Name: Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Öğrenin, kültür hücrelerinde ATP ölçümü ve kızılötesi görüntüleme kullanarak çoklu canlılık tahlilleri yapmayı. Bu yöntem, hücresel sağlığın metabolik ve yapısal yönlerini kapsamlı şekilde değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz ATP deneyinde reaktiflerin hacimleri üzerindeki tasarruf fikri Juliann Jaumotte kabul. Biz bu çalışmalar için mali destek sağlayan Mary Caruso, Deb Willson ve Jackie Farrer ve Eczacılık Mylan Okulu muhteşem idari destek için gönülden teşekkür ederiz. Teşekkür de Hunkele korkunç Hastalıkları Vakfı ve Parkinson ve Hareket Bozuklukları birincil nöronal çalışmaların mali destek Vakfı kaynaklanmaktadır.

Yazarların hiçbiri ifşa herhangi çatışmalar var.

Tüm üç canlılığı deneylerde sinyal gücü, doğrusal ve kaplama yoğunluğu ile ilişkili olduğunu bulmuşlardır. Ancak, tüm deneyler, 2-kat veya kaplama yoğunluğu 1.5 kat değişikliklere karşı eşit ölçüde hassastır. N2a hücreleri için, kızılötesi deneyler özellikle düşük kaplama yoğunluklarında, ATP deneyi daha az duyarlıdır. Kızılötesi deneyler ATP daha az duyarlı olan, ancak DRAQ5 + Safir deneyler ve α-tubulin deneyleri ki bunlar, N-asetil sistein ve yüksek ölçüde koruyucu bir etki ortaya iyi bir uyum içindedir. Orada her ik...

Biyolojik bilimlerde en yaygın canlılığı tahlil hücre sayıları içerir. Bu 2013/04/29 ve 2013/04/30 üzerinde anahtar kelime ya &quot;in vitro&quot; veya &quot;kültür&quot; ile PubMed&#39;de çıktı üst (en son) 200 yayınların analizi ile kanıtlanır. Bu yayınların, manuel hücre sayısı sayımı dahil olmak üzere% 23.5 kullanılan hücre sayımı tahlilleri, otomatik hücre sayısı görüntüleme yazılımı ile sayar ve Trypan mavi dışlama. Canlı / Ölü deney, bu yayınların% 1 kullanılmıştır. MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür) kullanılarak yayın sayısı metabolik canlılığı için tahlil% 11 idi. Edebiyat Bu anket aynı zamanda hücre sayımı tahlilleri ile birlikte böyle MTT gibi analizleri kullanılarak yayın sayısı sadece% 3.5 olduğunu göstermektedir. Hücre sayısı ile birlikte hücresel fonksiyonunun değerlendirilmesinde, tek başına bir canlılık deneyi kullanmak için eğilim hücresel i değerlendirmek için iyi bir seçim gibi görünüyor rağmenntegrity. Geriye kalan hücreler fonksiyonel ya da 1,2 kuyu içinde mevcut olmasına rağmen sağlıklı olmayabilir, çünkü kendi başına hücre sayımları yeterli değildir. Bunun tersine, ATP gibi fonksiyonel önlemler artırmak veya hücre sayısındaki paralel değişikliklerle yokluğunda azaltabilir. Hücre sayısı metabolik okumalanna ayrılması ATP ve MTT testleri tek canlılık deneyi olarak asla kullanılmamalıdır gerektiğini göstermektedir. Bu raporda, hücresel yapılar ve metabolik fonksiyonu hem de anket üç canlılığı deneyleri gelemez kendisi tarafından herhangi bir tahlil daha hücresel bütünlüğü daha kapsamlı bir görünüm için, tarif edilmektedir. Bizim deneylerinin iki 700 ve 800 nm kanallarda floresan ölçen bir enfraruj görüntüleyici gerektirir. Gürültü daha yüksek sinyal-gürültü oranı 3 yol açan, kızılötesi dalga boyu düşüktür. Kullandığımız Odyssey kamera, 4.5 günlük dinamik aralık ve 16, TRANSLATIN bir bit derinliğe sahipkızılötesi 2 16 veya 65.536 tonları g. Bu sadece her dalga boyu için renk 2 8 veya 256 tonunu tanıyor 8-bit renk görüntüleme, tezat olabilir. Böylece, 16-bit görüntüleme ince çözünürlüğe sahiptir. Bu orijinal kızılötesi genellikle görsel sunumu için yayınlanmış olan raporlarda (800 nm) ve kırmızı (700 nm), yeşil yalancı olduğu not edilmelidir. Odyssey kameralar genellikle Western blot ve In-Hücre Batılıların 4-7 hem de kullanılmaktadır. In-Cell formaldehit sabit hücreleri üzerinde Western ilgi duyulan herhangi bir protein karşı birincil antikor kullanımı ve kızıl ötesi floresan ikincil antikorlarla da etiketleyin. Bu teknik, fosforilasyon uç noktalar 6 için özellikle yararlı olduğu da bilinmektedir. Bizim In-Cell Western olarak, sitoskeletal proteinler α-tübülin ya da 800 nm kanalda nöronal mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2) için sabit hücreleri boyamak. Bu proteinler yüksek sinyal-gürültü oranı elde etmek için yeteri kadar bol miktarda bulunmaktadır. Biz de 700 yılında bizim plakaları lekeDRAQ5 leke ile ve safir leke ile sitoplazmada için çekirdekleri için nm kanalı. Sitoskeletal proteinler ve DRAQ5 + Sapphire lekeleri Hem böylece hücresel yapılarını yansıtmaktadır. Üçüncü canlılığı deneyi, metabolik fonksiyonu büyüklüğüne ve adı &quot;Hücre Titer Glo.&quot;, Bu lusiferaz bazlı tahlilde, parlaklık değerleri ATP seviyeleri doğrudan orantılıdır. ATP tahliller genel olarak canlı hücreler 8-12 ölçmek için kullanılır. Hücre başına ATP çıkış toksin tedaviler bir fonksiyonu olarak değişebilir Ancak, tahlilin adına kelime &quot;titre&quot; da dahil olmak üzere bir yanlış isim biraz ve hücre sayısı 8 ile orantılı olarak, bu nedenle her zaman değil. ATP düzeyleri de sirkadyan ritim 13 ve 14, hücre bölünmesi ve hücre farklılaşması 15 etkilenebilir. ATP metabolik sağlam bir ölçüsüdür çünkü Bununla birlikte, burada gösterilen ATP deneyi gerçekleştirmek için basit ve faydalıdırcanlılığı 16-21, başına numara hücre değilse. Batılıların bu nedenle tek başına herhangi bir deneyde daha hücresel bütünlüğün daha kapsamlı bir resmini verir In-Cell kızılötesi tamamlamak için bu tahlil kullanma.

<table><tbody><tr><td>Hücre Titresi Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Daha pahalı 10 ml miktarını satın almak yerine 100 ml miktarlarda ve aliquot satın alın. Sulandırılmış, kullanılmayan reaktifler -20 ° C'de yeniden dondurulabilir; En az 21 hafta boyunca C</td></tr><tr><td>% 18 Formalin</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>Bu fiksatifi satın almak, formaldehit tozlarının tartılmasını ve çözeltinin kaynamasını önler; böylece buharlara maruz kalma en aza indirilir</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Bunu formaldehit çözeltilerine eklemek şart değildir, ancak sabit hücrelerin görünümünü iyileştirir</td></tr><tr><td>Odyssey Bloğu</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Bu balık serumu toplu olarak satın alınabilir ve -20 ° C'de dondurulabilir; Uzun süreli kullanım için C</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>%10 Triton-X 100'lük bir stok çözeltisini steril suda 4 ° C'de saklıyoruz; C</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Monobazik</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>PBS tabletleri veya 10x PBS çözeltileri de satın alınabilir, ancak bunlar daha pahalıdır</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Yukarıya bakın</td></tr><tr><td>Sodyum Azid (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>Tozu satın almayın çünkü sodyum azit çok toksiktir. Kullanılan tüm antikorlarımızı 4 ° C'de 1x sodyum azid içinde saklıyoruz; C enkaz ile kontamine olana kadar</td></tr><tr><td>Fare anti-&alfa;-tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Bu antikor pahalıdır ancak büyük ölçüde seyreltilebilir ve oldukça spesifiktir</td></tr><tr><td>Fare anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Bu antikor pahalıdır ancak oldukça spesifiktir (Hücre İçi Batılılar için bir ön koşul)</td></tr><tr><td>800 nm Keçi anti-fare IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>Diğer şirketler ayrıca kızılötesi ikincil antikorlar satmaktadır. Yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş antikorları satın aldığınızdan emin olun ve IgG konsantrasyonlarının kaynağa göre değişebileceğini unutmayın</td></tr>. <tr><td>DRAQ5</td><td>Biyodurum</td><td>DR50200</td><td>Bu bileşik, LI-COR tarafından 1 mM'de satılıyordu</td></tr><tr><td>Safir</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminometre</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 çok etiketli sayaç</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Görüntüleyici</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı/Karıştırıcı</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

kültür hücreleri için canlılık tahliller

Viability Assays for Cells in Culture

Bir mikroskop Manual hücre sayımları hücre canlılığının değerlendirilmesinde hassas bir yoludur, ancak zaman alıcı ve bu nedenle pahalıdır. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri ekipman açısından pahalı ama daha hızlı ve daha objektif manuel hücre sayımları daha olabilir. Bu rapor, bu tür üç canlılığı tahlillerin kullanımını tarif eder. Bu tahlillerin ikisi kızılötesi ve bir parlak olan. Her iki kızılötesi tahlilleri bir 16 bit Odyssey Imager güveniyor. Bir kızılötesi deney sitosol için safir leke ile kombine çekirdekleri için DRAQ5 leke kullanır ve 700 nm kanalında görüntülenmiştir. Diğer kızılötesi deney, bir In-Cell Western, sitoskeletal proteinler (α-tubulin veya mikrotübül ilişkili protein 2) karşı antikorlar kullanır ve 800 nm kanal bunları etiketler. Üçüncü canlılık deneyi ATP için yaygın olarak kullanılan bir ışıldayan deney, ama biz maliyet tasarruf için önerilen hacminin dörtte kullanın. Bu ölçümler her doğrusaldır ve ce sayısı ile ilişkiliLLS kaplama, ancak duyarlılık değişir. Tüm deneyler üç zaman alıcı mikroskobu aşmak ve tüm kaynak örnek, bu şekilde, örnekleme hatasının azaltılması. Son olarak, bütün deneylerde kolayca kısa zaman dilimleri içinde yapılması gereken deney daha fazla sayıda izin veren, deney sonunda bir gün içinde tamamlanabilir. Ancak, hepsi hücre sayıları tedaviler, bazen özellikle hücresel ATP için bir araya geldi değil, bir varsayım sonra sinyal gücü orantılı kalması varsayımına dayanmasıdır. Hücreler artırmak veya tedavi sonrası boyutunda azalma Ayrıca, eğer, bu hücre sayısı etkilemeden sinyal gücünü etkileyebilir. Biz manuel sayıları dahil tüm canlılığı deneyleri, uyarılar bir dizi muzdarip olduğu sonucuna, ancak bilgisayarlı canlılığı deneyleri ilk yatırım değer. Her üç deneyleri kullanılarak birlikte hücresel yapısı ve fonksiyonu kapsamlı bir görünümünü verir.

Bu deneylerde oran sınırlayıcı bir faktör ATP deney süresi nispeten kısa olduğu için, kızılötesi boyama olduğunu. Kızılötesi tahlilleri için, sekiz 96-yuvalı plakalar (bkz. Şekil 1) dört plakaların her biri iki seri tarafından şaşırtıcı bir gün içinde, lekeli ve taranabilir tahmin ediyoruz. Bu tahmin, tespit bölgesinin 20 dakika varsayar, yıkama 30 dakika, yıkama 30 dakika, ardından 2 saat primer antikor inkübasyon bloke 30 dakika, yıkama 30 dakika süre ile 1 saat kuluçka ikincil antikor, 30 dakika DRAQ...

Terapötik bileşikler genellikle ilk canlılığı deneyleri ile in vitro incelenmiştir. Bir insan gözlemci tarafından kör hücre sayımları hücre sayısındaki küçük değişikliklere son derece hassas olabilir ama fonksiyonunu değerlendirmek yok. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri, burada açıklandığı gibi, objektif bir şekilde yapı ve fonksiyon hem de değerlendirebilir.

Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Bu prosedürün genel amacı, tek bir deneyin tek başına sağlayabileceğinden daha kapsamlı bir hücresel zindelik görünümü sunan birden fazla viabilite analizi gerçekleştirmektir. Bu, öncelikle metabolik fonksiyonu değerlendirmek amacıyla ekilmiş hücrelerin ATP seviyelerinin ölçülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, 800 nanometre dalga boyuna sahip kızılötesi antikorlar kullanarak alfa tübülin veya mikrotübül ilişkili protein iki gibi hücre iskeleti proteinlerini immünoboyama ile işaretlemektir.Ardından, çekirdeği ve sitoplazmayı 700 nanometrede boyamak için hücreler infrared drac five ve sapphire ile işaretlenir. Son adım, bir kızılötesi görüntüleyici üzerinde hem 700 hem de 800 nanometre dalga boylarında alfa tubulin veya map two ile drac five artı sapphire'i görüntülemektir. Nihayetinde, bu lüminesans ve kızılötesi analizler hem anatomik yapılar hem de fizyolojik fonksiyonlar hakkında bilgi sağlar.Bu tekniklerin MTT viabilite analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücresel bütünlüğün birçok yönünün hızlı ve hassas bir şekilde ölçülebilmesidir. Bu yöntemler; terapötik bileşiklerin anatomik yapıları ve metabolik fonksiyonu koruyup koruyamayacağı gibi, nörobilim ve f

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kültür hücre sayısını belirleyen kültür koşullarının standardizasyonu ve doğru kantitatif deneyler önemlidir. Bu video, hücreleri bir hemasitometre kullanarak nasıl sayılır göstermektedir.

Doku ve Hücre Sayım ve Canlılık Belirlenmesi

50 yıldan fazla üreme canlılığını değerlendirmek için clonogenic testin uygulanabilirliği için kurulmuştur. Burada yapışık hücrelere clonogenic tahlil yapmak için genel prosedür göstermektedir.

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

In vitro sistemi değiştirilmiş 3-D sulandırılmış bazal membran birçok tümör hücre hatlarının büyüme özellikleri tümör hücrelerinin metastatik ikincil site uykuda veya proliferatif davranışı ile ilişkili...

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Bu videoda, sitopatik etkilere neden olan virüslerin hayatta kalma kinetiğini incelemek için hücresel empedans tabanlı bir teknik açıklanmaktadır. Yöntem, tuzlu su ile önceden muamele edilmiş virüs ile enfekte olmuş yapışkan hücrelerin elektriksel empedansını ölçer.

Virüs Sağkalımını Değerlendirmek için Hücresel Empedans Tabanlı Sağkalım Kinetik Testi

Biz, tespit miktarının ve ligandların vasküler endotelyal büyüme faktörü ailesinin üyelerinin aktivitesini izlemek için basit bir hücre bazlı biyolojik tayini açıklamaktadır. Deney ligand ile reseptör ve çapraz bağlama bir yarı-nicel veya kantitatif bir değerlendirmesini sağlamak için bir faktör bağımlı hücre hattı içinde ilave kimerik reseptörler kullanır.

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

Genellikle kültürlü hücreler üzerinde bileşiklerin bir dizi potansiyel sitotoksisite değerlendirmek için gereklidir. Burada, 96-iyi formatında toksik bileşikler için güvenilir bir tarama stratejisi açıklar.

Düşük-Orta Throughput'ta Kültürlü Memeli Hücrelerinde Hücre Büyümesini ve SağkalımLarını Etkileyen Bileşikleri Belirleme Stratejisi

Burada, 2D kültürden çok daha iyi in vivo tümörlerin fiziko-kimyasal degradelerini taklit eden 3D kanser hücresi kürelerinin içinde canlanıyor ve ölümü değerlendirmek için birkaç basit yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, küroid modeli, kanser ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için gelişmiş çeviri ile in vivo koşullara izin verir.

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Bu protokol, hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX) genişletilmiş in vitro kültürünü mümkün kılacak yöntemleri göstermektedir. Bir adım, 3D hidrojellerde çok hücreli küme kültürlerinin genel canlılığını, canlı olmayan tek hücrelerin doğrudan çıkarılması yoluyla artırır. İkincibir adım, pdx kültürü için en iyi uygulamaları perfüzyonlu mikroakışkan bir platformda gösterir.

Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık

Bu protokol, zebra balığı embriyo (ZEM2S) ve karaciğer (ZFL) hücre hatlarında 96 kuyucuklu plakalarda sitotoksisitenin değerlendirilmesi için uyarlanmış yaygın olarak kullanılan sitotoksisite testlerini (Alamar Blue [AB], CFDA-, Nötr Kırmızı ve MTT testleri) sunar.

Zebra Balığı Hücre Hatları ile Sitotoksisite Testleri

Burada, maya örneklerinde stres sonrası sağkalımı ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Test, plazma zarı bütünlüğünü ölçmek için SYTO 9 ve propidyum iyodür (PI) olmak üzere iki floresan boya kullanır. Oksidatif stres sonrası numuneler için canlı, ölü ve hasarlı hücre fraksiyonlarının kantitatif ve tekrarlanabilir tahminlerini sağlamak için akış sitometrisi kullanır.

Maya Hücrelerinde Stres Sonrası Sağkalımı Ölçmek için Akış Sitometrisi ile Birleştirilmiş Optimize Edilmiş Bir CANLI / ÖLÜ Testi

Öğrenin, kültür hücrelerinde ATP ölçümü ve kızılötesi görüntüleme kullanarak çoklu canlılık tahlilleri yapmayı. Bu yöntem, hücresel sağlığın metabolik ve yapısal yönlerini kapsamlı şekilde değerlendirir.

Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller

Daha fazla video keşfet