Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

Bu prosedürün genel amacı, solunum patlaması tepkisini ölçmek için floresan kullanmaktır. İlk olarak, zebra balığı embriyolarını 96 oyuklu bir plakanın kuyularına yükleyin. Daha sonra bir floresan substrat ekleyin ve solunum patlamasını kimyasal bir madde ile aktive edin.

Daha sonra bir florimetre kullanarak bağıl floresansı ölçün. Sonuç olarak, floresan solunum patlaması potansiyelini göstermek için kullanılır. Bu yöntem, deneysel manipülasyonların genel doğuştan gelen bağışıklık sağlığını nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir.

Burada, zebra balığı embriyolarının solunum patlaması hakkında bilgi sağlamak için kullanıyoruz, ancak yetişkin zebra balığı, böbrek hücreleri ve diğer balık türlerinden hücre preparatları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Embriyoları derin Petri kaplarında, istenen gelişim aşamasına kadar yumurta suyunda 28 santigrat derecede büyütün. Ölü embriyoları günlük olarak çıkarın.

Eski yumurta suyunu dikkatlice boşaltın ve her gün yeni yumurta suyu ile doldurun. Deney gününde, folyo sarılı 1.7 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde azaltılmış bir floresein çalışma çözeltisi yapın. Ayrıca mililitre PMA nihai konsantrasyonu başına 20 mikrogramlık bir çalışma çözeltisi hazırlayın.

Daha sonra, ekteki metinde açıklandığı gibi 15 mililitrelik konik tüplerde her bir dozaj çözeltisinden beş mililitre yapın. Dozlama çözeltilerini önce buz üzerinde tutun, Mikroplaka okuyucuyu açın ve floresanı ölçmek için ışık kaynağını ısıtın. Uyarma ve emisyon dalga boylarını, optik konum hassasiyetini detaylandıran bir program ayarlayın ve ayrıca beş saniyelik bir sallama adımı ekleyin.

Kamıştan önce, kaplanmış embriyolarla deneysel tabak malzemelerini düzenleyin. Siyah 96 kuyulu bir mikroplaka, bir P 200 pipetleyici ve floresein içeren reaktiflerle bir buz kovasının uçları. Çok kanallı bir P 200 pipetleyici, iki steril rezervuar, alüminyum folyo ve makas.

Şimdi embriyoların veya böbreklerin açıklıktan sığabileceği şekilde bir pipet ucu kesin. Bir P 200 pipetleyiciyi 100 mikrolitreye ayarlayın ve bir embriyoyu yumurta suyu ile birlikte siyah 96 kuyulu bir mikroplakanın istediğiniz kadar kuyucuğuna aktarın. Şimdi dozaj çözeltisini çok kanallı bir P 200 pipetleyici ile steril 25 mililitrelik bir hazneye dökün.

96'nın bir sütununa 100 mikrolitre H 2D CFDA dozaj çözeltisi ekleyin. Kontrol embriyo örneklerinin yarısı ve deneysel olarak manipüle edilmiş embriyo örneklerinin yarısı için mikroplaka tekrarı. PMA içeren dozaj çözeltisini 25 mililitrelik yeni bir steril rezervuara dökün.

Daha sonra bu dozaj çözeltisini 96 Kuyulu mikroplakanın kalan sütunlarına ayırın. Mikroplakayı alüminyum folyo ile örtün ve yaklaşık 20 saniye boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. 150 RPM'de, okunmadığı zaman Mikroplakayı 28 santigrat derecede inkübe edin.

PMA eklendikten sonra mikroplakayı okuyun. İstenen zaman aralığı için birkaç dakikada bir ölçüm yapmaya devam edin veya folyo sarılı mikroplakayı sabit bir zaman noktasına kadar 28 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, embriyoları kuyulardan alın, embriyoları kurumsal hayvan bakımı ve kullanım protokolüne göre ötenazi yapın.

Ayrıca, mikroplakayı ve diğer tek kullanımlık malzemeleri Biyolojik Tehlikeli atık boyacısına atın. Floresanı karşılaştırmak istediğiniz zaman noktasına karar verin. Ortalama indüklenmemiş kontrol grubunun floresan değerini, bireysel PMA kaynaklı kontrol grubunun grip floresan değerlerinden çıkarın.

Bunu PMA'lı ve PMA'sız deney grubu için tekrarlayın. Daha sonra bu normalleştirilmiş floresan değerlerini sütunlarda, kontrol artı PMA grubunda ve deneysel artı PMA grubunda saklayın. Ardından, kontrol artı PMA grubunun ve deneysel artı PMA grubunun normalleştirilmiş floresan değerleri için ortalamaları ve standart sapmaları hesaplayın.

İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için eşleşmemiş bir T-testi kullanarak normalleştirilmiş floresan değerlerini karşılaştırın. Şimdi, kontrol artı PMA grubunun ve deneysel artı PMA grubunun ortalamalarını, uygun standart sapmaları yansıtan hata çubuklarıyla grafiklendirin, grafikte ve şekil açıklamasında anlamlılık seviyesini kaydedin. Bu deney, AB kökenli yabani tip zebra balığı embriyolarında döllenmeden 48 saat ve 72 saat sonra solunum patlaması tepkisini karşılaştırır.

PMA ile indüklenen gruplarda PMA eklendikten dört saat sonra ham floresan ölçüldü. Ham floresan değerleri 72 HPF popülasyonunda daha yüksekti. Hesaplanan ortalamalarla belirtildiği gibi, floresan değerleri, arka plan floresan seviyelerindeki değişkenliği hesaba katmak için normalleştirilmiştir.

Bu solunum patlaması testinin sonuçları, 72 HPF zebra balığı embriyosunun önemli ölçüde daha fazla reaktif oksijen türü üretebildiğini ve bu nedenle PMA ile indüksiyondan sonra 48 HPF embriyosundan daha sağlam bir solunum patlaması tepkisi oluşturduğunu ortaya koydu. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı embriyolarının solunum patlaması potansiyelini ölçmek için floresanın nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. PMA tozu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle PMA tozunu tartarken yüz maskesi takmak gibi önlemler alın.