi amacıyla yıkama sıvılarını toplayın.

Kenarlarından bir jilet yardımıyla keserek geçirgen filtreyi çıkarın. Taşıma sırasında veya olası bozunma nedeniyle nano taşıyıcılardan salınan iyot 1 25'i ölçmek amacıyla, hücreyle ilişkili toplam radyoaktiviteyi ölçmeden önce hücre içeriklerini serbest bırakmak için %1 Triton X 100 içeren bir gama sayacı tüpünde 10 dakika inkübe edin. İlk olarak, her bir örneğin 300 µL'sini PBS içinde %3 BSA'nın 700 µL'si ve 200 µL trikloroasetik asit veya TCA ile karıştırıp oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Bu 15 dakikalık inkübasyon sırasında, örneklerin toplam radyoaktivitesini bir gama sayıcıda ölçün; sağlam proteini, degrade olmuş proteinden veya iyot 1 25 fraksiyonundan ayırmak için TCA örneklerini 3000 GS'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Serbest iyot 1 25 fraksiyonunun radyoaktivitesini belirleyin ve bu değeri santrifüjden önce ölçülen toplam radyoaktiviteden çıkarın. Bu işlem, albümin parasellüler sızıntısını kullanarak parasellüler transportu değerlendirmek için işaretli protein miktarını, ondan ayrılan radyotrasör fraksiyonuna karşı sağlayacaktır; daha önce gösterildiği gibi transwell insertlerde KCO iki monokatmanları kültüre edin ve hücre monokatmanının üzerindeki üst bölme ortamına, bazal sızıntı düzeyini gösteren bir negatif kontrol olarak yalnızca iyot 1 25 işaretli albümin veya iyot ekleyin.

1 ²⁵ etiketli albümin ve radyo etiketli olmayan antikor. Hedeflenmiş nano taşıyıcılar, nz.Transport test edilirken incelenenlerle uyumlu olması gereken seçilmiş zaman aralıkları boyunca 37 °C'de inkübe edilir. İnkübasyon öncesinde, sırasında ve sonrasında, daha önce gösterildiği şekilde gözyaşı ölçümü yapın.

Hücreler arası bağlantıların açılması için pozitif kontrol olarak toplam iyot 1 25 ve serbest iyot 1 25 ölçümleri yapmak üzere inkübasyon sonrası tüm fraksiyonları toplayın. Transwell'in üst ve alt bölmelerine beş millimolar hidrojen peroksit içeren hücre besiyeri ekleyin. Yerleştirin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Gözyaşı miktarını ölçün ve seçilen zaman aralıkları boyunca üst bölmeye iyot 1 25 albümin ekleyin. Hidrojen peroksitin neden olduğu hücre bağlantılarının açılmasına bağlı gözyaşı değerindeki azalmayı belirlemek için inkübasyon boyunca çeşitli zaman noktalarında ölçüm yapın. Paralel deneylerde, konfluen Caco two monokatmanlarını bu inhibitörlerin her biriyle inkübe ederek iyot 1 25 hedefli nanotaşıyıcıların transhücresel transportunu veya transositozunu değerlendirin.

Klatrin aracılı endositoz inhibitörü olan 50 µM MDC. Klatrin aracılı endositoz inhibitörü olan 1 µg/mL filipin. Makropinositozda rol oynayan Fosfatidilinozitol 3-kinaz inhibitörü olan 0,5 µM wortmannin ve 20 µM EIPA.

Makropinositoz ve kemya aracılı endositoz inhibitörü, inhibitörlerin tek tabaka geçirgenliği üzerindeki etkisini kontrol etmek ve CACO 2 tek tabakalarını valide etmek amacıyla, hücrelerin inhibitörler ve radyoaktif işaretli materyallerle inkübasyonu öncesinde, sırasında ve sonrasında TEER ölçümleri yapılmıştır. Hedefli nanotaşıyıcıların trans-epitel transportu için bir model olarak, Caco 2 hücreleri transwell insertleri üzerinde santimetrekare başına 1,5 × 10⁵ hücre yoğunluğunda büyütülmüş ve tek tabaka bütünlüğünü değerlendirmek için trans-epitel elektriksel direnç veya TEER ölçülmüştür; bu grafikte gösterildiği üzere, tek tabaka 12. günde konfluense ulaşmış ve tek tabaka bütünlüğünü 18. güne kadar korumuştur. Bu sonuç, 14. günde 380 Ω/cm² gibi yüksek bir TEER değerine sahip tek tabakalarda okkudin pozitif sıkı bağlantıların varlığıyla, 17 Ω/cm² gibi düşük bir TEER değerine sahip tek tabakalardaki zayıf sıkı bağlantı işaretlemesine kıyasla daha da valide edilmiştir. Beşinci günde, anti-ICAM nanotaşıyıcıların Caco 2 hücre tek tabakaları üzerindeki transportunu değerlendirmek için, transwell insertleri üzerinde büyütülen konfluent Caco 2 tek tabakaları, apikal kamaraya eklenen iyot 125 işaretli anti-ICAM nanotaşıyıcılar ile inkübe edilmiştir.

Hücre başına taşınan nano taşıyıcı miktarını hesaplamak için bazolateral odadaki Iodine 1 25 içeriği, üst panelde gösterildiği üzere belirtilen zaman noktalarında ölçülmüştür; alt panelde ise taşınan nano taşıyıcı yüzdesi, bazolateral fraksiyonda bulunan taşıyıcıların, birleşik bazolateral ve hücre fraksiyonlarına oranına göre hesaplanmıştır. Bu örnekte Iodine 1 25 anti ICAM nano taşıyıcılar için tahmin edilen bu parametreler, hedeflenmemiş bir karşılığa göre taşıma verimliliğini göstermek amacıyla kontrol olan Iodine 1 25 IgG nano taşıyıcıların parametreleri ile karşılaştırılmış ve sonuçlar üst panelde sunulmuştur.

Radyoaktif etiket nanotaşıyıcı yüke dahil edildiğinde, alt panelde gösterildiği üzere iyot 1 25 anti-ICAM nanotaşıyıcılarının veya iyot 1 25 IgG nanotaşıyıcılarının taşıma hızlarını yansıtan görünür geçirgenlik katsayıları da hesaplanmıştır. Tanımlanan parametreler, bu örnekte Fabry Hastalığı olarak bilinen genetik bir lizozomal depolama hastalığının tedavisi için kullanılan alfa GA enziminden oluşan yükün taşınmasını yansıtmaktadır. Apikal, bazolateral ve hücre fraksiyonlarının radyoizotop içerikleri 3. ve 24. saatlerde ölçülmüş ve bu tabloda gösterildiği gibi taşımayla ilgili çeşitli değerlere dönüştürülmüştür.

Kargonun izlenmesi yoluyla nanotaşıyıcı transportunun hesaplanmasına ek olarak, bu terapötik enzimin trans-epitel iletimi, hücre başına transport edilen Alpha-gal molekülü veya pikogramı olarak ifade edilerek tahmin edilebilir. Anti-ICAM nanotaşıyıcıların Caco-2 monotabakaları boyunca transport mekanizması da araştırılmıştır. Konfluent Caco-2 monotabakaları boyunca iyot-125 işaretli anti-ICAM nanotaşıyıcıların transsellüler transportu; EIPA, Filipin, MDC veya Wortmannin inhibitörlerinin yokluğunda veya varlığında 24 saatte değerlendirilmiştir. EIPA, makropinositoz ve kaveola aracılı endositoz inhibitörüdür. Filipin, MDC ve Wortmannin ise sırasıyla kaveola aracılı endositoz, klatrin aracılı endositoz ve makropinositoz inhibitörleridir.

Bu grafikte belirtildiği üzere EIPA, CACO-2 hücre tek tabakaları boyunca iyot 125 ile işaretlenmiş anti-ICAM nano taşıyıcıların transportunu azaltmıştır. Buna karşın Filipin MDC ve Wirt Menin, kontrol koşuluna kıyasla transport seviyelerini düşürmemiştir. Bu durum, anti-ICAM nano taşıyıcıların transhücresel transport için caveola aracılı endositozu kullandıklarını, ancak klatrin veya makropinositozla ilişkili transitozu kullanmadıklarını göstermektedir.

Parasellüler transportu değerlendirmek için, iyot 1 25 anti ICAM nanotaşıyıcıların Caco-2 hücre tabakaları boyunca taşınımı sırasında TEER ölçülmüştür. Nanotaşıyıcıların bulunmadığı durumlardaki iki monokatman TEER değeri kontrol olarak gösterilmiştir ve kesikli aralık ortalamanın SEM değerini işaret eder; beş millimolar hidrojen peroksit ile inkübasyon, bazal seviyelere düşüşle yansıtıldığı üzere, hücreler arası bağlantıların açılması için pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.

Ek olarak, beş milimolar hidrojen peroksit, IgG nanotaşıyıcılar veya anti ICAM nanotaşıyıcıların yokluğunda veya varlığında hücre monotabakasını geçen iyot 1 25 albümininin görünür geçirgenlik katsayısı olarak ölçülen parasellüler protein sızıntısı ölçülmüş ve hesaplanmıştır; bu grafiklerde gösterildiği üzere hidrojen peroksit, iyot 1 25 albümin sızıntısını bazolateral bölmeye doğru belirgin şekilde artırmış ve pozitif kontrol olarak hizmet etmiştir. Anti ICAM nanotaşıyıcılar ile inkübasyon, taşınmayan kontrol IgG nanotaşıyıcılarına benzer şekilde, 48 saatlik bir süre boyunca iyot 1 25 albüminin parasellüler sızıntısını değiştirmedi.

Bu sonuçlar parasellüler transportu elemektedir ve anti ICAM nanotaşıyıcıların transsellüler transport için ICAM aracılı endositozu kullandığını öne süren önceki sonuçlarla tutarlıdır. Bu prosedürü gerçekleştirirken, Transwell modeli için bir veya daha fazla uygun hücre tipinin ve uygun gözenek boyutuna, materyal çapına vb. sahip geçirgen bir filtrenin yanı sıra, bu prosedürün ardından ilaç taşıma sisteminizin etkili bir şekilde kantifikasyonu için etiketleme tekniklerinin seçilmesi önemlidir. Taşınan materyallerin konumunu belirlemek ve ek olarak taşınan materyallerin durumunu kontrol etmek için floresan veya transmisyon elektron mikroskopisi gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Protein degradasyonunu ölçmek için Western blot kullanılabilir. Taşınan taşıyıcıların hedefleme kapasitesini belirlemek için EISA kullanılabilir ve ilaç kargonun aktivitesi spektrofotometrik analizler veya diğer uygun teknikler kullanılarak ölçülebilir.