Çoklu Tümör Belirteçleri Hedefleme için Polymalic Asit bazlı Nano Biopolymers: Kişiselleştirilmiş Tıp için Bir Fırsat?

Genel amaç, özellikle kanser için, bir kişinin hastalığının genetik yapısına dayalı olarak kişiselleştirilmiş ilaçlar sentezlemek üzere evrensel bir protokole açık, nan ölçekli bir platform oluşturmaktır. Öncelikle, frum polycephalum mikroorganizmasından poli malik asit üretin ve saflaştırın; ardından saflaştırılmış PMLA'yı yan zincirindeki karboksilik gruplardan kimyasal olarak aktive edin. Aktive edilmiş grupların sübstitüsyonu ile küçük fonksiyonel grupları ve MEA bağlayıcısını ekleyin ve kullanılmayan aktive grupları hidroliz yoluyla tekrar karboksilik gruplara dönüştürün.

Ardından, antikorlar ve antisense molekülleri; ara parça (spacer), MEA ve kapakçığın sülfhidro grupları aracılığıyla ekleyin. Reaksiyon tamamlandığında, PDP ile tepkimeye girmemiş ara parçayı kullanarak öncü bileşiğin kompozisyonunu ve işlevini test edin. Nano ilaç sonuçları, agresif insan tümörleri taşıyan fareler gibi bir hayvan modelinden elde edilir.

HER2 pozitif meme kanserinde, tedavinin etkinliği ve aynı zamanda tedavinin istenmeyen yan etkiler olmadan gerçekleşip gerçekleşmediği belirlenebilir. Biyoproduksiyonun, halka açılma polimerizasyonu gibi mevcut sentetik yöntemlere göre temel avantajı, biyopolimerin tam optik saflığını koruması ve yan ürünlerle kontamine olmamasıdır. Bu PolyPhen nano ilaç ailesi, spesifik hedefleme temelinde herhangi bir hücre tipini hedefleyebilir ve protein ekspresyonunu düzenleyebilir.

Genel olarak, PHE nano ilaçlarla yapılan kanser tedavisi, başta birincil beyin ve meme kanserleri olmak üzere birçok hayvan modelinde oldukça etkilidir. İlk olarak, glioblastoma'ya özgü laming sentezini isof formlarında engelleme fikrini geliştirdik ve daha sonra tümör büyümesini önlemek için HER2 ve üçlü negatif meme kanseri proteinlerinin hedeflenmesini ve inhibisyonunu kanıtladık. Bu tekniğin uygulamaları, optik ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak kanserin teşhisine kadar uzanmaktadır.

Polinano ilaçlar, kanser tedavisi için ilaç iletimine dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca bulaşıcı hastalıklar, ağrı kesme ve nörolojik bozukluklar gibi diğer patolojik durumlara da uygulanabilir. Spiral uçlu burgudan bir başlangıç plazmodyum kültürü büyüttükten sonra, 100 mililitre bazal kültür ortamına inoküle edin ve kültürü 25 degrees Celsius'da büyütün.

Sıcaklığı sabitlenmiş inkübatör, ışık dışında bırakılarak belirli miktarda yer çekimiyle paketlenmiş mikroplazma medyası üretir. 10 litrelik bir biyoreaktör kabında sporülasyonu önlemek için, 80 gram kalsiyum karbonatı sekiz litre bazal medyumda çözün, ardından paketlenmiş mikroplazma medyasını monte edilmiş reaksiyon kabına aktarın ve biyoprosesi 75 saat için ayarlayın. 25 °C'de, dakikada 10 litre filtrelenmiş hava akışında ve bir segment karıştırıcı ile 150 RPM karıştırma hızında gerçekleştirin.

Kültür sıvısının pH değeri 4.8'e ulaştığında, poli maleik asit üretimini ölçmek için kültürü durdurun. Şimdi sıvıyı 17 °C'ye soğutun, hücrelerin yerçekimi ile çökelmesini bekleyin ve kültür süpernatantını reaktörden uzaklaştırın. pH değerini 7.5'e ayarlayın.

Şimdi süpernatantı, 5 °C'de 20 millimolar tris hidroklorür pH 7.5 ile dengelenmiş 1.5 litrelik bir DEAE selüloz kolondan alttan başlayarak pompalayın. Ardından, 0.3 molar sodyum klorür içeren üç kolon hacmi yıkama tamponunu kolonun altından üstüne doğru geçirin ve PMLA'yı 0.7 molar sodyum klorür varlığında elüye edin. Elüye edilen PMLA fraksiyonunu 0.1 molar kalsiyum klorüre ayarlayın ve PMLA kalsiyumu çöktürmek için %80 buz gibi soğuk etanol ekleyin; ardından PMLA kalsiyumu Sephadex G 25 ve su kullanarak boyut fraksiyone edin.

Son olarak, her fraksiyonu kehribar renkli bir ışık kolonundan geçirin ve akışı hemen sıvı azot içerisinde polimalik asit ile dondurun ve -20 °C'de saklamadan önce liyofilize edin. PMLA'nın karboksil gruplarını aktive etmek için; 1 mL susuz aseton içinde 1 mmol P-M-L-A-H ile 2 mL dimetilformamid içinde her birinden 1 mmol olan hidroksi CIN aide ve cylo heyl carbo ide'yi karıştırın; 20 °C'de üç saat boyunca karıştırmanın ardından, 1 mL DMF içinde 0,05 mmol metil Pega mean ve ardından 0,05 mmol trietilamin ekleyin.

Ardından, 0.4 milimol lösin etil esteri damla damla ekleyin ve bir saat sonra, ince tabaka kromatografisinde negatif hyn yanıtı ile reaksiyonun tamamlanıp tamamlanmadığını kontrol edin. Benzer şekilde 0.1 milimol iki me kapto, bir etilamin ve 0.5 milimol TEA ekleyin. Kalan NHS esterini, fosfat tamponlu salin ile spontan hidroliz yoluyla uzaklaştırın.

PD 10 kolonu üzerinden tuz giderme işlemi yapın ve beyaz bir toz elde etmek için liyofilize edin; bu ön konjugatı -20 °C'de kuru olarak saklayın. Ardından, pH 5.5'te 100 millimolar sodyum fosfat içeren 150 millimolar sodyum klorürün 4,5 mililitresinde çözünmüş 30 miligram antikor ekleyin. Disülfit bağlarını beş millimolar tris, iki karboksetil fosfin hidroklorür ile indirgeyin ve PD 10 kolonu üzerinden saflaştırın.

Şimdi IDE PEG IDE'yi, pH 6.3'te olan yukarıdaki tamponun iki mililitresinde çözün. Redükte edilmiş antikoru ekleyin ve 20 °C'de bir saat boyunca karıştırın. 30 kilodalton dışlama sınırına sahip AVEVA spin 20 ile 2,5 mililitreye konsantre edin ve ardından cidex G 75 ile saflaştırın.

Şimdi ürünü SEC HPLC ile doğrulayın. Miktarı 280 nanometrede ölçün ve diğer dalga boylarında safsızlıkların olmadığını onaylayın. Ardından, 50 miligram ön konjugatı, 5 mililitre pH 6.3 tampon çözeltisi içerisinde 200 MLE antikor konjugatlı PEG IDE ile karıştırın.

Sülfhidril konsantrasyonunu 2 mM olarak ayarlayın ve 20 °C'de üç saat inkübe edin. %98 verim elde etmek için, 3' amino antisens oligonükleotidi bir hacim SPDP ile çözündürün, A-O-N-P-D-P'yi metanol içerisinde Sephadex LH 20 üzerinden saflaştırın, ardından metanolü buharlaştırın, ürünü suda çözün ve liyofilize edin; şimdi aktive edilmiş AO'ların 800 nM miktarını, MEA SH ile önceden konjuge edilmiş antikor PEG ile gece boyunca inkübe edin. Disülfür değişim reaksiyonu sonlandırıldığında, floresan boya bloğunu dahil edin, fazla sülfhidriilleri PDP ile bloke edin ve Sephadex G 75 üzerinden saflaştırın.

Final poli malik asit bazlı nanoilacı -20 °C'de saklayın. Üretim sırasında poli maleik asit içeriğini tahmin etmek için şu şekilde ilerleyin: 320 µL numuneye 160 µL %10 hidroksil amonyum klorür ve 160 µL %10 sodyum hidroksit ekleyin. 10 ila 15 dakika sonra, 160 µL %5 ferrik klorür çözeltisi ile karıştırın ve 540 nm'de koyu mor renk oluşumunu gözlemleyin. Ardından, nanoilacı kapalı bir ampul kullanarak 110 °C'de, 2 M hidroklorik asit içerisinde gece boyunca hidrolize edin ve ters faz kromatografisi ile maleik asit tayinini gerçekleştirin.

Maleik asit standartları ile desteklenmiş numuneler kullanın. Şimdi nano ilacı 100 millimolar dihidroetilen glikol ile parçalayın ve morfo antisense oligonükleotidleri, morfo-ON standartlarına karşı kantitatif ters faz HPLC ile ölçün. Parçalanmış nano ilacı kullanarak, Maleik PEG içeriğini belirlemek amacıyla bir protein analiz kiti ile antikor içeriğini ölçün.

Öncelikle amonyum OT tiyosiyanat ile reaksiyona sokun, ardından kloroform ile ekstraksiyon yapın ve 510 nanometrede absorbansı ölçün. Antikor aktivitesini ve ko-ligasyonu, kuyuk başına beş mikrolitre nano ilaç ve plaka kaplama antijeni olarak kuyuk başına 0.5 mikrogram her iki maddeyi kullanarak Eliza ile test edin. Son olarak, maleik asit ile karşılaştırarak antisense oligonükleotid, EG ve antikor için elde edilen yüzdeyi hesaplayın.

İlaç tasarımıyla hedeflenen yüzde ile karşılaştırın. Nanoilaca yönelik bu bimodal stratejik yaklaşım, HER2 sinyal yolunu inhibe etmek için Herceptin'i ve HER2 reseptör transkripsiyonunu engellemek için HER2'ye özgü bir siRNA'yı kullanır; antikorlar, tümör damarının endotelyal TFR'si aracılığıyla transitozu kolaylaştırır. Nano konjugat platformu olan poli maleik asit, kültürle büyütülmüş mikroplazmalar tarafından üretilmiş ve saflaştırılmıştır; PMLA karboksil gruplarının aktivasyonu, ön konjugat iskeletinin sentezini kolaylaştırmıştır.

Ve son olarak, öncü nano konjugat. Eli SA analizleri, nano ilaç sentezi boyunca aktif monoklonal antikorların korunduğunu göstermiştir. Her iki antikor da aynı polimer platform üzerinde toplandığından, nano ilacın hücresel alımı floresan konfokal mikroskopi ile takip edilmiştir.

Sıfır ve üç saatteki üst üste bindirilmiş görüntüler, işaretlenmiş endozomlarla birlikte analiz edilmiştir. Kolokalizasyon için Pearson korelasyon katsayıları, nano ilacın endozomlardan sitoplazmaya salındığını ve sitoplazmada glutatyon bağımlı disülfür kopmasıyla nano ilaçtan bir ON'nin ayrıldığını göstermektedir. In vitro olarak, öncü nano ilaç, HER2 aşırı eksprese eden hücre hattında büyümeyi en etkili şekilde anlamlı düzeyde inhibe etmiştir.

BT 474, HER2 aşırı eksprese eden insan meme kanseri taşıyan farelerde yapılan in vivo deneyler, Herceptin içeren öncü nanolacın %95'ten fazla büyüme inhibisyonu sağladığını göstermiştir. HER2 spesifik antikor ile yapılan ex vivo Western blotting, hem HER2 sentezinin hem de fosforilasyonunun inhibisyonuna işaret etmiştir; PARP'ın AKT kesimi ise apoptozu belirlemiştir. İlaç tedavisine yanıt olarak gerçekleşen tümör regresyonu, tümörün küçülmesiyle ve histolojik inceleme ile tümör hücrelerinin azalmasıyla kanıtlanmıştır.

Artık, yan etkiler olmadan etkili kişiselleştirilmiş tedavi sağlamak için biyouyumlu bir nano platformun nasıl kullanılacağı ile kontrol kompozisyonuna ve doğrulanmış fonksiyonel aktivitelere sahip bir nano ilacın nasıl elde edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bir kez ustalaşıldığında, bu sensörler geliştirildikten sonra yüksek tekrarlanabilirlikle uygulanabilir. Antisense oligonükleotidlerin hedeflenmiş iletimi için poli akrilik asit nano platformunu kullanan bu teknik, kişiselleştirilmiş nano tıp alanındaki araştırmacıların, kişiselleştirilmiş genetik analizlerle tanımlanan spesifik moleküler tümör markerlarını hedefleyen tümör tedavilerini keşfetmelerinin önünü açmaktadır. Farmakolojik olarak aktif ajanlar ve hücreler son derece tehlikeli olabilir.

Bu prosedür uygulanırken maske ve eldiven takmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.