Name: Doğal Aselüler Bağırsak Matrixin üretimi için bir Decellularization Metodoloji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-07T22:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin, sıçan ince bağırsağından aselüler matris üretmek için dekülerizasyon yöntemini. Bu teknik, doku mühendisliği ve bağırsak yetmezliği tedavileri için umut vadeden bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu protokolün geliştirilmesi ile yardım için Rejeneratif Tıp Wake Forest Enstitüsü teşekkür ederim. Biz Great Ormond Street Hastanesi sadaka hibe ile destek kabul, Vakıf Eugenio Litta (Cenevre, İsviçre), Tıbbi Araştırma Konseyi, İngiltere için İngiltere Cerrahlar, Sparks Çocuk Tıp Charity, İngiliz Dışişleri Bakanlığı&#39;nın Kraliyet Koleji / ABD Hücre İşbirliği Ödülü ve Mittal Araştırma Fonu Stem. Biz de Çocuk Sağlığı Enstitüsü, Çocuk Cerrahisi Anabilim Dalı için elde doku mühendisliği laboratuvar yenileme hibe için Royal Society / Wolfson Vakfı&#39;na teşekkür etmek istiyorum. PDC ve SE Great Ormond Street Hastanesi Çocuk Vakfı tarafından desteklenmektedir.

1.. Rat Bağırsak İzolasyonu <ol><li> % 1 antibiyotik / antimikotik (Sigma, UK) (PBS / AA) ile fosfat tamponlu tuzlu çözeltisi (Sigma, UK) bir 1 L çözelti hazırlayın. Iki tüp ile peristaltik pompa (Masterflex L / S değişken hız) takınız. Başka bir 15 dakika boyunca PBS / AA ve ardından en yüksek hızda 15 dakika boyunca peristaltik pompanın tüpler aracılığıyla% 70 etanol (EtOH) çalıştırın. </li><li> CO 2 inhalasyon ve (İngiltere, Hayvanlar (Scientific Procedures) Yasası 1986 altında Home Office kurallar) Yerel hayvan kurallar ve onayları doğrultusunda, boyunları kırılarak yaklaşık 250-350 g ağırlığında Sprague-Dawley sıçanları Euthanize. </li><li> Kullanmadan önce cerrahi aletler otoklavlayın. Sprey ve% 70 EtOH ile hayvanın karın silin. </li><li> Net bir cerrahi alan sağlamak için karın üzerinde bir xifo-kasık laparotomik kesi gerçekleştirin. </li><li> % 70 EtOH ile püskürtülen bir kağıt havlu üzerine hayvanın sağ tarafında ince bağırsak Eviscerate. Takhücre dışı matrisin (ECM) &#39;nin doku ve denatürasyon su kaybını önlemek için sürekli bir şekilde PBS / AA bağırsak ıslak bakım e. </li><li> Bağırsak doğru aorta 90 ° açı ile çıkan superior mezenterik arter (SMA) bulun. Aort SMA girmek ve hızlı bir şekilde kabın duvarı yırtılmasını önlemek için iğnenin geri çekilmesi hususunda bir 27 G kanül kullanın. SMA içine kanül plastik tüp ilerlemek ve sütür (vicryl 5/0) tutturun. </li><li> PBS / AA 1 ml enjekte edilerek kanülasyon onaylayın. Kanül serbest şekilde SMA aorta proksimal ve distal kesilirken yaylı makas kullanın. </li><li> Kalın bağırsak üzerinden kesme zaman dışkı sızmasını önlemek için, bir (İpek 5/0) dikiş ileocaecal birleşme proksimal ucunda düğüm ve sigmoid kolon ve uzak ucunda bir yer. Daha sonra, iki düğüm arasındaki terminal ileum ve kolon kesme ve kalın bağırsak çıkarın. </li><li> Jejuno-duodenum kavşak a da bağırsak Cutnd karın ile olabilecek herhangi bir bağ dokusu bağlantıları bağırsak ücretsiz. </li><li> PBS / AA ile bir Petri kabındaki ince bağırsak aktarın. Bir plastik Pasteur pipet (LSL Laboratuvar Sarf) ile bağırsağın proksimal bölümünü Cannulate ve dikişlerle yerine sabitleyin. Bir 60 ml şırınganın luer-lok (BD Plastipak) uyacak şekilde pipet kesin. Intestinal lümen dışkı ve enkaz kaldırmak için PBS / AA 60 ml 2x yıkayın. </li></ol> 2. Decellularization Metodoloji <ol><li> Üç yollu musluk için damar kanülü bağlayın. Bu, kullanım kolaylığı vasküler ağacın üzerine gerginlik en aza indirmek ve boru gelen kabarcıkların çıkarılmasını sağlayacaktır. </li><li> 0.6 ml / st &#39;de Masterflex L / S değişken hızlı rulo pompa ile, iyonu giderilmiş su (18.2 MQ direnç / cm) çalışan başlatın. Kabarcıklar önce bağırsak lümen musluğu ile bağlantı için bir boru içinde mevcut olduğundan emin olun. Bazı kabarcıklar aşama lümen içinde mevcut olabilir,1.9, decellularization sürecini bozabilecek. Pompanın hızını Vary ve uzak ucundan itibaren en kabarcıklar çıkış sağlamak için dikkatli bir forseps ile doku kolu. Yüksek hızlarda damar ağaca zarar olabilir çünkü bu süreç tamamlanana kadar damar kanül bağlamayın. </li><li> Decellularization aşağıdaki aşama 4 ° C&#39;de gerçekleştirilir, çünkü soğuk odaya transfer aparatı Düşük sıcaklık doku ayrışmasını en aza indirgerken hücre çıkarılmasına izin verir. Taşan çözüm toplayacak bir kapta Petri yerleştirin. 0.6 ml / saat, 24 saat boyunca bağırsak lümeni ve deiyonize su ile damar ağacı (direnç M 18.2 / cm) iki serpmek. İlk saat tüm bağlantıların sağlam olduğundan emin olmak için düzenli olarak kontrol cihazı için, kaçak minimal ve hiçbir kabarcıklar bağırsak içinde mevcut. </li><li> Iyonu giderilmiş su ile tedavinin 24 saat sonra adımlardır geri kalanı gibi soğuk oda dışında decellularization cihaz hareketOda sıcaklığında (RT) olarak gerçekleştirilmiştir. </li><li> Iyonu giderilmiş su içinde% 4 solüsyon 300 ml hazırlamak için, sodyum deoksikolat (Sigma, UK) tartılır. Bir ağız ve göz tahriş edici olduğu gibi, bir emme başlık altında sodyum deoksişolat tartılır. Çözelti berrak olana kadar bir vorteks ile karıştırın. Çözelti, en fazla 1 ay boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Herhangi bir kabarcıkları ve 0.6 4 saat ml / saatte serpmek, bağlantılarını kontrol, sodyum deoksikolata deiyonize çözüm değiştirin. </li><li> Sodyum deoksikolat ve DNase-I arasındaki etkileşimi engellemek için 30 dakika boyunca PBS / AA sodyum deoksikolat yıkama aşaması sonrasında. </li><li> Deoksiribonükleaz-I (DNase I, Sigma) tartılır ve 1 M sodyum klorür, pH 7.4 içinde bir 2.000 kU çözeltisi 250 ml hazırlar. Çözelti berrak olana kadar bir vorteks ile karıştırın. Bu çözelti kullanımdan hemen önce hazırlanmalı ve depolanamaz. </li><li> 0.6 ml / saat &#39;lık bir hızda oda sıcaklığında 3 saat boyunca DNase-I ile serpmek. </li><li> DNase I-adımından sonra, aktarmaBir doku kültürü kaputu içine iskelesi ve tabak ve araçları değiştirmek. Bu aseptik teknik kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Decellularization çözeltilerin her kalıntıları çıkarıldığından emin olmak için, 30 dakika boyunca PBS / AA ile yıkayın. Yeni bir Petri tabağına yerleştirin iskele ve bir UV çapraz bağlayıcı madde (Spectroline, ABD) ve transfer. İki sterilizasyon döngüleri çalıştırın. Her 3 günde bir% 5 PBS / AA saklamak ve çözüm değiştirin. </li></ol>

<ol><li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li>
<li>Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li>
<li>Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+transplantation+of+a+bioengineered+airway+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiov.+Surg%22%5BJournal%5D)">First human transplantation of a bioengineered airway tissue.</a> J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li>
<li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+a+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li>
<li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multicellular+Approach+Forms+a+Significant+Amount+of+Tissue-Engineered+Small+Intestine+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+optimizes+the+formation+of+tissue-engineered+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine.</a> Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).</li>
<li>Chen, M. K., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+bowel+tissue+engineering+using+small+intestinal+submucosa+as+a+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold.</a> J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).</li>
<li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+assessment+of+small+intestinal+submucosa+as+a+small+bowel+graft+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model.</a> J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).</li>
<li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+evaluation+of+regenerated+small+bowel+by+small+intestinal+submucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa.</a> J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).</li>
<li>Hori, Y., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+on+tissue+engineering+of+the+small+intestine+by+mesenchymal+stem+cell+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding.</a> J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).</li>
<li>Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+tissue-engineered+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in tissue-engineered small intestine.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).</li>
<li>Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+matrices%2C+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method%2C+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Int%22%5BJournal%5D)">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).</li>
<li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , 1-8 (2010).</li>
<li>Uygun, B. E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).</li>
<li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li>
<li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li>
<li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+lung+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).</li>
<li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li>
<li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li>
<li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu denemeyi kurarken en zor adımlar SMA kanülasyon ve kuruluş ve kısırlık bakımını içerir. Duvar yırtmadan kemirgenlerde SMA kanülü nedeniyle kabın boyutu ve konumu oldukça zor olabilir. Seçenek olarak ise, bir ameliyat dikiş ipliği SMA içine plastik kanül yönlendirilmesi, distal aort kendisinin kanül, ardından önceki SMA orijine proksimal aort etrafına yerleştirilebilir. Decellularization sırasında kötü kanül yerleştirilmesi ve yüksek akış oranları bir arada damar erişimi kaybetmenize neden olabilir. Sterilite, ince bağırsakta mevcut bakteri florasının miktarı nedeniyle önemli bir konudur. Hasat sonrası PBS / AA ile yıkanması çok önemlidir, ve dışkı veya enkaz herhangi bir işaret lumeninden kaldırılması gerekir. Kısırlık elde edilmiş ise UV sterilizasyondan sonra inkübatör içerisinde DMEM ile bir Falcon tüpüne iskeletin bir kısmını yerleştirme göstergesi olmalıdır. Durumdabakteriyel kolonizasyon, medya kendi rengi sarı kırmızı dönüm ile pH değişecek. Bu başa çıkmak için, daha fazla UV çevrimi PBS antibiyotik / antimikotik ajanın yüksek bir konsantrasyon içeren yıkama hem de tavsiye edilir. Damar ve venöz hem de erişimi olan bir iskele elde etmek için olası bir değişiklik inferior vena kava (IVC) yanı sıra, SMA kanüle olacaktır. Venöz ve damar taraftan Decellularization her üç çözelti için aralıklı olarak denenmelidir. Sürekli decellularization iki tarafta pozitif basınç alarak kılcal damarları patlayabilir. Yıllar boyunca in vitro ve in vivo 6,9,12 farklı hücre-iskelet kombinasyonları kullanılarak bağırsak TE içinde çabaları bir dizi olmuştur. Işin çoğunluğu kolajen tip I 6,7,13,22 ile kaplanmış boru şeklindeki dokuma olmayan% 95 PGA-PLGA% 5 yapı iskelesi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Intestinal ile ardından mibzerepitel organoid birimleri (OU) ve farelerin omentum içine implantasyon dönemi, daha sonra tübülerize edilebilir iç dış ve epiteli üzerinde kas kist oluştururlar. Bununla birlikte, bu iskelelerinin tasarımında gözeneklilik ve basitlik bir biyoreaktör edilen gibi bir in vitro ortamda yapay bağırsak büyük parçalarının üretimi için izin vermez. Buna ek olarak, ayrıca alıcıya bağlı olabilir bir doğal damar ağının eksikliği klinik çeviri için bu iskele kullanımını sınırlar. PGA-PLGA iskeleler olan deneylerde yanı sıra, diğer gruplar bağırsak yolunun karışıklık kopyalamazlar, her ikisi de kollajen veya SIS iskeleleri, kullandık. SIS özellikle intestinal doku mühendisliği sadece daha önce yayınlanmış bir yöntemdir ve mekanik sağlamlık sağlamak ve talebi sırasında hücre büyümesini teşvik etmek için hücresizleştirilmiş iskelelerinin yeteneğini gösteren, 150&#39;den tıbbi ortamlarda kullanılmaktadırhiçbir immünojenik tepki meydana getirmez ing. Ancak, uygun makro-ve mikro-mimarisi eksikliği, bağırsak TE amaçlar 9-11,23 için onun &#39;kullanımı kötü sonuçlara yol açmıştır. Tarif ettiğimiz decellularization metodolojisinin faydaları bağırsak kök hücre niş tarafından repopulation uygun bir ortamı temsil gibi lümen crypt-villus mimarisi gibi mikroskobik özelliklerinin korunmasını içerir. Makroskopik açıdan, hiyerarşik bir damar ağının varlığının, TE-bağırsak 21 her katmana besin ve oksijen sağlanmasını sağlayan, alıcıya eki sağlayacaktır. Dahası, örneğin kolajen, elastin ve glyocosaminoglycans gibi ECM bileşenlerin bakım mekanik özellikleri için değil, aynı zamanda, hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını yönlendirilmesi de önemli bir rolü vardır. En önemlisi, decellularization metodolojinin yeteneği geniş içine ölçeklendirilebiliraynı özellikleri muhafaza ederken r dokular TE klinik çeviri için önemli bir özelliktir. Vasküler ağ ile doğal intestinal matrisin gelişme ana bağlanabilir yapay bağırsak daha bölümlerinin oluşturulmasını sağlar.

Doku mühendisliği (TE) immünosüpresyon ve organ sıkıntısı konuları atlayarak, organ nakli için bir tedavi alternatifi sunar. TE son zamanlarda bu tür yetişkinler 3,4 ve çocuklarda 5 hem de mesane 1, üretra 2 ve trakea gibi organların değiştirilmesi ile, klinikte başarılı uygulamaları olmuştur. Bir doku mühendisliği organı Bina uygun hücreler ile bir iskele kombinasyonunu gerektirmektedir. Bir skafold doğal kaynaklı (örneğin, kolajen) kullanılarak hazırlandı ve sentetik (örneğin, poli-L-glikolik asit, PLGA) olabilir maddeler ya da doğal organ ve dokuların decellularization ile elde edilebilir. Intestinal TE için, şimdiye kadar kullanılmış olan iskele esas olarak 6-13 (poli-L-glikolik asit ve poli-laktik asit) decellularized (ince bağırsak mukoza) ya da sentetik ya da olmuştur. Bu biyomalzemeler, makro ve mikro-mimarisi hem de çok basit olandoku mühendisliği bağırsak klinik tercüme edilmesi için ise ideal olmayabilir. Bağırsak için optimal bir biyo materyal ile yardımcı olmak için lumen tarafında konağın kan gitmesi, bağırsak duvarının katmanları yansıtmak için, farklı özelliklere sahip bir katmanlı bir boru şeklinde duvar ve bir villus-kript eksenine bağlanabilir doğuştan gelen bir damar ağacı olmalıdır epitel kök hücreleri tarafından repopulation. Decellularization kendi özgün mimarisini 14 koruyarak bütün organların hücrelerini kaldırarak iskeleleri üreten bir roman yöntemdir. Bu, organ yapısını taklit değil, aynı zamanda hücre dışı matris (ECM) yardım hücre çoğalması ve farklılaşması içinde gömülü kimyasal ipuçları içeriyor sadece önceden bu yana yapı iskelesi mevcut olan tercih edilir. 2008 yılında kadavra trakea hastanın kendi hücreleri ile seribaşı, 14 decellularized ve genç bir adam sol ana bronşu yerine nakil oldu <sup&gt; 3. O zamandan beri, grup bir dizi küçük ve büyük hayvanlarda kalp 15, 16,17, karaciğer ve akciğer 18-20 için hücresizleştirilmiş iskeleler üretimini bildirmiştir. Ayrıca küçük bağırsak decellularized iskele 21 üretilmesi için aynı metodoloji adapte edilmiştir. Burada tarif edilen yöntemin amacı bu kan akımı gibi orijinal doku, hem de bağırsak lümeninde villus-kript ekseninin mikroskobik mimarisinin makroskopik özelliklerini korumak decellularized bağırsak matrisleri üretmektir. Biz bu metodoloji sonuçta decellularization verimliliğini artırmak için diğer organlar için kabul edilebilir inanıyorum.

<table><tbody><tr><td>Etanol çözeltisi, H20 içinde %70</td><td>Sigma</td><td>02877</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su tabletleri</td><td>Sigma</td><td>79382</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik Antimikotik Çözelti (100x)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Ağız ve göz tahriş edici; koruma Sodyum</td></tr><tr><td>klorür</td><td></td><td></td><td></td> kullanın</tr><tr><td>Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr></tbody></table>

doğal aselüler bağırsak matrix&#39;in üretimi için bir decellularization metodoloji

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Başarılı bir doku mühendisliği in vitro ya da in vivo olarak uygun bir hücre ile iskeleler kombinasyonunu içerir. Iskele, sentetik, doğal olarak türetilmiş ya da doku / organ türetilmiş olabilir. İkincisi decellularization adı verilen bir teknik kullanılarak elde edilir. Decellularization fiziksel, kimyasal ve enzimatik yöntemlerin bir arada içerebilir. Bu tekniğin amacı, orijinal doku makro-ve mikro-mimari muhafaza ederken, her hücresel izlerini ortadan kaldırmaktır. Bağırsak doku mühendisliği bugüne kadar yerli organın karmaşık mimarisini çoğaltmak değil nispeten basit iskeleleri kullandı. Bu çalışmanın odak noktası sıçan ince bağırsak için etkili bir decellularization tekniği tanımlamaktır. Ince bağırsağın izolasyon vasküler bağlantısının korunmasını sağlayacak şekilde tarif edilmiştir. Whil Hücreleri çıkarmak için kimyasal ve enzimatik çözümleri kombinasyonuiskele luminal açıdan villus-kript ekseni koruyucu st de belirtilmiştir. Son olarak, uygun özelliklere için üretilen iskelelerinin değerlendirilmesi tartışılmıştır.

Başarılı decellularization (Şekil 1) üzerine, skafold yerli bağırsağın benzer bir makroskopik bir görünüme sahip olmalıdır, ancak yarı saydam duvarlar (Şekil 2A) ile. Makro-mimarisinin korunması da vasküler ağacın açıklığının tarafından belirgin olmalıdır. Boya SMA kanülden enjekte edildiğinde, bu yapı iskeletinin her yerinde homojen bir şekilde dağılması ve kapiller ağaç (Şekil 2B) ulaşması gerekir. Iskele nükleer ve sitoplazmik malzeme, bir DNA miktar kiti ve basit histolojik analizi kullanılarak değerlendirilebilir şey özgür olmalıdır. Hematoksilin ve eozin boyama (H &amp; E), küçük bağırsak katmanları (Şekil 3A) muhafaza etmekte iken, nükleer ve sitoplazmik malzemesinin yokluğunu göstermelidir. Özellikle, luminal tarafta, villuslarda kript bakım tarama elektron mikroskobu (Şekil 4), aşağıdaki açık olmalıdır. Aörneğin kolajen, elastin ve glikozaminoglikanlar gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin korunması da beklenmelidir. Örneğin, skafold (Şekil 3B) Masson trikrom görüntüler sağlam bağ dokusu. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Şekil 1. . Decellularization prosedür deneysel planı Timeline; PBS / AA: antibiyotik-antimikotik, NaDeoxy ile fosfat tamponlu tuzlu su: Sodyum deoksikolatın, RT: oda sıcaklığı, DNAse-I: deoksiribonükleaz-I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> Şekil 2. İskele macroscopic özellikleri. başarılı decellularization sonra sıçan ince bağırsağın Makroskopik görünüm (A). Rosso Ponceau SMA ile boya enjeksiyon sağlam bir damar ağı (B) gösterir; SMA: superior mezenterik arter <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> Şekil 3,. . Histoloji H &amp; E (A) ve MT (B) boyama bağ doku mimarisinin korunmasında hücresel malzemeden bir olmadığını gösterir; H &amp; E: hematoksilin ve eosin, MT: Masson trikrom. Ölçek çubuğu:. 100 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın</a> . </p&gt; <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> Şekil 4. . Elektron Mikroskobu Taramalı elektron mikroskobu iskele lümen içinde korunmuş villus-kript mimarisini gösterir; Ölçek çubuğu:. 100 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın</a> .

Makalede, sıçan bağırsaktan bir hücresel olmayan matrisinin üretimi için bir yöntem anlatılmaktadır. Bağırsak iskelelerinin türetme hücre biyolojisi ve uyuşturucu testi kök, doku mühendisliği gelecekteki uygulamalar için önemlidir.

Doğal Aselüler Bağırsak Matrix&#39;in üretimi için bir Decellularization Metodoloji

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Bu prosedürün genel amacı, bağırsak doku mühendisliği için doğal bir aselüler iskele oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle bir sıçan superior mezenterik arterinin (SMA) kanüle edilmesi ve vasküler erişimle birlikte ince bağırsağın hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, intralüminal debris yıkanarak uzaklaştırılır ve intralüminal ile vasküler kanüller bir peristaltik pompaya bağlanır.Ardından, ince bağırsak dört derece santigrat sıcaklıkta 24 saat boyunca deiyonize su ile perfüze edilir. Son adımda, ince bağırsak oda sıcaklığında sodyum desoksilat ve DNaz ile perfüze edilir. Nihayetinde, ince bağırsağın tam desellülarizasyonu ile mimarisi ve bileşenleri sırasıyla histoloji ve elektron mikroskobu ile görselleştirilebilir.Günümüzde, hem çocukları hem de yetişkinleri etkileyen yıkıcı bir durum olan bağırsak yetmezliği klinik problemiyle karşı karşıyayız. Paranteral beslenme ve geleneksel transplantasyon yöntemleri tam bir tedavi sağlamamaktadır. Aşağıdaki videoda gösterilen üç boyutlu vaskülarize bağırsak iskeletinin üretimi, bağırsak yetmezliği tedavisine yönelik bir çözüm sunmaktadır.Bu tekniğin dikkat çekici yanı, hafif dijitalizasyon kimyasallarının kullanımının, elektron mikroskobu sonuçlarında görüldüğü üzere bağırsak mikro mimarisini korumasıdır. Ek olarak, sivilizasyon sonrası hiyerarşik vasküler ağın korunması, konakçıya yeniden bağlanabilen bir yapının ekilmesine olanak tanır. Kan kaynağı için, önce bir perstaltik pompayı iki tüple donatarak başlayın, ardından perstaltik pompanın tüplerinden maksimum hızda 15 dakika boyunca %70 etanol, ardından 15 dakika daha taze hazırlanmış PBS AA geçirin.Pompa spreyini duruladıktan sonra, ötanize edilmiş 250 ila 350 gramlık bir spra dolly sıçanın abdomenini %70 etanol ile silin. Ardından, otoklavda sterilize edilmiş cerrahi aletleri kullanarak, temiz bir cerrahi alan sağlamak amacıyla abdomen üzerinde XO pubik laparotomi insizyonu gerçekleştirin ve ince bağırsağı hayvanın sağ tarafındaki %70 etanol püskürtülmüş bir kağıt havlu üzerine çıkarın. Dokunundehidrasyonunu ve ekstraselüler matrisin denatürasyonunu önlemek için bağırsağı sürekli olarak P-B-S-A-A ile ıslatmaya özen gösterin.Ardından, aortadan bağırsağa doğru 90 derecelik bir açıyla çıkan SMA'yı bulun. SMA'nın etrafına bir sütür yerleştirin ve bir düğüm hazırlayın. Aortadan SMA'ya girmek için 27 gauge bir kanül kullanın ve ardından damar duvarının yırtılmasını önlemek için iğneyi hızla geri çekin.Şimdi kanülün plastik tüpünü SMA içine ilerletin, tüpü Vicryl 5-0 sütürlerle sabitleyin ve ardından kanülasyonu doğrulamak için 10 mL PBSA enjekte edin. Daha sonra, kalın bağırsak diseke edilirken dışkı sızıntısını önlemek amacıyla kanülü serbest bırakmak için aortayı SMA'nın proksimal ve distalinden makasla kesin; ileosekal bileşkenin proksimal ucuna bir adet ve sigmoid kolonun distal ucuna bir adet ipek 5-0 sütür düğümü atın. Ardından, iki düğüm arasından terminal ileum ve kolonu kesin ve kalın bağırsağı çıkarın.Şimdi ince bağırsağı Juno duodenal bileşkesinden kesin ve bağırsağı, karınla olan tüm bağ dokusu bağlantılarından kurtarın. İnce bağırsağı PBS içeren bir Petri kabına aktarın. Ardından, bağırsağın proksimal bölümünü kanüle etmek için plastik bir posterior pipet kullanın ve dikişlerle yerine sabitleyin.Son olarak, pipeti 60 mililitrelik bir şırınganın kilitli ucuna uyacak şekilde kesin ve ardından dışkı ve kalıntıları temizlemek için bağırsak lümenini 60 mililitrelik P-B-S-A-A ile iki kez yıkayın. Deselülarizasyon işlemine başlamadan önce, bağırsak lümeni ve vasküler kanüllerde hava kabarcığı olmadığından emin olun. Ardından vasküler kanüle üç yollu bir musluk bağlayın ve taşan solüsyonu toplamak için Petri kabını bir kabın içine yerleştirin. Daha sonra, master flex LS değişken hızlı rulo pompasını kullanarak 0,6 mililitre/saat hızında deiyonize su akışını başlatın.Kabarcıkların distal uçtan çıktığından emin olmak için dokuyu dikkatli bir şekilde tutun. Tüm kabarcıklar kanüllerden uzaklaştırıldıktan sonra, düzeneği soğuk odaya taşıyın. Ardından, ilk saat boyunca 0.6 mililitre/saat hızında olmak üzere, hem bağırsak lümenine hem de vasküler ağaca 24 saat boyunca sürekli deiyonize su perfüzyonu uygulayarak deselülarizasyon işlemini başlatın.Tüm bağlantıların güvenli olduğundan emin olmak için düzeneği düzenli olarak kontrol edin. Sızıntı minimum düzeyde olmalı ve bağırsak içerisinde hava kabarcığı bulunmamalıdır. 24 saat sonra, deselülarizasyon düzeneğini tekrar oda sıcaklığına getirin.Bağırsak renginin bir vakum davlumbazı altında açık pembe renge dönmüş olması gerekir. 300 mililitre deiyonize su içinde %4'lük bir çözelti hazırlamak için yeterli miktarda sodyum deoksikolat tartın. Çözelti berraklaşana kadar karıştırmak için bir vortex kullanın.Şimdi, deiyonize solüsyonu sodyum doksikolat ile değiştirin. Bağlantıları kontrol edin. Hava kabarcıklarını giderin ve ince bağırsağı dört saat boyunca saatte 0.6 milliliters hızla perfüze edin.Sodyum deoksikolat aşamasından sonra doku şeffaflaşır. Pompayla PBS AA eklendikten sonra vasküler ağın korunduğu da belirgin hale gelir. Sodyum deoksikolat ve DNA arasındaki etkileşimleri önlemek için bağırsağı 30 saniye boyunca PBS AA ile yıkayın.Ardından dokuyu, taze hazırlanmış DNA'lar ile oda sıcaklığında 0.6 milliliters per hour hızında perfüze edin. Üç saat sonra, iskeleyi bir doku kültürü davlumbazına aktarın ve aseptik bir teknik kullanarak plakayı değiştirin. Peristaltik pompanın borularını içinden etanol geçirerek yeniden sterilize edin.Deselülarizasyon solüsyonlarının tüm kalıntılarının uzaklaştırıldığından emin olmak için bağırsağı son bir kez P-B-S-A-A ile 30 dakika boyunca yıkayın. Son olarak, iskkeleyi bir UV çapraz bağlayıcıya aktarın ve iki sterilizasyon döngüsü çalıştırın. Ardından iskkeleyi P-B-S-A-A içinde saklayın.Çözeltiyi her üç günde bir değiştirin. Başarılı bir deselülarizasyon sonrası, iskele makroskobik olarak doğal bağırsağa benzer bir görünüme sahip olmalı, ancak duvarları yarı saydam olmalıdır. Makro mimarinin korunduğu, vasküler ağacın açıklığından da anlaşılmalıdır.SMA kanülü aracılığıyla boya enjekte edildiğinde, boyanın iskele boyunca eşit şekilde dağılması ve kapiler ağa ulaşması gerekir. İskele, değerlendirilebileceği üzere nükleer ve sitoplazmik materyallerden arındırılmış olmalıdır. Bir DNA miktar belirleme kiti ve basit histolojik analiz kullanılarak yapılacak hematoksilin ve eozin boyaması, bu görüntüde gösterildiği gibi ince bağırsak katmanlarını korurken nükleer ve sitoplazmik materyalin yokluğunu kanıtlamalıdır.Özellikle, taramalı elektron mikroskopi sonrası lüminal taraftaki villusların ve kriptlerin korunduğu açıkça görülmelidir. Burada gösterildiği gibi, kollajen, elastin ve glikozaminoglikanlar gibi hücre dışı matris bileşenlerinin daha fazla korunduğu da beklenmelidir. Örneğin, Masson Tri CHRO boyaması, iskafoldaki bozulmamış bağ dokusunun gösterilmesine olanak tanır.Bu videoyu izledikten sonra, doğal hücresel bağırsak iskelesinin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-decellularization-methodology-for-production-natural-acellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

dokuya özgü, hücre dışı matris (ECM) hücre fonksiyonunun önemli bir düzenleyicidir. Bu makalede, saf ECM türevli köpükler ve in vitro hücre kültürü modelleri ileri 3D uygulamaları için ya da ön-rejeneratif bioscaffolds gibi kimyasal çapraz bağlama yapılmasına gerek olmadan kültürdeki kararlı olan mikro taşıyıcıları sentezlenmesi için yöntemler tarif etmektedir.

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Bu iletişim kuralı tam decellularization insan Miyokardiyum, hücre dışı matriks bileşenlerinin koruma sırasında açıklar. Microparticles ve cytoprotective kendi kendine montaj hidrojel üretiminde hücre dışı matriks sonuçlarının daha fazla alay.

İnsan kalp dokusu hücre dışı matriks hidrojel Vitro ve In Vivo uygulamaları için kendi kendine montaj doğru işlenmesi

Burada mevcut ve bitki dokularında decellularize için kullanılan kontrast iki protokolleri: deterjan temelli bir yaklaşım ve deterjan-Alerjik bir yaklaşım. Her iki yöntem sonra doku mühendisliği uygulamaları için iskele olarak kullanılabilir hücre dışı matriks kullanılan, bitki dokuların geride.

Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem

Decellularized kıkırdak elde edilen iskele osteokondral doku yeniden oluşturmak için kılavuz kıkırdak onarım için bir iskele ve bir araç olarak kullanılabilir. Bu yazıda ayrıntılı decellularization işlemini açıklar ve bu iskele tüp bebek ayarları'nda kullanmak için öneriler sunar.

Decellularized matris kıkırdak elde edilen iskele imalatı

Bu iletişim kuralı ile yapısal doku mühendislik yapıları 3D baskı için decellularized matrisler (DM) içeren katıştırılmış polylactic asit (PLA) mikroküreler polycaprolactone (PCL) filaman imalatı açıklar.

Matrisler roman işlemi 3D baskı için Decellularized

Bu iletişim kuralı bir rejeneratif iskele implant parçası olarak preklinik değerlendirme için uygun olan yara onarım için hedeflenen tüm hücre dışı matriks elyaf üretim hedeftir. Bu iplikler fibroblastlar hollow fiber membranlar üzerinde kültür tarafından üretilen ve membranlar dağılması tarafından ayıklanır.

Hücre dışı matriks liflerinin kurban Hollow Fiber membran hücre kültürü ile üretim

Hücre dışı matriks (dECM) tasarlanmış bir yapıda hedef dokuların doğal işlevlerini yeniden özetlemek için uygun mikroçevresel ipuçları sağlayabilir. Bu makalede pankreas dokusunun desellülsizasyonu için protokoller açıklanmıştır, pankreas dokusu kaynaklı dECM bioink decm dECM değerlendirilmesi, ve 3D pankreas dokusu üretimi bir biyobaskı tekniği kullanılarak inşa eder.

3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink

Bu protokol farelerin kalbini ve akciğerlerini hücreden çıkarmayı amaçlamaktadır. Elde edilen hücre dışı matris (ECM) iskeleleri, bileşenlerinin konumunu ve topolojisini haritalamak için immünostain edilebilir ve görüntülenebilir.

Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması

Bu çalışmada, fetal fare iskelet kasının desellülarize matrislerini elde etmek için bir desellülarizasyon protokolü optimize edilmiştir. C2C12 miyoblastlar bu matrisleri kolonize edebilir, çoğalabilir ve farklılaşabilir. Bu in vitro model, kas distrofileri gibi iskelet kası hastalıkları bağlamında hücre davranışını incelemek için kullanılabilir.

Hücre Kültürü için Fetal Fare İskelet Kasından 3D Desellülarize Matrislerin Hazırlanması

Perfüzyon decellularization organ ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mikromimarisini korur tüm karaciğer iskeleleri üretmek için yeni bir tekniktir. Burada, hepatositler ile perfüzyon decellularization ve sonraki repopulation kullanarak tüm organı iskeleleri hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Fonksiyonel ve transplante karaciğer greft tekniği kullanılarak oluşturulabilir.

Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

Öğrenin, sıçan ince bağırsağından aselüler matris üretmek için dekülerizasyon yöntemini. Bu teknik, doku mühendisliği ve bağırsak yetmezliği tedavileri için umut vadeden bir yaklaşım sunar.

Doğal Aselüler Bağırsak Matrix'in üretimi için bir Decellularization Metodoloji

Daha fazla video keşfet