Doğal Aselüler Bağırsak Matrix'in üretimi için bir Decellularization Metodoloji

Bu prosedürün genel amacı, bağırsak dokusu mühendisliği için doğal bir aselüler iskele oluşturmaktır. Bu, önce kanülasyon, bir sıçan superior mezenterik arter veya SMA ve ince bağırsağın vasküler erişim ile birlikte toplanması ile gerçekleştirilir. İkinci adımda, intraluminal döküntüler yıkanır ve intraluminal ve vasküler kanüller peristaltik bir pompaya bağlanır.

Daha sonra, ince bağırsak, dört santigrat derecede 24 saat boyunca deiyonize su ile perfüze edilir. Son adımda, ince bağırsak, oda sıcaklığında sodyum deoksi, koat ve DNA'lar ile perfüze edilir. Sonuç olarak, ince bağırsağın tamamen hücreden arındırılması, mimarisi ve bileşenleri sırasıyla histoloji ve elektron mikroskobu ile görselleştirilebilir.

Şu anda hem çocukları hem de yetişkinleri etkileyen yıkıcı bir durum olan bağırsak yetmezliği klinik sorunuyla karşı karşıyayız. Ebeveyn beslenmesi ve konvansiyonel transplantasyon tam bir tedavi sağlamaz. Aşağıdaki videoda gösterildiği gibi üç boyutlu vaskülarize bağırsak iskelesinin üretimi, bağırsak yetmezliğinin tedavisine kadar uzanır.

Bu teknikle ilgili dikkat çekici olan şey, nazik dijitalleştirme kimyasallarının kullanımının, elektron mikroskobu sonuçlarının gösterdiği gibi bağırsak mikro mimarisini korumasıdır. Ek olarak, uygarlığı takip eden hiyerarşik vasküler ağın sürdürülmesi, konakçıya yeniden bağlanabilen bir yapının tohumlanmasına izin verir. Kan temini İki tüplü bir peristaltik pompa takarak başlayın, ardından peristaltik pompanın tüplerinden maksimum hızda 15 dakika boyunca %70 etanol geçirin, ardından 15 dakika daha taze hazırlanmış PBS AA uygulayın.

Pompayı yıkadıktan sonra, ötenazi yapılmış 250 ila 350 gramlık bir spra dolly sıçanın karnını %70 etanol ile püskürtün ve silin. Daha sonra otoklavla sterilize edilmiş cerrahi aletler kullanarak, net bir cerrahi alan sağlamak için karın üzerinde bir XO kasık laparotomi insizyonu yapın, ince bağırsağı hayvanın sağ tarafına% 70 etanol püskürtülmüş bir kağıt havlu üzerine boşaltın. Dokunun dehidrasyonunu ve hücre dışı matrisin denatürasyonunu önlemek için bağırsağı P-B-S-A-A ile sürekli ıslatmaya özen gösterin.

Ardından, aorttan bağırsağa doğru 90 derecelik bir açıyla ortaya çıkan SMA'yı bulun. SMA'nın etrafına bir dikiş yerleştirin ve bir düğüm hazırlayın. SMA'ya aorttan girmek için 27 gauge kanül kullanın ve ardından damar duvarının yırtılmasını önlemek için iğneyi hızla geri çekin.

Şimdi kanülün plastik tüpünü SMA'ya ilerletin, boruyu Vicryl beş oh sütürle sabitleyin ve ardından kanülasyonu doğrulamak için 10 mililitre P-B-S-A-A enjekte edin. Daha sonra, dışkı sızıntısını önlemek için kanülü serbest bırakmak için aortu SMA'nın proksimal ve distalini kesmek için makas kullanın Kalın bağırsağı diseksiyon ederken, ileoçekal bileşkenin proksimal ucuna bir ipek beş oh sütür düğümü yerleştirin ve sigmoid kolonun distal ucuna bir tane yerleştirin. Daha sonra terminal ileum ve kolonu iki düğüm arasında kesin ve kalın bağırsağı çıkarın.

Şimdi ince bağırsağı Juno duodenal kavşakta kesin ve bağırsağı karın ile sahip olabileceği herhangi bir bağ dokusu bağlantısından kurtarın. İnce bağırsağı PBS aa içeren bir Petri kabına aktarın. Daha sonra bağırsağın proksimal bölümünü kanüle etmek için plastik bir arka pipet kullanın ve dikişlerle yerine sabitleyin.

Son olarak, pipeti 60 mililitrelik bir şırınganın yem kilidine sığacak şekilde kesin ve ardından dışkı ve kalıntıları temizlemek için bağırsak lümenini iki kez 60 mililitre P-B-S-A-A ile yıkayın Hücre çözme işlemine başlamadan önce, bağırsak lümeni ve vasküler kanüllerde kabarcık bulunmadığından emin olun. Daha sonra vasküler kanüle üç yollu bir durdurma musluğu bağlayın ve taşan çözeltiyi toplamak için Petri kabını bir kaba koyun. Ardından, ana flex LS değişken hızlı silindirli pompadan saatte 0,6 mililitre hızla deiyonize su akıtmaya başlayın.

Kabarcıkların distal uçtan çıkmasını sağlamak için dokuyu dikkatli bir şekilde kullanın. Tüm kabarcıklar kanüllerden çıkarıldıktan sonra, cihazı soğuk odaya aktarın. Ardından, hem bağırsak lümenini hem de vasküler ağacı, ilk bir saat boyunca saatte 0,6 mililitre hızında 24 saat boyunca deiyonize su ile perfüze ederek hücreden arındırma işlemine başlayın.

Tüm bağlantıların sağlam olduğundan emin olmak için cihazı düzenli olarak kontrol edin. Sızıntı minimumdur ve bağırsakta kabarcık yoktur. 24 saat sonra hücre çözme aparatını tekrar oda sıcaklığına getirin.

Bağırsağın rengi, bir emme başlığı altında açık pembeye dönüşmüş olmalıdır. 300 mililitre deiyonize suda% 4'lük bir çözelti elde etmek için yeterli sodyum deoksi kaplamayı tartın. Çözeltiyi berrak olana kadar karıştırmak için bir girdap kullanın.

Şimdi, deiyonize çözeltiyi sodyum deoksi harmanlaması ile değiştirin. Bağlantıları kontrol edin. Kabarcıkları çıkarın ve ince bağırsağı dört saat boyunca saatte 0,6 mililitre perfüze edin.

Sodyum deoksi harmanlama adımından sonra doku şeffaf hale gelir. Vasküler ağın bakımı, pompaya PBS AA eklendikten sonra da belirginleşir. Sodyum deoksi, coate ve DNA arasında herhangi bir etkileşimi önlemek için bağırsağı 30 kez PBS AA ile yıkayın.

Daha sonra dokuyu taze hazırlanmış DNA'larla, biri oda sıcaklığında saatte 0.6 mililitre hızında perfüze edin. Üç saat sonra, iskeleyi bir doku kültürü başlığına aktarın ve septik bir teknik kullanarak plakayı değiştirin. Peristaltik pompanın borusunu etanol geçirerek yeniden sterilize edin.

Hücre giderme solüsyonlarının tüm kalıntılarının giderildiğinden emin olmak için bağırsağı son bir kez P-B-S-A-A ile 30 dakika yıkayın. Son olarak, iskeleyi bir UV çapraz bağlayıcıya aktarın ve iki sterilizasyon döngüsü çalıştırın. Ardından iskeleyi P-B-S-A-A'da saklayın.

Çözeltiyi her üç günde bir değiştirmek. Başarılı bir hücreden arındırma işleminden sonra, iskele, doğal bağırsağınkine benzer makroskopik bir görünüme sahip olmalı, ancak yarı saydam duvarlara sahip olmalıdır. Makro mimarinin korunması, vasküler ağacın açıklığı ile de belirgin olmalıdır.

Boya SMA kanülünden enjekte edildiğinde, iskele boyunca eşit olarak dağılmalı ve kılcal ağaçtan ulaşmalıdır. İskele, değerlendirilebilecek bir şey olan nükleer ve sitoplazmik materyalden arındırılmış olmalıdır. Bir DNA niceleme kiti ve basit histolojik analiz kullanarak, hematin ve eoin boyama, bu görüntüde gösterildiği gibi ince bağırsak katmanlarını korurken nükleer ve sitoplazmik materyalin yokluğunu göstermelidir.

Özellikle, luminal taraftaki villus ve kıvrımların bakımı, taramalı elektron mikroskobunu takiben belirgin olmalıdır. Kollajen, elastin ve gliko Amin glikanları gibi hücre dışı matris bileşenlerinin daha fazla korunması da burada gösterildiği gibi beklenmelidir. Örneğin, Massen Tri CHRO boyama, iskeledeki sağlam bağ dokusunun gösterilmesine izin verir.

Bu videoyu izledikten sonra, doğal hücresel bağırsak iskelesinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.