Name: FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Öğrenin, FDA onaylı Vero hücrelerinde rekombinant arenavirus üretimi için basit ve tekrarlanabilir bir protokol. Plazmid DNA transfeksiyonu ve immunofloresans ile virüs kurtarma yöntemini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz arenavirus ters genetik teknikleri ve plazmid geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için JCT ve LM-S laboratuvarlarında geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür. Ayrıca teknik destek için Snezhana Dimitrova teşekkür ederim. JUNV NP (SA02-BG12) yönelik monoklonal antikor BEI Kaynakları (NIAID biyosavunma ve Ortaya Çıkan Enfeksiyonlar Araştırma Kaynakları Deposu) elde edilmiştir. BYHC Kurumsal Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü Grant sayısı GM068411 tarafından desteklenmiştir. EO-R Fulbright-Conicyt (BIO 2008) ve Rochester Aşı Bursu (2012) almıştır. EO-R güncel destek Rochester Üniversitesi&#39;nde Öğretim Üyesi Yetiştirme ve Çeşitlilik için Office Çeşitlilik ve Akademik Mükemmellik için doktora sonrası Bursu tarafından sağlanmaktadır. LM-S laboratuvar araştırma NIH hibe RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, Grip Araştırma ve Gözetim Mükemmellik NIAID Merkezleri (HHSN266200700008C) tarafından finanse edilen ve birBiyosavunma Bağışıklık Modelleme (HHSN272201000055C) için Rochester Merkezi Üniversitesi. JCT laboratuvar Araştırma hibe RO1 AI047140, NIH RO1 AI077719 ve RO1 AI079665 tarafından desteklenmiştir.

1. Arenavirus Kurtarma Transfeksiyon Bizim kurtarma sistemi nükleoprotein (NP) ve RNA-bağımlı RNA polimeraz (L), RNA kopyalamasının ve arenavirus genomunun gen ekspresyonu için gerekli olan viral Trans-etkili faktör kodlayan polimeraz II proteini ifade plazmid hem de kullanımı dayalı 7, 19, ve hücresel S RNA polimeraz I (pol I), ve L, antigenome RNA türlerinin 7 ile hücre içi sentez, doğrudan sahip plazmid. Bizim çalışmalarımız sırasında bir promotör ve terminatör sıçangil dizileri (Şekil 2), insan polimeraz kullanan pCAGGs proteini tavuk β-aktin promoteri ve polyadenylanation (PA) sinyal dizileri kullanan ekspresyon plazmidi, ve insan pol I plazmit kullanmak . S ve L RNA segmenti HPOL-I ile transkripsiyonu genomik RNA segmenti üzerine üretimi için izin vermek için bir antigenomik yönde HPOL-I plazmid içine klonlanır. Vahşi-ty kurtarma içinPE rekombinant LCMV (rLCMV) ve içten # 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP ve her bir virüs, insan L kendi poli-I S ve L RNA segmenti (Şekil 3) ile birlikte ko-transfekte edilmiştir. Rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) ve 1. (# 1 r3Candid) Candid nesil benzer bir protokol izledi ama S segment iki farklı pol-I S plazmid, her kodlama farklı bir muhabir gen bölündü: biri, NP açık okuma çerçevesi (ORF) yeşil floresan proteini (GFP) raportör geni (HPOL-I S GFP / GP) ve bir diğerinde ise, viral glikoprotein öncü (GPC) ORF Gaussia lusiferaz (Gluc) raportör geni ile değiştirilir ile değiştirildi (HPOL-I S NP / Gluc). Protokolünün bir şematik gösterimi Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. Aşağıdaki transfeksiyon, enfeksiyon protokolü 6 kuyulu plakalar için kurulmuştur. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) karışımı: OptiMEM medya 250 ul hazırlayın ve, bağlıüzerinde virüs kurtarma, 10 - transfeksiyon başına LPF2000 12 mg (1 ug / ml) (Tablo 1). DNA mikrogram başına 2.5 mikrogram LPF2000 bir oranı tavsiye edilir. Oda sıcaklığında 10 dakika - 5 inkübe edin. Bununla birlikte, ayrı bir mikrosantrifüj tüpü (adım 1.2) elde edildi ve plazmidin transfeksiyon karışımı hazırlandı. </li><li> Plazmid DNA transfeksiyon karışımı: Her virüs kurtarma için önerilen miktarda (bkz. Tablo 1) kullanarak mikrosantrifüj tüp plazmid transfeksiyon kokteyl hazırlayın. OptiMEM ile 50 ul son hacim getirin. </li><li> OptiMEM-LPF2000 plazmid-DNA karışımı: plazmid DNA transfeksiyon karışımı (adım 1.2) içine OptiMEM-LPF2000 karışımı (adım 1.1) 250 ul ekle. Oda sıcaklığında 30 dak - 20 bu karışım inkübe edin. Bu arada hazırlamak ve transfeksiyon reaksiyon başına 1 x 10 6 Vero hücreleri saymak. Vero hücreleri süspansiyon içinde transfekte edilir. </li><li> Vero hücreleri hazırlanması: Vero CelLs 100 mm çanağı kültürlenmiştir. Başlamadan önce, 37 ° C ile 1x PBS, DMEM,% 10 FBS,% 1 PS medya ve tripsin-EDTA karışımı getirmek <ol><li> 1x 5 ml PBS ile iki kez, hücreler yıkayın. </li><li> Tripsin-EDTA 1 ml hücre Trypsinize ve hücreler çıkartılma (yaklaşık 5 dakika) kadar bekleyin. Nazik belki tam olarak yemekler hücreleri ayırmak için gerekli kılavuz çekme. </li><li> Dikkatli bir şekilde, bir 15 ml santrifüj tüpüne DMEM% 10 FBS% 1 PS 10 ml hücre süspansiyon haline getirin. </li><li> Bir santrifüj içinde 1000 rpm&#39;de 5 dakika için hücreler santrifüjleyin. </li><li> DMEM% 10 FBS,% 1 PS 10 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve bir hemasitometre kullanılarak hücre sayımı, 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır. 1 x 10 transfeksiyon başına 6 Vero hücreleri en iyi sonuçları vermiştir 0,5 - olduğu gözlenmiştir. </li></ol></li><li> LPF2000/DNA ve hücrelerin karışımı: 20 ardından - 30 dakika, oda sıcaklığında inkübasyon (adım 1.3), Vero hücreleri, 1 ml (1 x 10 6) (Basamak 1.4) eklemekOda sıcaklığında 5 dakika boyunca OptiMEM-LPF2000 plazmid-DNA karışımı ve inkübe. </li><li> 6 kuyulu tabak içine Tohum LPF2000/DNA-cell karışımı: 6-kuyulu plakanın kuyularına DNA LPF2000-Vero karışımı (adım 1.5) ekleyin. Yavaşça 6-iyi plaka sallamak ve 37 inkübatör transfeksiyon inkübe gecede izin ° C ve% 5 CO 2. </li><li> Transfeksiyon orta değiştirin: Yaklaşık 16-24 saat sonrası transfeksiyon, transfeksiyon ortamı çıkarın enfeksiyon medya 2 ml ekleyin ve ek 48 saat için transfekte hücreleri inkübe. </li><li> Hücre geçiş: enfeksiyon ortamı içinde 48 saat inkübasyondan sonra, doku kültür yüzey (ASR) kaldırmak ve 100 mm tabak içine transfekte hücrelere geçerler. Transfekte edilmiş hücrelerin virüs parçacıkları üretmek için ilave inkübasyon gerekir, çünkü ASR nadiren bulaşıcı bir virüs içerir. Hücre geçişi için: <ol><li> 1x 2 ml PBS ile iki kez, hücreler yıkayın. </li><li> Hücreler w Trypsinize<html> ith 0.5 tripsin-EDTA ml ve hücreleri ayırmak kadar bekleyin. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde DMEM% 10 FBS% 1 PS 1 ml süspansiyon hücreleri. </li><li> 5000 rpm&#39;de 5 dakika, 4 ° C bir mikrosantrifüj içinde için hücreler santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle enfeksiyon ortamı, 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 100 mm tabak için hücreleri aktarın. 8 mL, virüs için konsantre hücre kurutma hem de önlenmesi için yeterli bir hacme kadar, bulaşıcı medya ile, plaka toplam hacmi kadar getir. </li></ol></li><li> Yavaşça 37, 100 mm tabak sallamak ve inkübatör Vero hücreleri ile inkübasyon devam ° C ile 5% 72 saat boyunca CO2. </li><li> TCS toplanması: 72 saat inkübasyondan sonra, 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne TCS toplamak. Bir santrifüj içinde 2500 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje edilerek hücre artıkları çıkarın. Bulaşıcı arenavirus TCS bulunan, bu nedenle hücre enkaz pelet kaldırmak ve -80 TCS saklamak ° C </li></ol>Rekombinant Arenavirus Kurtarma le &quot;&gt; 2. Onay RLCMV ve rCandid 1. başarılı bir kurtarma tespiti bir odak oluşturan birim (FFU) immünofloresan testi (IFA) ile elde edilir. Vahşi tip virüs kurtarma için biz viral NP için spesifik antikorların kullanımı. R3LCMV ve r3Candid # 1, bu şekilde floresan mikroskobu (GFP) ve / ya da lüminesans (Gluc) ile antikorların gerek kalmadan tespit ve viral titrasyon sağlayan, iki haberci genlerin (GFP ve Gluc) kodlar. <ol><li> Yabani tip rekombinan arenavirus kurtarma tekrarlayın: titrasyon bir gün önce, iki kez PBS ile yıkayın trypsinize Vero hücreleri ve 80 ulaşmak için 96 oyuklu plaka hazırlanması -% 90 izdiham sonraki gün (4 x 10 4 hücre / çukur). Yavaşça hücre üniformalı dağılımı elde etmek için elle tabak sallayın. Kültür hücreleri, gecede, 37 ° C inkübatör% 5 CO 2 ile. Enfeksiyon devam etmeden önce, bir tek tabaka onaylamak için mikroskop altında hücrelerin kontrol edin: <ol><li> Seri olarak seyreltilmiş (10 kat seyreltme) virüs içeren TCS OptiMEM içinde 100 mm çanağı (adım 1.10) &#39;de transfekte edilmiş hücreler geri kazanılır. </li><li> Numaralı seribaşı Vero hücrelerinde bulunan ortamı çıkarın 1x PBS 50 ul ile iki kez yıkayın, ve seri seyreltilmiş virüs (adım 2.1) 50 ul hücreleri enfekte. 37 1.5 saat hücreleri enfekte ° C ve% 5 CO2. </li><li> Enfeksiyondan sonra, virüs inokulum kaldırmak 100 enfeksiyon medya ul / iyi ekleyin ve 16 hücreleri inkübe - 18 saat. Viral yeniden enfeksiyon viral titreleri aşırı tahmininde neden olabilecek, 18 saat inkübasyondan sonra oluşabilir. </li><li> 16 - 18 saat sonrası enfeksiyon, her kuyudan TCS çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, 1 x PBS içinde sulandırılmış% 4 formaldehit ile hücreleri gidermek. </li><li> Daha sonra, sabitleme çözeltisi kaldırmak ve hücre geçirgenliği ile% 0.1 Triton X-100, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, 1 x PBS içinde seyreltilmiştir. </li><li> Permeabilization çözüm aspire, daha sonra hücreleri 3 kez wi yıkayıninci 1x PBS. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS 1x (çözelti engelleme) içinde% 2.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile hücrelerin bloke edin. Seçenek olarak ise, hücreler, 4 ° C&#39;de gece boyunca bloke edilir ve antikor inkübasyon ertesi gün ile devam edilebilir. </li><li> Bununla birlikte, birincil antikor hazırlanması. Çözümü engelleme LCMV-ve içten # 1 spesifik primer antikorlar seyreltilir ve daha sonra 3,500 rpm&#39;de 15 dakika boyunca / bloke etme çözeltisi antikor santrifüj. BEI Kaynaklar (1:500 seyreltme) ikinci monoklonal anti-NP LCMV antikor klon 1.1.3 (1:30 seyreltme) 16 ve monoklonal anti-NP JUNV antikor SA02-BG12 rLCMV algılama ve rCandid # 1 için kullanılabilir sırasıyla. </li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, bloke etme çözeltisi aspire ve hücrelere birincil antikor 50 ul ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe ° C </li><li> Bu zamanda, çözelti engelleme ikincil antikor azaltır ve daha sonra 3,500 rpm&#39;de 15 dakika boyunca antikor / bloke etme çözeltisi santrifüj. Poliprimer monoklonal antikorların tespiti için klonal tavşan anti-fare IgG ikincil antikor FITC Şekil 5&#39;te görülen görüntüler elde etmek için kullanılmıştır. </li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, birincil antikor aspire 1X PBS ile 3 defa yıkanır ve 37 C&#39;de 30 dakika boyunca, ikincil antikor ekleyin ° C </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, ikinci antikor ve aspire 1x 3 kez PBS ile yıkayın. Hücreler her iki ml (FFU / ml) başına birim oluşturan odak sayarak viral kurtarma ve titrasyon başarısını belirlemek için floresan mikroskobu kullanarak şimdi dikkat edilmesi hazırız. </li></ol></li><li> r3LCMV ve 1. r3Candid viral kurtarma: Bu virüsler iki muhabiri gen ifade yana, kendi GFP ifade veya TCS olarak Gluc ifade algılamak için floresan mikroskobu ile izlenebilir kurtarır. Kurtarma da TCS içinde Gluc ifade ile teyit edilebilir. Trisegmented virüs titre etmek için, 2.1.4 adımları 2.1 izleyin, ancak hücreleri, B gerekmezE çünkü GFP ifade başarılı bir viral kurtarma belirlemek için sabit. Virüs titrasyonu FFU / ml sayılması ile tespit edilir. Gluc ifade, TCS gelen Gluc ifade tarafından başarılı viral kurtarma belirlemek için bir Gluc tahlil kiti (Biolux Gaussia Lusiferaz Testi kiti, New England Biolabs) kullanılarak ölçülebilir. Bu amaçla: <ol><li> Bir 96-gözenekli beyaz plaka (düz tabanlı mikrotitre plakaları, Fisher Scientific) içine pipet TCS 100 ul. </li><li> Luminometre (Lumicount, Packard Biosciences) ayarlayın. </li><li> Her örnek için 100 ul Gluc Deneyi çözeltisi (imalatçı tarafından tavsiye edilen) ve luminometre ile Gluc raportör gen ölçer - 50 ekleyin. Negatif bir kontrol olarak, vahşi tip virüs enfekte olan hücrelerden TCS Gluc ifade ölçüldü. </li></ol></li></ol> 3. Doku kültür yüzer geçişi Viral kurtarma transfeksiyon verimliliği bağlıdır. Vero hücrelerinde gösterilmiştirdiğer hücre hatları 14 daha düşük transfeksiyon verimliliği olması. TCS virüs titreleri düşük ise, virüs amplifiye etmek için 72 saat boyunca 0.01 (LCMV) veya 0.1 (1. İçten) &#39;lik bir enfeksiyon çokluğu (İB), taze Vero hücreleri enfekte edebilir.

<ol><li>Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+determinant+of+attenuation+in+mice+of+the+Candid1+vaccine+for+Argentine+hemorrhagic+fever+is+located+in+the+G2+glycoprotein+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain.</a> Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).</li>
<li>Barton, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+choriomeningitis+virus%3A+a+neglected+central+nervous+system+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+an+official+publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen.</a> Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197(1996).</li>
<li>Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchmeier%2C+MJ+%22Fields%27+Virology%22">Fields' Virology</a>. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827(2007).</li>
<li>Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arenavirus+reverse+genetics%3A+new+approaches+for+the+investigation+of+arenavirus+biology+and+development+of+antiviral+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies.</a> Virology. 411, 416-425 (2011).</li>
<li>Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+lymphocytic+choriomeningitis+viruses+with+trisegmented+genomes+stably+expressing+two+additional+genes+of+interest%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).</li>
<li>Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+by+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).</li>
<li>Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+an+arenavirus+entirely+from+RNA+polymerase+I%2FII-driven+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).</li>
<li>Gunther, S., Lenz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lassa+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+clinical+laboratory+sciences%22%5BJournal%5D)">Lassa virus.</a> Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).</li>
<li>Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+case+definitions+for+Argentine+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).</li>
<li>Isaacson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+hemorrhagic+fever+hazards+for+travelers+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).</li>
<li>Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+analysis+of+the+replication+complex+of+Old+World+arenaviruses+reveals+two+nucleoprotein+sites+involved+in+L+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function.</a> Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).</li>
<li>Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NP+and+L+proteins+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29+are+sufficient+for+efficient+transcription+and+replication+of+LCMV+genomic+RNA+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs.</a> Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).</li>
<li>Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+choriomeningitis+virus%3A+an+underdiagnosed+cause+of+congenital+chorioretinitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis.</a> American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).</li>
<li>Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+canine+RNA+polymerase+I-driven+reverse+genetics+for+influenza+A+virus%3A+its+application+for+H5N1+vaccine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production.</a> Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).</li>
<li>Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).</li>
<li>Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+single-cycle+infectious+lymphocytic+choriomeningitis+virus+to+study+hemorrhagic+fever+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses.</a> Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).</li>
<li>Rojek, J. M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+by+human+pathogenic+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell entry by human pathogenic arenaviruses.</a> Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).</li>
<li>Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+mechanisms+of+cell+entry+by+human-pathogenic+Old+World+and+New+World+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses.</a> Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).</li>
<li>Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+prototypic+Arenavirus+LCMV+entirely+from+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid.</a> Virology. 350, 370-380 (2006).</li>
</ol>

Plazmid tabanlı ters genetik teknikler kullanılarak rekombinant arenaviruses üretimi arenavirus biyoloji birçok farklı yönleriyle araştırılması için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım haline gelmiştir. Burada arenavirus yaparak mevcut sistem için çok önemli bir gelişmeyi belgelemek diğer bulaşıcı hastalıklara karşı arenaviruses ve aşı vektörler karşı FDA onaylı aşı adayların potansiyel üretimi için izin, Vero hücrelerinde kurtarır. Ilgili deneysel prosedürleri iyi kurulmuş genel olarak ve...

Arenaviruses Arenaviridae ailesine ait bir bisegmented, negatif dallı RNA genomu 3 zarflı virüslerdir. Arenavirus genomu iki ayrı segmentleri viral 3 bir ambisense şekilde dört protein kodlar. Büyük (L) segmenti RNA-bağımlı RNA polimeraz (L) ve virüs tomurcuklanan temel itici güç olarak hizmet veren küçük HALKA (Gerçekten İlginç Yeni Gen) parmak protein (Z) kodlar. Küçük (S) kademeli bir viral nükleoprotein (NP) ve yüzey glikoprotein (GP) (Şekil 1) kodlar. Arenaviridae ailesinin bazı üyeleri insanlarda 3 ölümcül kanamalı ateşi (HF) sorumludur. Ilke endişeleri yatan hastalarda 8, 9 yüksek mortalite neden olduğu bilinmektedir Lassa virüsü (LASV) ve Junín virüsü (JUNV) vardır. Bu virüsler sırasıyla Batı Afrika ve kırsal Arjantin, endemik olmasına rağmen,artan seyahat 10 nedeniyle endemik olmayan bölgelere LASV ve JUNV ithalatı artan endişeler vardır. Normal insanlarda ciddi hastalığı ile ilişkili olmasa da, ayrıca, prototipik arenavirus lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) immün sistemi baskılanmış hastalarda 6, 15 ölümcül enfeksiyon vakası olduğu gibi bir ihmal patojen olarak kabul edilir ve konjenital doğum kusurları ve spontan düşükler için sorumludur hamile kadınlar 2, 13. Şu anda herhangi bir ABD arenaviruses ve tedavi karşı aşı sadece kısmen etkilidir ve genellikle önemli yan etkileri ile ilişkili nükleosit analoğu ribavirin ile sınırlıdır FDA tarafından onaylanmıştır. Plazmid tabanlı ters genetik 4 ve rekombinant arenaviruses 7, 19 nesil tanıtımı büyük ölçüde arenavirus araştırma alanında gelişmiş var. Şu anda, kemirgen hücreleri (BHK-21 gibi) homo için kullanılırS ve L bölümlerinin başlangıç ​​transkripsiyonunu yönlendiren türe özgü murin RNA polimeraz I (pol I) promotöre bağlı yeniden birleştirici arenaviruses arasında tirme. BHK-21 hücreleri Bununla birlikte virüs kurtarma potansiyel bir aşı adayı olarak tohum arenaviruses rekombinant üretimi için onaylanmış bir yöntem değildir. Burada prototipik Eski Dünya (OW) LCMV ve Yeni Dünya (KB) Vero hücrelerinde JUNV Candid içerisinde 1. gerginlik etkin kurtarma için insan pol-I organizatörü kullanımını belgeledi. Benzer bir metodoloji kullanarak, rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) ve Candid 1. (r3Candid # 1) iki farklı S RNA segmentlerinde 5 olarak kodlanmış iki ek yabancı genleri içeren arenaviruses oluşturulur. Bu yeni sistem son derece tekrarlanabilir ve basit bir protokol takip ama hemen potansiyel aşı veya aşı vektör tohum olarak rekombinant arenaviruses üretimi uygulanabilir değil.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Gereç ve yöntemler</td></tr><tr><td colspan="4"> Hücre hatları Vero E6 (Afrika yeşil maymunu böbrek epitel hücreleri) 37 &°C; DMEM'de %5 CO2 %10 FBS içeren C inkübatörü %1 PS. Hücreler Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan (ATCC, katalog numarası CRL-1586) temin edilebilir. <güçlü>Plazmitler </güçlü>Hpol-I L hariç tüm plazmitler 37 °C'de yetiştirilebilir; C, 16-18 saat boyunca. Hpol-I L kültürlerinin 30 ° C'de yetiştirilmesini tavsiye ederiz; 24 saat boyunca C. Plazmitler, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak bir plazmid maksi kiti (EZNA Fastfilter Plazmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) kullanılarak hazırlanır ve -20 ° C'de saklanır. Saflaştırılmış DNA plazmidinin konsantrasyonu, 260 nm'de spektrofotometri ile belirlenir ve saflık 260:280 nm oranı kullanılarak tahmin edilir. 1.8-2.0 260:280 nm oranlarına sahip preparatlar virüs kurtarma amaçları için uygun kabul edilir. Ek olarak, plazmit konsantrasyonu ve saflığı agaroz jel elektroforezi ile doğrulanmalıdır. Viruss rLCMV (Armstrong 53b) ve rCandid#1'i kurtarmak için açıklanan protokol, biyogüvenlik seviyesi (BSL) 2 koşulları altında yürütülebilir. TCS ve hücreler dahil olmak üzere kontamine materyaller atılmadan önce sterilize edilmelidir. Diğer arenavirüsün kurtarılması daha yüksek BSL tesisleri gerektirebilir, bu nedenle uygun güvenlik/güvenlik önlemlerine uyulmalıdır. Doku kültürü ortamı ve solüsyonları DMEM %10 FBS %1 PS:</güçlü> 445 ml Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyeri (DMEM), 50 ml Fetal Sığır Serumu (FBS) ve 5 ml 100X Penisilin / Streptomisin (PS). 4 ° C'de saklayın. Bu ortam, Vero hücrelerinin bakımı için kullanılacaktır. <güçlü>Enfeksiyöz Ortam: </güçlü> 2'ye 1 OptiMEM ve DMEM karışımı %10 FBS %1 PS. 4 °C'de saklayın. Bu ortam viral enfeksiyonlar sırasında kullanılacaktır. < güçlü>10X Fosfat tamponlu salin (PBS): < / güçlü> 80 g NaCl, 2 g KCl, 11.5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4. 1 litreye kadar ddH2O ekleyin. PH'ı 7.3'e ayarlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın. <güçlü>1X PBS: < / güçlü> 10X PBS 1:10'u ddH2O ile seyreltin. Otoklav ile sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın. <güçlü>2.5 BSA</güçlü>: 97.5 ml 1X PBS'de 2.5 g BSA. 4 ° C'de saklayın. Bu, IFA için bir engelleme çözümü olarak kullanılır. </td></tr></tbody></table>

fda onaylı vero hücrelerinde aşı geliştirme için bir araya getiren arenavirus üretimi

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Arenavirus ters genetik geliştirilmesi ve uygulanması arenavirus alanında 4 önemli bir atılım temsil eder. Genomları içinde önceden belirlenmiş mutasyonlar ile rekombinant bulaşıcı arenaviruses oluşturmak için yeteneği ile birlikte hücre tabanlı arenavirus Minigenom sistemlerinin kullanılması arenavirus yaşam döngüsünün farklı adımlar viral belirleyici katkısı araştırılması, hem de virüs-konak kolaylaştırmıştır etkileşimleri ve arenavirus patogenezi 1, 3, 11 mekanizmaları. Buna ek olarak, trisegmented arenaviruses geliştirilmesi ve böylece arenavirus bazlı aşı vektörü uygulamaları 5 olasılığını açılması, ilgi ek yabancı genleri ifade etmek için arenavirus genomunun kullanımına izin verdi. Aynı şekilde, ifade muhabiri genlerin yeteneğine sahip tek döngüsü bulaşıcı arenaviruses geliştirilmesi highl ilgili araştırma güvenliğini artırmak için yeni bir deneysel araç sağlary patojenik insan arenaviruses 16. Plazmid tabanlı ters genetik teknikler kullanılarak rekombinant arenaviruses üretimi bugüne kadar Gıda ve İlaç İdaresi geliştirme (FDA) lisanslı aşı veya aşı vektörleri için bazı engeller teşkil 7,19 kemirgen hücre hatlarının kullanımı, güvendi. Bu engeli aşmak için, FDA onaylı Vero hücrelerinde rekombinant arenaviruses etkin bir şekilde nesil burada açıklamak.

Bir rekombinant yabani tip arenavirus başarılı kurtarma IFA (Şekil 5) kullanılarak viral antijen varlığı ile teyit edilecektir. Trisegmented rekombinant virüsler ile ilgili olarak, başarılı virüs kurtarma floresan mikroskobu (Şekil 6A), GFP ifade gözlemleyerek değerlendirilebilir. Başarılı kurtarma daha Gluc ifade (Şekil 6B) değerlendirerek teyit edilecektir. Yabani tip ve trisegmented arenavirus başarılı bir kurtarma gösteren Örnek sonuçlar, yukarıda belirtilen protoko...

Klonlanmış cDNAs, gibi genetik tersine adlandırılan bir yaklaşım, gelen rekombinant arenaviruses kurtarma araştırmacılar arenavirus biyolojisi birçok farklı yönlerine, spesifik viral gen ürünlerinin rolü, hem de onların farklı özel etki ve kalıntılarının katkısını araştırmak için izin verir . Benzer şekilde, insan patojen arenaviruses mücadele etmek için etkili ve güvenli aşıların üretimi için yeni olanaklar sağlar aşı geliştirilmesi için FDA onaylı hücre çizgileri (Vero) bölgesindeki genetik teknikleri ters.

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Bu prosedürün genel amacı, potansiyel aşı veya aşı vektörü tohum geliştirme için FDA onaylı Vero hücrelerinde rekombinant arena virüslerinin üretilmesi için basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokol göstermektir. Bu, önce plazmit DNA transfeksiyon karışımının dikkatlice hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, Vero hücrelerini plazmit DNA transfeksiyon karışımı ile transfekte etmektir.Daha sonra, transfekte edilmiş hücreleri 100 milimetrelik tabaklara büyütmek gerekir. Sonuç olarak, son adım, vahşi tip virüs veya bi floresan mikroskobu kullanılarak immünofloresan ve tris segmentli virüs kullanılarak GIA lusiferaz ekspresyonu ile başarılı bir virüs kurtarmayı doğrulamaktır. Bu protokol, aşıların geliştirilmesi için FDA tarafından onaylanan Vero hücrelerinde böbrek virüsleri oluşturur.Potansiyel aşı tohumunun üretilmesine ek olarak, rapor edilen gen eksprese eden üç segmentli virüs, viral tespit için ikincil tahlillere ihtiyaç duymadan kafa verim ekranlarında VIR'lere karşı antivirallerin tanımlanması için de uygulanabilir. İlk olarak, 250 mikrolitre optimum besiyeri hazırlayın ve virüse bağlı olarak, oda sıcaklığında beş ila 10 dakika boyunca inkübe edilen transfeksi

generation-recombinant-arenavirus-for-vaccine-development-fda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) vektörleri için giderek daha değerli hale...

Rekombinant Adeno ilişkili Viral Vektörlerin Üretimi ve Titering

Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100'den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.

Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Biz, moleküler DNA aile karıştırma yoluyla sentetik Adeno ilişkili viral (AAV) gen tedavisi vektörleri mühendisi ve gelişmeye temel tekniği göstermek. Ayrıca, biz seçimi ve kültür veya farelerde hedef hücreler üzerinde gelişmiş özellikleri ile bireysel kimerik capsids analizi için genel kurallar ve temsili örnekler sunuyor.

DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

Video, soğuğa uyarlanmış rekombinant influenza virüsleri oluşturmak için bir yöntem gösteriyor. İnsan hücrelerinin çift yönlü plazmitlerle transfekte edilmesini, ardından daha sıcak koşullarda azaltılmış replikasyon ile karakterize edilen aşı üretimine uygun virüsler elde etmek için daha düşük sıcaklıkta inkübasyonun inkübasyonunu içerir.

Aşılar için Rekombinant Canlı Zayıflatılmış İnfluenza Virüslerinin Üretilmesi

Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA'sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus yaygın bir vektör platform olarak kuş hastalıkların bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için kullanılır. Bu makalede bir entegre NHEJ-CRISPR/Cas9 ve Cre-Lox sistemi kullanılarak rekombinant galiba yüksek değerli hedef yönlendirdik aşı üretimi için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar.

Rekombinant kuş Herpesvirus vektörleri ile CRISPR/Cas9 üreten gen düzenleme

Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.

Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor

Bu konak aralığı seçimi ve rekombinant virüslerin görsel kimlik kullanarak "scarless" rekombinant vaccinia virüsler oluşturmak için bir yöntemdir.

Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil

Bu protokolde AAV2 vektörü, süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-yeşil floresan protein (GFP) veya terapötik gen ve BV-AAV2-rep-cap enfekte Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) böcek hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla üretilmektedir. AAV parçacıkları deterjan kullanılarak hücrelerden salınır, netleştirilir, benzeşim kolonu kromatografisi ile saflaştırılır ve teğetsel akış filtrasyonu ile konsantre edilir.

Baculovirus-Insect Hücre Kültürü Sistemi Kullanılarak Adeno-İlişkili Virüsün (AAV)2 Vektörün Üretimi ve Saflaştırılması için Süreç Geliştirme

Burada, yüksek titreli rekombinant Newcastle hastalığı virüsünün üretimi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak &gt; 6 × 109 plak oluşturan birim / mL verir ve in vivo hayvan çalışmaları için uygun virüs miktarlarını sağlar. İn vivo güvenliği sağlamak için ek kalite kontrol testleri açıklanmaktadır.

Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Gen terapisi alanı gelişmeye devam ettikçe, bu zorlukların üstesinden gelebilecek yenilikçi yöntemlere artan bir ihtiyaç var. Burada, in vivo çalışmalar için kalite standartlarını karşılayan, bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran benzersiz bir yöntem sunulmaktadır.

Bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek titre, yüksek kaliteli adeno-ilişkili virüs vektörleri oluşturmak için kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış bir prosedür

Öğrenin, FDA onaylı Vero hücrelerinde rekombinant arenavirus üretimi için basit ve tekrarlanabilir bir protokol. Plazmid DNA transfeksiyonu ve immunofloresans ile virüs kurtarma yöntemini keşfedin.

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

Daha fazla video keşfet