Name: Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı Yerinde Hibridizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Öğrenin, zebrafish embriyolarında düşük yoğunluklu transkriptlerin tespiti için geliştirilmiş tüm dağı yerinde hibridizasyon yöntemini. Bu protokol, gelişimsel biyoloji ve gen fonksiyonu çalışmalarında yüksek çözünürlüklü sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Biz yüksek çözünürlüklü RNA görselleştirmek için geliştirilmiş yöntemler geliştirdik. In situ hibridizasyon prosedürlerinde gözenekli alt (Şekil 1) ile basit bir ölçüye sepet ile gerçekleştirilmektedir. Embriyolar, steril koşullar altında, oda sıcaklığında 6 oyuklu plakalarda RNase içermeyen çözeltiler kullanılarak işlenir. Ayırmak için embriyolar sepetleri farklı renkli Eppendorf tüpleri yapılır. Ya da bir ağız olmadan Sepetler kolay yönlendirme için kulla...

Zebra balığı (Br.rerio) omurgalı geliştirme, hastalık, davranış çalışma için güçlü bir hayvan modeli olarak ortaya, ve-ilaç tarama 1-3 oldu. Balığı embriyolar, tek bir geçiş yerinden çok sayıda temin edilebilir. Gübreleme ve geliştirme eski rahim ve optik açık embriyoların hızla geliştirmek oluşur. Kritik gelişimsel olaylar ilk 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) meydana gelir. Bu organın taslakları ortaya ve hücre farklılaşması ve başlanması. Proteinlerin demonte veya aşırı ifadesi, morfolino antisens (MO) oligonükleotidlerle embriyoların mikroenjeksiyon yoluyla elde ya da bir ya da iki hücreli aşamada (0,75 HPF) sırasıyla mRNA olabilir. Zebra balığı embriyoların DİLERİZ ilgi belirli genlerin uzay-zamansal ifade çalışma kolaylaştırır. DİLERİZ tekniğin uygulama aşırı ifade için mRNA veya MO ile embriyo mikroenjeksiyon takipess veya demonte özel protein düzeyleri diğer genlerin diferansiyel düzenleme ortaya koymaktadır. Gen ekspresyonu değişiklikleri fenotipik değişikliklerle ilişkili ve erken organogenez sırasında hedef genlerin işlevini ortaya olabilir. Probes hazırlanmış ve önceden depolanmış olabilir, çünkü ISH tekniği altı oyuklu plakalar ve özel yapılmış sepet ile aynı anda en az 20 gen için gen ekspresyonu ortaya çıkarmak için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Taq Polimeraz</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA Klonlama Kiti - Çift Promotör pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ Mini Plazmid Saflaştırma Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 ve HindIII Restriksiyon Enzimleri</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Doymuş Fenol, ultra saf</td><td>Invitrojen</td><td>15513039</td><td>4 ° C'de saklayın. Gözler, cilt ve solunum yolları tahriş edici ve şüpheli kanserojendir. Kullanım sırasında dikkatli olunmalıdır.</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>Toksik ve şüpheli kanserojen. Çeker ocak altında çalışın.</td></tr><tr><td>RNaz içermeyen DNAse I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Küçük alikotlar hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Sp6, T7 ve T3 RNA Polimeraz ile DIG-RNA Etiketleme Karışımı</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İnhibitörü</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Sodyum Asetat (pH 5.5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>%100 Etanol</td><td>Ticari alkoller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dietil Pirokarbonat (DEPC)</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>DEPC göz, cilt ve solunum yolu tahriş edicidir. Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Koruyucu gözlük, eldiven ve maske kullanın.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M (pH 8.0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>Anında Okyanus Tuzu</td><td>Akvaryum Sistemleri</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>-20 ° C'de hazırlayın ve saklayın; Daha sonra kullanmak üzere 40 ml alikot olarak C. PFA toksiktir. Koruyucu gözlük, eldiven ve toz maskesi kullanın.</td></tr><tr><td>Feniltiyokarbomid (PTC)</td> <td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC oldukça toksiktir. Koruyucu gözlük, eldiven ve toz maskesi kullanın.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (Saatçi ' s) Forseps deseni no. 5</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Altı Kuyulu Hücre Kültürü Kümesi</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Sepetler naylon ağ ve Eppendorf tüplerinden yapılmıştır</td><td>Şirket içi hazırlık</td><td></td><td>Sepetleri yapmak için, konik ucu çıkarmak için kenarlı veya kenarsız Eppendorf tüplerini (1,5 ml) kesin. Naylon ağı, boyutuna karşılık gelen küçük parçalar halinde kesin&nbsp; Eppendorf tüplerinin kesik uçları. Kesilen ucu kaplayan naylon ağ ile tüpleri bir elektrik santralinin üzerine yerleştirin&nbsp; hem tüp hem de naylon ağ birbirine yapışana kadar sıcak plaka (çeker ocakta gerçekleştirin). Sepetlerdeki fazla ağı kesin ve kullanılana kadar %100 metanol içinde saklayın.</td></tr><tr><td>Polioksietilenorbitan Monolaurat (Tween 20)</td> <td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Anhidrit</td><td>Sigma</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamin</td><td>Sigma</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamid, yüksek saflık derecesi</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 Reçine</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik Asit monohidrat</td><td>Sigma</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodyum Tuzu</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Salin-sodyum Sitrat Tamponu (SSC)</td> <td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>fırıncı mayası tip X'ten tRNA</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Levamizol Hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N, N-Dimetilformamid susuz (DMF)</td> <td>Sigma</td><td>227056</td><td>Tahriş edici, toksik, yanıcı ve şüpheli teratojen. Eldiven ve gözlük de dahil olmak üzere uygun güvenlik kıyafetleri ile tutun.</td></tr><tr><td>5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>Bu çözeltiyi ışıktan koruyun.</td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium (NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>Bu çözeltiyi ışıktan koruyun.</td></tr><tr><td>Sığır Serumundan Albümin, saflaştırılmış fraksiyon V (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Koyun Anti-digoxigenin-AP Fab Parçaları</td><td>Roche</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu hücre kültürü plakaları</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg(mnx1:GFP)ml2</td><td></td></tr><tr><td>Anında Okyanus</td><td>Akvaryum Sistemleri</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek Çözünürlüklü tüm dağı<em&gt; yerinde</emgen İfade ve fonksiyon eğitim için zebra balığı embriyolar içinde&gt; hibridizasyon

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Bu makale Zebra balığı embriyolarının in situ hibridizasyon (DİLERİZ) in tüm montaj odaklanır. WISH teknoloji doku dağılım ve gelişim aşamasında açısından hem de gen ifadesinin değerlendirilmesi kolaylaştırır. Protokoller digoksijenin ile etiketlenmiş antisens RNA probları kullanılarak zebrabalıkları embriyoların WISH kullanımı tarif edilmektedir. Problar klonlanmış ve lineerize edilmiş gen şablonlar in vitro transkripsiyon yoluyla digoksigenin-bağlı nükleotit ilave edilerek oluşturulur. Belirlenen gelişim aşamalarında hasat embriyoların chorions spesifik problar ile inkübasyondan önce kaldırılır. Aşırı prob kaldırmak için bir yıkama işlemi sonrasında, embriyolar alkalin fosfataz ile konjuge edilmiş anti-digoksigenin antikor ile inkübe edilir. Alkalin fosfataz için bir kromojenik substrat kullanılarak, belirli bir gen ekspresyonu tespit edilebilir. Gen ifade seviyesine bağlı olarak tüm işlem 2-3 gün içinde tamamlanabilir.

Sepet başına 50 embriyo (gen / başına deneysel koşul için) söz konusu genin ifade deseni bir deneyde elde edilebilir olan protokolü kullanarak. Hemen hemen tüm embriyolar belirli bir gen için benzer ekspresyonu göstermektedir. In situ hibridizasyon boyama için temsili örnekler Şekil 3-6 &#39;de gösterilmektedir. Anlamında ve anti-anlamda hem riboprobes PC5.1 karşılık gelen cDNAs, PC5.2 6, SCL/tal-1 7, gata-1 8,9, flk / kdrl ...

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit edilebilir<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme. Bizim geliştirilmiş protokol düşük spesifik olmayan arka plan sinyal düşük bol transkript tespiti için izin verir.

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Bu prosedürün genel amacı, aşamalı zebra balığı embriyoları içindeki ilgilenilen belirli genlerin mekansal zamansal ifadesini değerlendirmektir. Bu, ilk olarak in vitro transkripsiyon kullanılarak bağlı nükleotidlere digo oksijen dahil edilerek CD NA probları üretilerek gerçekleştirilir. Daha sonra, embriyolar tanımlanmış gelişim aşamalarında toplanır.Koryum çıkarılır ve embriyolar eksi 20 santigrat derecede metanol içinde saklanır. Daha sonra sindirim ve fiksasyon sonrası, embriyolar uygun problarla hibritlenir. Son olarak, embriyolar antid geni ve antikorlar ile boyanır ve sinyal alkalin fosfataz için substratlarla geliştirilir.Sonuç olarak, tüm mount in situ hibridizasyon ve görüntüleme yoluyla belirli bir gelişim aşamasında gen ekspresyonunun doku dağılımını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, hedef genin normal ekspresyonu hakkında daha fazla bilgi sağlayabilse de, hastalık modelinde hedef gen ekspresyonu ve diğer genlerin fazla veya az eksprese edildiği durumlar gibi diğer koşullara da uygulanabilir. Mikroenjeksiyon teknolojisini kullanarak, ilgilenilen bir gen için CDNA kullanarak, digo oksijeni sentezlemek için bir RNA etiketleme reaksiyonu ayarlayın Bir RNA'nın serbest reaksiyon şişesindeki etiketli RNA problarında, steril RNA'lara bir ila beş mikrogram saflaştırılmış şablon DNA ekleyerek, 13 mikrolitre hacme kadar serbest muamele edilmiş çift damıtılmış su.Reaksiyonu buz üzerinde soğutun ve aşağıdaki reaktifleri ekleyin: Santrifüj 2000 RPM'yi oda sıcaklığında 30 saniye boyunca hafifçe karıştırdıktan sonra, reaksiyonu inkübasyondan sonra 37 santigrat derecede iki saat inkübe etmeden önce, iki mikrolitre RNA ekleyerek şablon DNA'yı çıkarın. DNA'lar 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edilir ve iki mikrolitre 0.2 molar EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurur, 2.5 mikrolitre dört molar lityum klorür ve 75 mikrolitre %100 etanol ekleyerek reaksiyon ürünlerini çökeltir. Çözeltiyi karıştırın ve eksi 20 santigrat derecede 45 dakika veya gece boyunca inkübe edin.Süspansiyonu 13.000 RPM ve dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Daha sonra peleti 10 dakika döndürdükten sonra buz gibi, %70 etanol ile yıkayın. Peleştirmeyi resüsten önce iki dakika kurutun, 50 mikrolitre nükleaz, ücretsiz çift damıtılmış su içinde süspanse edin.Sonra 30 dakika inkübe edin. 37 santigrat derecede, kalitesini ve bütünlüğünü doğrulamak için probun bir ila iki mikrolitresini %1'lik bir aros jel üzerinde yaklaşık 30 dakika çalıştırın. Ardından, önceden sabitlenmiş ve donmuş embriyoları yeniden sulandırmak için probu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.1,5 mililitrelik mikro tüplerin konik uçlarını keserek sepetler yaparak başlayın. Ardından üst jantları yarısından çıkarın. Uçları örtmek için küçük naylon ağ parçaları kesin ve ardından birkaç başlıkta, boru uçlarını elektrikli bir sıcak plaka üzerinde ısıtın ve soğuduktan sonra ağa bastırın.Fazla naylon ağı çıkarın ve sepetleri oda sıcaklığında% 100 metanol içinde saklayın. Metin protokolüne göre PBS'de art arda metanol seyreltmesi hazırlandıktan ve altı kuyucuklu bir tabağın kuyucuklarına her birinden dört mililitre eklendikten sonra, embriyoları her prob için ayrı sepetlere yerleştirin ve bunları metanol PBS serisinde kuyu başına beş dakika inkübe edin ve PBST'de üç yıkama ile bitirin. Embriyolara oda sıcaklığında proteinaz K ile perme yapın, gelişim aşaması başına aşağıdaki inkübasyon sürelerini kullanın.Daha sonra embriyoları PBS'de% 4 paraform aldehit içinde 20 dakika boyunca sabitleyin ve her biri beş dakika boyunca PBST'de üç kez yıkayın. Daha sonra, asetilasyon karışımını metin protokolüne göre hazırlayın ve embriyoları her biri 10 dakika boyunca iki kez inkübe edin. Daha sonra embriyoları ve PBST'yi her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.Embriyoları steril mikro tüplere aktarın ve 200 mikrolitre hibridizasyon karışımı veya HM ile 70 santigrat derece su banyosunda iki ila dört saat boyunca inkübe edin. Çözeltiye 100 ila 200 nanogram prob ekleyin ve gece boyunca bir su banyosunda 70 santigrat derecede inkübe edin. Prob çözeltisini önceden ısıtılmış HM ile değiştirin ve numuneleri 70 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.Numuneleri bir H-M-S-S-C serisinden geçirdikten ve embriyoları metin protokolüne göre bloke ettikten sonra, embriyoları bir ila 5.000 anti-D AP antikoru seyreltmesinde bir ila 5.000 anti-D AP antikoru içinde inkübe edin ve ertesi gün hafif çalkalama ile dört santigrat derecede bloke edin. Embriyoları her biri 15 dakika boyunca altı kez yıkayın. Embriyoları pres boyadıktan sonra, onları BCIP ve NBT'de inkübe edin.Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında ekleyin. Reaksiyonu durdurmak için her 30 dakikada bir boyama reaksiyonunu izlemek için bir stereo mikroskop kullanın. Embriyo sepetlerini, her biri hafif çalkalama ile 10 dakika boyunca iki kez durdurma çözeltisi içeren kuyucuklara aktarın.Embriyoları PBS'de% 4 para formaldehit ile 20 dakika boyunca sabitledikten sonra. Embriyoları% 100gliserol içeren altı oyuklu plakaya mümkün olduğunca az PBS'ye transfer ederek monte edin. Embriyoları karanlıkta oda sıcaklığında nazikçe sallayın, stereo mikroskop altında% 100 gliserolde gece boyunca görüntü alın.Yerinde hibridizasyon boyamanın temsili örnekleri burada gösterilmiştir. İlgilenilen ribo probu ile hibridizasyondan sonra gözlenen mor boyama, belirli bir genin hem bolluğunu hem de ekspresyon bölgelerini temsil eder. Örneğin, PC 5.1, döllenmeden 24 saat sonra otik vezikül ve lateral çizginin ön ve arka kısmı içinde çok ayrı ekspresyon gösterir ve döllenmeden 72 saat sonra ön ve arka lateral çizgi nöro direkleri içinde güçlü bir şekilde lokalize olur.Buna karşılık, PC 5.2, somitler otik vezikül ve eğilimli frik kanalı içinde belirgin bölgeselleşme ile CNS içinde her yerde ekspresyon gösterir ve döllenmeden 96 saat sonra karaciğer ve bağırsakta yüksek oranda eksprese edilir. İlgili duyu Ribo probları kullanılırken gen ekspresyonunun olmaması, burada görüldüğü gibi negatif bir kontrol görevi görür. Kan belirteçlerinin ekspresyon analizleri, bilateral kraniyal hücrelerde ve ara hücre kütlesinde veya ICM'de SCL T one'ın boyandığını gösterdi.gata one için lekelenme ICM içinde de görülse de, ifade paterni farklıdır. Arka beyin ana ve intersegmental damarlarda F-L-K-K-D-R-L ekspresyonu gözlendi ve ICM'de no kordonunda sonik kirpi için boyanma gözlendi. Bu örneklerde, döllenmeden 34 saat sonra DLX iki'nin ekspresyonu Talon Cephalon hipotalamus ve kranio mezenkimal kemerlerde lokalize olur ve FK D yedi Fox, döllenmeden 24 saat sonra bir ekspresyon esas olarak zemin plakasında ve HypoChlor ekspresyonunda görülür.Pankreas belirteçlerinin paternleri endokrin pankreasta insülin boyaması ve ekzokrin pankreasta tripsin gösterdi. Yüksek çözünürlüklü ekspresyon modellerini gösteren sonuçlar, gösterilen hem yüksek hem de düşük bolluklu genlerin ekspresyonunun tespiti için ana hatlarıyla belirtilen protokolün başarısını doğrulamaktadır. İşte bazı optimal koşullar altında gerçekleştirilen deneylerden bazı örnekler.Örneğin, zayıf sonik kirpi ifadesine sahip yüksek bir arka plan sinyali, 55 ila 60 santigrat derece arasındaki yetersiz, geçirgen ve hibridizasyondan kaynaklanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı embriyolarının hendek etiketli RNA probları, hibridizasyon sonrası boyama ve görüntüleme kullanılarak iki hibridizasyonunda tüm montajın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

high-resolution-whole-mount-situ-hybridization-within-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Zebra balığı embriyonik kalp immün yapmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Tüm montaj immün yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çok daha az işlem süresi içinde kalp hücre / hücre içi yapıları ortaya yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde sağlayan antikorlar, penetrasyon önemli ölçüde artırır.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

Teknikler, tüm zebra balığı embriyolar fosfo-epitopları immunostain ve daha sonra birincil kirpikler kadar küçük hücresel yapılarının iki renkli flüoresan konfokal lokalizasyonu yapmak için tarif edilmiştir. tespit ve görüntüleme için teknikler yer ve spesifik protein ortaya veya aktivasyon kinetikleri tanımlayabilir.

Tüm Dağı Zebra balığı Embriyolar kirpikli Organları boyanmasına Fosfo-epitoplar

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Gen düzenleme teknolojileri, araştırmacıların gen fonksiyonlarını göreceli kolaylıkla araştırmak için zebra balığı mutantları oluşturmalarını sağlamıştır. Burada, zebra balıklarında in situ hibridizasyon sinyallerinin paralel embriyo genotiplemesi ve nicelemesi için bir kılavuz sa¤l›k sa¤l›k sa¤l›¤ › sa¤l›yor. Bu tarafsız yaklaşım, in situ hibridizasyona dayalı fenotipik analizlerde daha fazla doğruluk sağlar.

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

Bu makalede, uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi için kırılgan zebra balığı embriyoları monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu düşük maliyetli yöntem herhangi bir ters mikroskop görüntüleme için düzenli cam alt mikroskopi yemekleri kullanarak gerçekleştirmek kolaydır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Zebra balığı böbrek gelişimini anlamak için önemli bir modeldir. Burada, mezonephros gelişimi sırasında zebra balığı larvalarında ve yavrularda gen ekspresyonunu tespit etmek için bir in situ melezleme protokolü optimize edilmiştir.

In Situ Mesonephros Gelişimi Sırasında Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Melezleme

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Öğrenin, zebrafish embriyolarında düşük yoğunluklu transkriptlerin tespiti için geliştirilmiş tüm dağı yerinde hibridizasyon yöntemini. Bu protokol, gelişimsel biyoloji ve gen fonksiyonu çalışmalarında yüksek çözünürlüklü sonuçlar sunar.

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı

Daha fazla video keşfet