Antikor boyamasında C. Elegans "Freeze-Cracking kullanma"

Bu prosedürün genel amacı, C zarafeti üzerinde antikor boyama yapmaktır. Bunu yapmak için, nematodlar durulanır, slaytlar üzerine yayılır ve daha sonra kuru buz üzerinde dondurulan iki yapışkan slayt arasında dikkatlice sıkıştırılır. Daha sonra, slaytlar nematodları kırmak için ayrılır ve hemen fiksatif içine yerleştirilir.

Nematodlar daha sonra standart antikor kullanılarak boyanır Floresan mikroskobu ile yapılan boyama teknikleri analizi, yarı sağlam nematodların başarılı antikor boyamasını ortaya koymaktadır. Bu tekniğin, bozulmamış nematodların tespit edilmesi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, numunenin kimyasal olarak işlenmesini en aza indirmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edeceklerdir çünkü slaytları ve nematodları hazırlamak biraz zordur.

Prosedür ben ve laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan RTO Basu olacak Boyama için nematod plakaları hazırlamak için, damıtılmış su ve bir cam pipet durulanması kullanarak soğutmak için kuru buz üzerine düz bir metal parçası yerleştirerek başlayın. Solucanlar, bakterilerle birlikte 60 milimetrelik bir NGM plakasında 1.5 mililitrelik bir mikro füj tüpüne büyütülür. Solucanlar senkronize edilebilir veya karıştırılabilir, ancak aynı cam pipeti kullanarak otofloresansı artıracak, kırılması zor veya aç bırakılmış solucanlar olan birçok çeyizli plakaları kullanmaktan kaçının.

Solucanları bakterilerden arındırmak için damıtılmış suyla üç ila dört kez durulayın. Daha sonra çoğunlukla yetişkinleri toplamak için, üç ila beş dakika bankta oturmalarına izin verin. Solucanlar tüpün dibine yerleştikten sonra, suyun çoğunu tüpten çıkarın, solucanların yaklaşık iki katı kadar su bırakın, ancak toplam hacim en az 25 mikrolitre

Polilisin slaytlarının buzlu tarafını silinmez mürekkeple etiketleyin ve slaytları kuru buz etiketi yukarı bakacak şekilde kabın yanındaki tezgahın üzerine yerleştirin. Bu, alt slayt görevi görecektir. Eşit sayıda temiz polilisin içermeyen işlem yaptırın.

En iyi slaytlar mevcut. Daha sonra, yaklaşık 25 mikrolitre solucanı suya batırın, alt yapışma slaytına pipetleyin ve pipet ucunun yan tarafını kullanarak solucanları slaydın ortasına yayın. 30 saniye ila iki dakika arasında yerleşmelerine izin verin.

Solucanların uçları slayta temas ettikçe yapışacaktır. Bu prosedürün en zor yönü, sonraki birkaç adımı uygularken solucanların çok fazla bozulmasını önlemektir. Bunu yapmanın en iyi yolu sabırlı olmak, her şeyin hazır olması ve ellerinizin güzel ve sağlam olması için çok fazla kafein içmemektir.

Alt sürgüyü bir elinizle tutarak, buzlu parçalar dışındaki tüm parçalar üst üste gelecek şekilde üst sürgüyü üzerine yerleştirin. Sıvı, slaytları hafifçe ayrı tutmalıdır, böylece solucanlar hala bir miktar hareketliliğe sahip olacaktır. Sürgünün birbiri üzerinde kaymasına izin vermeyin, bu da solucanları bükecektir.

Daha sonra, her iki elin başparmaklarını ve işaret parmaklarını kullanarak, üst slayta dikkatlice düz bir şekilde bastırın, Doğru miktarda basınçla, en büyük hermafroditlerden birkaçı sürgünün kenarında yırtılacaktır. Yetişkinlerin ve larvaların çoğu her slaytla temas edecek, ancak slaytların kaymasına izin vermeden hemen ve dikkatli bir şekilde bozulmadan kalacak olsa da, onları kuru buz üzerindeki metal parçasının üzerine koyun. Bir dakika içinde slaytlar donmuş görünecektir, ancak tamamen donduklarından emin olmak için beş dakika orada tutun.

Slaytlar artık sabitleme için hazırdır. Devam etmiyorsanız, slaytları etiketli bir kutuda eksi 80 santigrat derecede birkaç gün saklayın. Yapıldıktan sonra bir hafta içinde kullanılmalıdırlar.

Slaytları uzun süreli depolamadan sonra kullanmayın. Bireysel nematodlar, daha önce gösterilene benzer bir yöntemle slaytlar üzerinde de hazırlanabilir. Soğutmak için kuru buzun üzerine düz bir metal parçası yerleştirin.

Daha sonra, tek tek nematodları bakterilerden arındırmak için bir NGM plakasındaki bir damla suya aktarmak için bir solucan penası kullanın. Otofloresanı azaltmak için nematodlar iyi beslenmelidir. Mümkünse, solucan bakteri içermeyene kadar gerektiğinde yeni su lekelerine aktarımı tekrarlayın.

Ardından, üst ve alt slaytları daha önce olduğu gibi hazırlayın. Ardından, mikroskopla gözlem yaparken alt slaydın polilisin ile muamele edilmiş alanına beş ila 10 mikrolitrelik bir damla su damlatın. Bir damla suya 20 adede kadar solucan aktarmak için bir solucan penası kullanın.

Solucanlar, yapışkan slayt yüzeyine dokunmak için batmalıdır. Ardından üst sürgüyü daha önce olduğu gibi yerleştirin, ancak kızakların hemen kaymamasını sağlarken sıkıştırmayın. Slaytları metalin üzerine kuru buz üzerine yerleştirin.

Beş ila 30 dakika kuru buz üzerinde tutun ve hemen fiksasyona devam edin. Bu slaytlar daha sonra kullanılmak üzere saklanamaz. Solucanları hafifçe sabitlemek için, 10 dakika boyunca soğutmak için buz üzerine sabitleme solüsyonları içeren boyama kavanozları yerleştirerek başlayın.

İhtiyaç duyulan çözeltiler %100 metanol, %100 aseton ve fosfat tamponlu tuzlu dur. Kuru buzdan bir çift alt ve üst sürgü alın, hızlıca çevirin ve alt sürgüyü hemen iki dakika buz gibi soğuk metanole batırın, üst sürgüyü atın. Ardından, slaytları metanolden buz gibi soğuk asetona dört dakika boyunca aktarın.

Slaytlarda çok fazla solucan varsa, çoğu iyi hazırlanmış slaytlarda bile fiksatifte düşecektir. Tek solucan slaytları uygun şekilde hazırlanmışsa, solucanlar yapışkan kalmalıdır. Son olarak, sabitleyiciyi durulamak için slaytları PBS ile kavanoza batırın.

Slaytlar artık formaldehit veya glutaraldehit kullanarak sert bir sabitleme yapmak için boyamaya hazırdır. Reaktif dereceli formaldehit veya glutaraldehit çözeltisini PBS'de %0,5 ila 4'lük bir nihai konsantrasyona seyrelterek başlayınAlikotlar eksi 20 ila eksi 30 derecede saklanabilir ve gerektiğinde çözülebilir. Unutmayın, formaldehit ve glutaraldehit her zaman çok zehirlidir, bu nedenle eldiven giymeniz ve çeker ocakta çalışıyor olmanız gerekir.

Kuru buzdan bir çift alt ve üst sürgü alın ve bunları hemen hızlıca çevirin. Solucanların bulunduğu alt sürgüyü kapaklı düz bir tabağa yerleştirin, üst sürgüyü hemen atın, hemen 200 mikrolitre sabitleyiciyi sürgü alanının ortasına pipetleyin. Solucanlarla, fiksatif kısmen yerinde donar, daha sonra slaydın daha geniş bir bölgesini kaplamak için erir.

Solucanlar hemen ve dikkatli bir şekilde tamamen fiksatif ile kaplanmamışsa, bir mikro pipet kullanarak daha fazla fiksatif ekleyin. Sabitleyicinin sürgünün kenarından akmasına izin vermeyin. Nemli tutmak için tabağa katlanmış ıslak tüy bırakmayan mendiller ekleyin.

Mendillerin slaytlara temas etmesine izin vermeyin. Daha sonra çanağı bir kapakla örtün ve sabitleme tamamlandıktan sonra oda sıcaklığında 10 dakika ila gece boyunca bırakın, fiksatifi gevşek solucanlarla dikkatlice 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir pipet kullanın. Ardından slaydı PBS içeren bir boyama kavanozuna batırın.

Solucanları içeren tüpü pelet yapmak için 30 saniye boyunca yüksek hızda döndürün. Solucanları PBS ile iki kez durulayın. Ardından, slayttaki solucanlara paralel olarak boyamaya devam edin.

Antikor boyama protokolü, slaytlar üzerindeki herhangi bir doku için standart protokollere benzer ve ekteki belgede ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Boyamadan sonra, slaytları PBS'ye aktarın ve montaja hazır olana kadar dört santigrat derecede 12 saate kadar orada kalmalarına izin verin. Slaytları monte etmek için, PBS'den bir slayt çıkarın.

Arka tarafı kurutmak için tüy bırakmayan bir mendil kullanın ve ardından kısa bir süre için hızlı bir şekilde bir kağıt havluya koyun. Solucanların üzerine yaklaşık 20 mikrolitre montaj ortamı yerleştirin, böylece ortam ve PBS'nin yaklaşık olarak eşit parçaları olur. Slaytta.

İki çözümü karıştırmak için slaydı yavaşça eğin. Dikkat: montaj ortamı zehirlidir. Buzlu kenarı tutarak.

Slaytı, çözelti buzlanmanın yakınında toplanacak şekilde eğin. Ardından, ağartmayı artıran ve görüntülemeyi bozan hava kabarcıklarını en aza indirmek için 24 x 60 milimetrelik bir kapak kaymasının bir kenarını solüsyonun üzerine yerleştirin. Kapak kızağını yavaşça indirin.

Kabarcıklar oluşursa, kapak kaymasının kenarını yavaşça kaldırın. Sonra solucanların üzerinden kaymadan, tekrar indirin. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için gerekirse daha fazla PBS ekleyin.

Tüy bırakmayan bir mendil kullanarak, kapak kaymasının kenarlarını sıkıştırın ve kenarı kurutmak için dikkatlice kaydırın. Sürgünün kenarı, kapak kızağının kenarının her yerinde görünür olmalı ve çok ıslak olmamalıdır. Kapak fişini kapatın ve kenara iki ila üç kat oje sürün.

Sürgü iyice kapatıldıktan ve kuruduktan sonra, kapak sürgüsünü ve sürgünün arkasını temizleyin ve bir sürgü tutucu yuvasına yerleştirin. Mühürlü slaytlar, daha uzun süreler boyunca dört santigrat derecede günlerce veya eksi 20 santigrat derecede haftalarca tutulabilir. DNA'nın zarif boyanması ve çoğu yeşil boyanın solması, özellikle herhangi bir yağa daldırma lensi kullandıktan sonra, kapak fişini gerektiği gibi daha fazla oje ile yeniden kapatın.

Aşağıdaki temsili görüntüler, bir hücre biyolojisi laboratuvarı dersinde lisans öğrencilerinin ilk antikor boyama girişimleri sırasında yapılan slaytlar kullanılarak toplanmıştır. Bu görüntü, uygun şekilde sıkıştırılmış, çatlamış ve metanol aseton ile hafifçe sabitlenmiş iki yetişkin hermafroditin kafalarının bir örneğini göstermektedir. Birden fazla antikor ve boya ile etiketlendiler.

Bu durumda, neredeyse tüm solucan antikorlar tarafından erişilebilir. Burada boyama, DPI boyama ile gösterildiği gibi çekirdeklerin konumu, solucanın hangi kısımlarının sağlam olduğunu gösterir. Solucanlar formaldehit gibi daha sert bir fiksatife maruz kaldığında, solucanın morfolojisi bozulabilir.

Bu, bu görüntülerde kırmızı ile gösterilen kasların dalgalı bir görünümü olarak görülebilir. Daha sert fiksatiflerin kullanımıyla ilişkili bir diğer yaygın sorun, belirli dokuların düzensiz fiksasyonu veya penetrasyonudur. Bu, kırmızı ile gösterilen kasın solucanın sadece bir kısmında lekelendiği yerde görülebilir.

Burada, mavi ile gösterilen DNA da dahil olmak üzere diğer boyamaların varlığı, vücudun en azından bir kısmının mevcut olduğunu gösterir. Ortaya çıkan kısmi boyama paterni uygulama ile kolayca tanımlanabilir, böylece herhangi bir tek solucan düzensiz boyama gösterse bile tüm boyama dağılımı belirlenebilir. Herhangi bir sabitleme koşulu kullanılarak donarak çatlama ile karşılaşılan yaygın sorunlar burada gösterilmektedir.

En yaygın sorun, iki sürgünün bağıl hareketi nedeniyle numunenin bükülmesidir. Sıkıştırma sırasında Burada, lekeli dokuların morfolojisi, solucanın gövdesinin farenksin hemen arkasında büküldüğünü gösterir. Bu görüntü aynı zamanda, slaytı kaplayan polilisin antikoruna yapışan antikor nedeniyle arka plan lekelenmesi ile ilgili sorunu da göstermektedir.

Bu, konfokal mikroskop kullanılarak önlenebilir. Uygulamada bile, birçok bireysel solucanın kaybolacağını veya burada gösterilen sorunlardan bazılarını göstereceğini unutmayın. Bir kez ustalaştıktan sonra, hazırlık ve sabitleme bir saat içinde yapılabilir ve boyama bir günde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, herhangi bir antikor ve doku için boyamayı optimize etmek için çeşitli fiksasyon yöntemleri gerçekleştirilebilir.