Name: Bir Insanlaşmış Fare Modeli epidermal melanin ve Karşı Koruma yanığı Farmakolojik İndüksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Öğrenin, forskolin ile farelerde epidermal melanin indüksiyonu ve UV duyarlılığı ölçümü yöntemini. Bu çalışma, farmakolojik olarak koruyucu pigmentasyonun geliştirilmesini göstermektedir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, teknik yardım için Malinda SPRY teşekkür etmek istiyorum. Biz de mevcut ve geçmiş finansman kaynaklarını kabul: Ulusal Kanser Enstitüsü (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), Wendy Will Vaka Kanser Araştırma Fonu, Markey Kanseri Vakfı, Çocuk Miracle Ağ ve Jennifer ve David Dickens Melanom Araştırma Vakfı.

1.. Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) Fabrikası&#39;nın bir Ham Kök Özü Topikal İdaresi Forskolin hazırlanması <ol><li> Kemirgen deneyler için Protokoller hayvanların bakımı ve kullanımında etik davranış için yönergeleri takip ve Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (Protokol # 00768M2004) tarafından onaylanmıştır. Kök ekstresi% 70 etanol, standart bir dermatolojik bazında,% 30 propilen glikol içinde% 40 ağırlık / hacim olarak oluşur. </li><li> Ham forskolin kök ekstresi 200 g tartılır ve bir şişeye aktarın. % 40&#39;lık 500 ml (w / v) solüsyonu, aracın tüm miktar (% 70 etanol,% 30 propilen glikol) en değil eklenerek ham forskolin kök ekstresi, 200 g yapmak ve tekrar süspansiyon için çözüm getirmek için, yaklaşık 450 ml. </li><li> Oda sıcaklığında bir saat boyunca karıştırılır. Çözelti, biraz yapışkan olacak ve daha önce çözelti haline &quot;kaldırma&quot; özüt için elle çalkalama gerektirebilirkarıştırma çubuğu devralması mümkün değildir. </li><li> Karıştırılarak bir saat sonra, dereceli bir silindir içine dökün ve (kaptan forskolin kurtarma üst düzeye çıkarmak için) bulamacı karışmaya için kullanılan beher &quot;durulama&quot; olarak kullanılmıştır araç kullanarak 500 ml hacim getirmek . </li><li> 50 ml polipropilen santrifüj tüplerine bulamacı aktarın. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak santrifüj (1500 xg, oda sıcaklığı, 15 dk). Bu noktada, çözünmeyen madde yüzer kolayca dökülerek izin vererek, oldukça yoğun olacaktır. </li><li> Ekstreden kalan çözünmez malzemenin çıkarılması için 0.22 um selüloz asetat zarından solüsyonu filtre. Bu kök ekstresi çözünmeyen bileşenlerden zarın erken tıkanmasını önlemek için ünite ile birlikte ön filtrelerin kullanımı ile birlikte, hücre kültürü için tasarlanmış bir şişe-top sistemi kullanırlar. Ekstrenin geniş hacimli yaparken, ön filtre bahis değiştirme, bir seferde yaklaşık olarak 100 ml filtreHer ekledi hacmi arasında bir aracıdır. </li><li> Oda sıcaklığında depolandığında, özüt kadar bir yıl için biyolojik faaliyeti tutar. </li></ol> 2. Topikal Tedaviler için C57BI / 6 K14-Scf Farelerin hazırlanması <ol><li> Elektrik kesme ile hayvanlardan dorsal kürk çıkarın. Kısaca 0.25 mm cerrahi hazırlık kafa (Fisher Scientific) ile donatılmış elektrikli makas ile dorsal kürk kesme kolaylaştırmak için inhalasyon izofluran ile hayvanları uyutmak. Tercihen sadece anestezik doz aşımı riskini en aza indirmek için anestezi bir tür (örneğin, ketamin / ksilizin) kullanın. Doymuş teneffüs odası davlumbaz dışında kullanıldığında mesleki risk taşır ve hayvanlara anestezik bilinmeyen miktarda sunar. İdeal olarak hassas bir buharlaştırıcı kullanılmalıdır. </li><li> , Artık saç anız kaldırmak kimyasal bir dökücü olan hayvanları tedavi etmek. Ketamin 40 mg / kg ksilazin ve 4 mg / kg &#39;lik bir ip enjeksiyonu ile hayvana anesteziklere </li&gt; <li> Hayvanlar yeterince (ayak tutam tarafından değerlendirilecek gibi) anestezi sonra, eldivenli parmak kullanılarak makaslanmış dorsal deri tüy dökücü krem ​​parmak ucu büyüklüğünde uygulayın. 30-60 saniye için ya da etrafında taşınırken olarak kıllar açık krem ​​görülebileceği kadar, deri içine krem ​​sürün. Uzun süre maruz kalma epidermal bütünlüğü kaybı deri, epidermal arıza ve ölüm kimyasal yakma neden olarak sadece epilasyon için gereken zaman en az miktarda üzerinde krem ​​bırakın. </li><li> Tüm krem ​​kaldırıldı kadar tekrar tekrar su ile ıslatılmış gazlı bez ile dorsal cildinizi silin. Yumuşak kağıt havlu kullanarak ve onları sıcak bir tenha bir yerde (örn. temiz kafesler bir ısınma pad yerleştirilen) kurtarmak için izin kuru hayvanlar. Tek-tek hayvanların tüylerini ve işlem boyunca yakından izlemek. </li></ol> 3. Forskolin veya Araç Kontrol topikal uygulaması <ol><li> Hayvanlar, her seferinde bir tedavi edilmelidir. Kısaca nefes ile uyutmakaltında bir form takılmış naylon hava geçirgen filtrenin üstüne fare koyarak d izofluran bir davlumbaz izofluran-doymuş kapaklı şeffaf cam kavanozda bir izofluran-doymuş kağıt havlu yerleştirilir olmuştur. Istemli kas hareketleri bastırmak için ama spontan solunumu (genellikle 10-20 sn) korumak için yeterli bir süre için izoflurana fareyi Açığa. Çok uzun izofluran olarak hayvan bırakmak solunum bastırılması ve ölüme neden olur. Bu &quot;ışık olacak&quot; ve uyuşturucu ve risk ölüme hayvan maruz aşırı fazla izofluran yerine kısaca fareyi yeniden ortaya çıkarmak için sahip tarafında err daha iyidir. </li><li> Izofluran odasından hayvan çıkarın ve temiz bir tezgah emici ped üzerine yerleştirin. </li><li> Bir tek polipropilen ucu ile donatılmış 1.000 ul mikropipet,% 40 ham forskolinle ekstresinin 400 ul çizmek kullanma (araç kontrol hayvanları% 70 etanol, tek başına% 30 propilen glikol alacaksınız). </li><li> Üzerine özü aktarınTüm cilt kapalı edildikten sonra tekrar pipet tarafını kullanarak, sonra derinin üzerine damlayan tarafından hayvan, dorsal cilt üzerinde özü smear. Uygulamadan sonra deri leke hiç gerek yoktur. </li><li> Kendi kafesine fare dönün, ve anestezi kurtarır kadar dikkatle gözlemlemek. </li><li> Non-pigment cAMP etkileri UV duyarlılık deneyleri yıkmak gerektiğini amacıyla, UV ışınlarına maruz kalma (pigment etkisi son topikal tedavi ötesinde birkaç gün sürer) 2 gün önce tüm topikal tedaviler durdurma. </li></ol> 4. Yansıtıcı Kolorimetre Göre Renk Ölçüm Cilt <ol><li> Kısaca inhale izofluran (yukarıya bakınız) ile fare uyutmak. </li><li> Kolorimetresi ile sağlanan standart beyaz bir yüzeye taşınabilir başını koyarak bir Minolta renk ölçer kalibre. </li><li> Sağlanması hayvanın sırt deri ile kolorimetre floş portatif ölçüm kafasını yerleştirin bu 1 cm 2 yuvarlak aperture tam olarak deri üzerine bastırılır. Dorsal deri farklı alanlarında, en az üç ayrı ölçüm al. </li><li> Hayvan başına ve tedavi grubu başına ortalama ± SD L * puanı hesaplayabilirsiniz. Yansıtıcı kolorimetre deneyde herhangi bir noktasında yapılabilir. </li></ol> 5. &quot;Minimal eritem Doz&quot; (MED) Hesaplama UV Hassasiyet Belirlenmesi <ol><li> Araç ya da yukarıda tarif edildiği gibi ya da forskolin ile ön-muamele edilmiş hayvanlar kullanın. Ketamin ve ksilazin (yukarıya bakınız) standart bir karışımın peritoneal içi enjekte hayvanları anestezisi. </li><li> MED test için UV-tıkayıcı bir parça bant hazırlayın. , Bant delik oluşturmak bir 1 cm 2 dairesel kesme ile ağır delgi (Şekil 2A ve B) kullanın. Bandın bir tanımlanmış boyut ve simetrik düzeneğinin delikleri sahip ışınlama sonrası cilt değişikliklerinin fark edilmesini kolaylaştırır. Bant her delik üzerinde, bir küçük ama kolayca sökülebilir parça geçerlidir<html> UV farklı dozlarda uygulanmasını sağlamak için UV ışınlarına maruz kalma sırasında belirli zaman aralıkları ile kaldırılabilir bant. </li><li> Hayvanlar yeterince sedasyon sonra, dorsal yüzeyinde bant yer. Göz yağ zaman anestezi altında kullanılmalıdır. </li><li> İki Westinghouse F15T8UV-B, aşağıdakilerden oluşan UV kaynağı açın 313 nm&#39;lik bir zirve çıkış ve 280-370 nm bir dizi lambalar. (Genellikle ısınmak için lambalar için birkaç dakika sürer) bir UVB sensörü ile UV fotometre ile ölçülen lambası sürekli UV çıkışına gelmesini sağlayın. </li><li> UV Fotometresi ile ölçülen UV aktarım oranına göre, arzu edilen her bir doz için UV ışınlarına maruz kalma süresini hesaplamak. Örneğin, lambanın UVB çıkışı önlemleri 2.4 mW / cm 2. Bu yüzden, 5 kJ / m 2 &#39;yönetmek için, cilt altındaki hesaplanan, UVB radyasyon (3 dakika ve 28 saniye olan) 208 saniye maruz kalması gerekir: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Hatta UV pozlama sağlamak için ventral yüzeyi aşağı sakinleşmiş hayvanları (yerinde tıkayıcı bant ile her biri) yerleştirin. UV radyasyon seçilmiş dozları uygulama için, ardışık olarak radyasyon doğru doz 1 cm&#39;lik deri 2 alanlarını açığa çıkarmak için küçük bir delik içeren tıkayıcı bantları çıkarın. 40 kJ / m 2 deneyinde en yüksek dozu ise, Bu nedenle, yukarıdaki örneği kullanarak, daha sonra herhangi bir hayvan olurdu 40 kJ / m 2 &#39;bir durumda 27 dakika ile 47 saniye toplam ve cilt için lamba altında olacaktır bantlamayın süre boyunca örten. Maruz kalan 208 saniye olduğu, ancak, 5 kJ / m 2 durum üzerinde uzanan bant çıkarılır. Her koşul aynı anda biter böylece kaset çıkarma zamanlaması yapılmalıdır. </li><li> UV ışınlarına maruz kalan, ani ya da aşırı güçlü hareketleri ile cilde rip özen dikkatle dorsal cilt şeridi sıyırın. Izin vermek için bir sıcak, sakin bir yerde hayvanları yerleştirinanestezi kurtarma. </li><li> Eritem (kızarıklık) veya ödem gizli alanları aramak için 24-48 saat boyunca fareler Monitör (şişme) UV ışınlama özel doza maruz kalan anatomik sitelerine karşılık gelmektedir. Fotografik cilt bulguları belgelemek. </li><li> MED değer eritem ve / veya derinin bütün maruz çemberin ödem ile tanımlanan iltihabı neden UV en az doza karşılık gelir. Cilt pigmentasyon Ancak eritem ve ödem yine genel olarak doğru, kısmen, UV ışınlarına maruz kalma sırasında bant açıklıkların tanımlanan şekli sayesinde değerlendirilebilir, MED belirlenmesi meydan unutmayın. </li></ol> 6. İstatistiksel Analiz Bonferroni sonrası testinde (Graph Pad PRISM). P değerleri &lt;0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmektedir ile tek yönlü ANOVA ile farelerin kohort arasındaki verileri analiz.

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Tenli insan bir hayvan modeli kullanarak, bir forskolinle zengin ham kök ekstresinin topikal uygulama sağlam deride melanin üretimini uyararak epidermis kararıyor bulabilirsiniz. Epidermal melanizm insan derisinde meydana geldiği gibi, bazal epidermis içinde kök hücre faktörü ifade bağlıdır, ancak genetik olarak modifiye edilmemiş bir fare deri. Genetik olarak modifiye edilmemiş farelerin sırt derisi cilde pigment vermek için interfolliküler melanosit yeterli sayıda yoksundur. Ancak bu tür kök hücre faktörü (kit ligandı...

Melanom insidansı, cilt kanserinin en ölümcül formu, özellikle açık tenli bireyler arasında, Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde son birkaç yılda önemli ölçüde artmıştır. Güçlü ve moleküler epidemiyolojik kanıtlar önemli bir etken çevresel faktör 2-5 gibi UV radyasyonu implicates. Güneşe maruz kalma ve bronzlaşma yatak kullanım şeklinde artan UV ışınlarına maruz kalma melanom insidansında 6-7 artışların çok sorumlu olması muhtemeldir. Melanom riski özellikle güneş yanığı 8, hayatında 9-10 erken özellikle de bağlantılı görünüyor. Güneş yanığı tehlikesi dozu ve UV ışınlarına maruz kalma yoğunluğu, aynı zamanda UV ışınlarına cilt cevabı etkileyen kalıtsal faktörler tarafından sadece bağlantılıdır. Cilt pigmentasyon UV duyarlılığı en önemli belirleyicilerinden biri, güneş yanığı ve kanser riski riskidir. Melanom koyu tenli individua göre açık tenli kişilerde yaklaşık yirmi kat daha sık görülür11-13 ls. Melanin, epidermis melanositler tarafından üretilen bir pigment, cilt cilt temel belirleyicisidir. (1) eumelanin, UV radyasyon enerjisini emici etkili bir koyu kahverengi / siyah pigment, ve (2) Pheomelanin, deri içine UV foton nüfuz etmesini engelleyen daha az etkili olan bir kırmızı / sarı pigment: Melanin iki ana çeşitleri geliyor. Cilt rengi, UV duyarlılığı ve melanom riski büyük ölçüde epidermal eumelanin içeriği 14-15 tarafından belirlenir. Epidermiste daha eumelanin, daha az UV foton deri içine nüfuz edebilir. Çünkü eumelanin düşük doğuştan düzeyleri, açık tenli bireyler çok daha fazla eğilimli UV radyasyonunun 16-18 akut ve kronik etkileri vardır. Cilt pigmentasyon, melanoma risk ve &quot;tan&quot; UV maruz kaldıktan sonra tüm melanokortin reseptörü 1 (MC1R) sinyalleme yeteneği ile ilişkili, bir G s birleştirilmiş yedi transmembran s yeteneğimelanosit 19-22 sert bir yere reseptör. MC1R aynı kökten gelen yüksek afiniteli bir ligandın, α-melanosit uyarıcı hormon (α-MSH) bağlanan, ikinci haberci cAMP&#39;nin 23 adenilil siklaz ve üretim aktivasyonu mevcuttur. UV ışınlarına maruz kalan cilt, normal fizyolojik bir cevap keratinositler 24-29 tarafından α-MSH epidermal üretimi içerir. Biz ve diğerleri keratinosit kaynaklı α-MSH adenilil siklaz 30 aktivasyonu ile cAMP ikinci haberci aşağı üretimini başlatarak, epidermal melanositler MC1R bağlar varsayımında. cAMP seviyeleri hayatta kalma yollar, DNA tamiri ve pigment sentezi gibi melanosit farklılıkların birçok yönünü kontrol. MC1R sinyalizasyon ve cAMP açıkça pigment enzim düzeylerini ve eumelanin üretimini uyarmaktadır. MC1R sinyalizasyon sağlam ve melanositik cAMP düzeyleri sağlam olduğunda, eumelanin üretilen ve cilt karartan. Ancak, MC1R sinyal arızalı olup olmadığını vesitoplazmik cAMP düzeyleri düşük kalması, Pheomelanin 1 yerine üretilmektedir. Eumelanin sentez cAMP düzeylerini yükseltmek 1,14,31-35 ajanları tarafından farmakolojik teşvik edilebilir. MC1R proteini insanlarda 36-46 melanom riski önemli bir düzenleyici olduğundan, MC1R UV-kaynaklı kanser oluşumuna karşı koruyan melanosit hangi mekanizmalar ilgilendi. Bizim çalışmalar için bir temel olarak, biz saf C57BL / 6 genetik birikimine 1 bir transgenik MC1R-varyant fare modeli oluşturulur. Bu modelde, kurucu bazal epidermis içinde ifade edilir ve epidermal interfolliküler melanosit saç folikülleri dermise lokalize melanosit edildiği transjenik olmayan farelerde aksine, yaşam 47 boyunca deri korunur hücre faktörü (SCF) kaynaklanıyor. K14-Scf transgen dahil ile, epidermis pigmentin özellikle melanin pigmentleri ile pigmentli hale karakteristikhayvanın 1 suşu. vahşi tip MC1R sinyalizasyon ile C57BL / 6 genetik birikimine K14-Scf fareler jet-siyah deri eumelanin pigment çok yüksek düzeylerde olması. Şaşırtıcı olmayan bu hayvanlar yüksek UV ışınlarına dayanıklıdır. Buna karşılık, mutant etkin MC1R barındıran genetik olarak uyumlu K14-Scf C57BL / 6 hayvan epidermiste hemen hemen hiç eumelanin vardır. Bunun yerine, bu &quot;uzantısı&quot; hayvanlar (MC1R e / e) Pheomelanin pigment (Şekil 1A) birikimi neden adil bir cilt cilt var ve çok daha fazla UV-duyarlı 48-49 vardır. Deri içine nüfuz etmesini kimyasal özelliklere sahip farmakolojik bileşikler, potansiyel olarak doğrudan deri epidermal melanositlerin cAMP seviyelerini işleyerek uzantısı (MC1R e / e) K14-Scf hayvan modeli olarak eumelanin neden olduğu gösterilmiştir. Bu modelde Melanin upregülasyonu r olmuşturadenilat siklaz aktive 1 hem de fosfodiesteraz 4 inhibisyon 35 tarafından görülen EPO kaynaklı. Bu yazıda, uzantısı (MC1R e / e) K14-Scf hayvanlar modeli tenli UV duyarlı insan olarak hazırlanması ve forskolın topikal uygulama göstermektedir. Bu ilacın günde iki kez uygulanması, hızlandırılmış melanization teşvik ettiği cilt koyulaşması melanin pigmentinin epidermal birikimi nedeniyle ve bu neden olduğu epidermal melanin &quot;minimal eritem dozu&quot; (MED) 48 ölçümü ile UV uyarımlı güneş yanığı karşı koruduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Coleus Forskoli özü %20</td> <td>Buckton Scott USA Inc.</td><td>Yok</td><td>Princeton, NJ</td></tr><tr><td>Isothesia, Isoflurane, USP</td><td>Butler Schein</td><td>NCD 11695-6776-1</td><td>Dublin, OH, ABD</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Anased Enjeksiyon</td><td>LA04612</td><td>Shenandoah, Iowa, ABD</td></tr><tr><td>Ketamin HCl, USP</td><td>Putney</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>St. Joseph, MO, ABD</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs.</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>Propilen glikol</td><td>Adesco</td><td>05751L</td><td>Solon, OH, ABD</td></tr><tr><td>Tüy dökücü krem, Nair</td><td>Church Dwight</td><td>JF-11 4381322</td><td>Priceton, NJ</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Antiseptik Hg Lambası UV-B</td><td>Westinghouse</td><td>F15T8UV-B</td><td></td></tr><tr><td>Radyometre fotometre Uluslararası</td><td>ışık</td><td>1LT400A</td><td>Peabody, MA, ABD</td></tr><tr><td>Kromametre</td><td>Konica Minolta</td><td>CR-400</td><td>Ramsey, NJ, ABD</td></tr><tr><td>Kromametre CR-400 için Veri İşlemcisi</td><td>Konica Monilta</td><td>DR-400</td><td>Ramsey, NJ, ABD</td></tr></tbody></table>

bir insanlaşmış fare modeli epidermal melanin ve karşı koruma yanığı farmakolojik İndüksiyon

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Cilt, UV duyarlılığı ve cilt kanseri riskinin Adil tüm melanokortin 1 reseptörünün fizyolojik işlevi, melanosit yüzeyinde bulunan bir G s-bağlanmış bir sinyal gönderme proteini ile ilişkilidir. MC1R da, ciltteki melanin melanositik üretimini düzenler, adenilil siklazı ve cAMP üretimini uyarır. MC1R sinyal UV yaralanmalara karşı korur hangi mekanizma ile incelemek için bu çalışma, kök hücre faktörü (SCF) ve epidermal ifade göre &quot;hümanize deri&quot; ile, bir fare modelinde dayanır. K14-Scf transgenik fareler de melanosit korumak Bu nedenle epidermis ve epidermiste melanin yatırmak yeteneğine sahiptir. Bu hayvan modelinde, siyah eumelanin pigment ve bir UV-korumalı fenotip sağlam birikimi yabani tip MC1R durumu ile sonuçlanır. Bunun aksine, arızalı MC1R sinyal yeteneğini sergilerler bir sarı / kırmızı bir pigmentasyon, deride çok az eumelanin ile K14-Scf hayvanlarBir UV duyarlı fenotip. Bu eumelanin birikmesini akıl MC1R sinyali taklit topik maddeler ile geliştirilmiş olabilir, biz MC1R arızalı tenli farelerin derisine forskolin özü doğrudan uygulama sağlam eumelanin indüksiyon ve UV koruması 1 neden olduğunu bulduk. İşte biz hazırlıyoruz ve K14-Scf tenli farelere bir forskolinle içeren doğal kök ekstresi uygulanması ve minimal eritem dozu (MED) belirlenerek UV duyarlılığını ölçmek için bir yöntem bildirmek için yöntem açıklanmaktadır. Bu hayvan modeli kullanılarak, bu cildin epidermal cAMP indüksiyon ve melanizm UV maruziyeti fizyolojik tepkileri nasıl etkilediğini incelemek mümkündür.

C57BL / 6 fareleri, tarif edildiği gibi (Şekil 1A) halinde K14-Scf transgen içeren, eumelanotic pheomelanotic veya amelanotik arka üzerinde elde edildi. Tenli uzatma kohortu (MC1R e / e, Tyr + / +) fareler araç (% 70 etanol,% 30 propilen glikol) veya% 40 ham Coleus forskohlii kök ekstresi (80 uM başına ya da günde iki kez dozları ile topik olarak tedavi edilmiştir 5 gün (Şekil 2B) için) doz. Epidermal pigmentasyon topikal tedavilerin etkileri görs...

Epidermal melanin tenli UV duyarlı insan bir fare modelinde forskolin topik uygulanmasıyla elde edilir. En az eritematöz doz (MED) deneyi ile ölçüldüğü gibi güçlü bir UV aracılı enflamasyonun (güneş yanığı) karşı koruma koyulaşması deri ve epidermal cAMP düzeyleri farmakolojik manipülasyonu.

Bir Insanlaşmış Fare Modeli epidermal melanin ve Karşı Koruma yanığı Farmakolojik İndüksiyon

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, dört deri ile ön işlem uygulanmış açık tenli farelerde minimal eritem dozunu belirleyerek UV duyarlılığını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle farelerin sırt derisinin tıraşlama ve ablasyon yoluyla ışınlanmaya hazır hale getirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, sırt derisine topikal forskolin tedavileri uygulanır.Ardından, dört mediate kavunun UV kaynaklı inflamasyon üzerindeki etkilerini belirlemek amacıyla fareler farklı dozlarda UV ışınlamasına maruz bırakılır. Elde edilen sonuçlar, topikal olarak uygulanan forline'in cilt pigmentasyonunu güçlü bir şekilde artırdığını ve farmakolojik olarak artırılmış me'ye sahip hayvanların MED ile belirlendiği üzere UV'ye dirençli olduğunu göstermektedir. Bunlar, melanocortin one receptor veya MC one R olarak adlandırılan çok önemli bir melanosit genindeki defekt nedeniyle bronzlaşamayan bir bireyde farmakolojik olarak bronzlaşma oluşturmanın mümkün olduğunu gösteren kavram kanıtlama çalışmalarıdır. İnsan popülasyonlarında mc one R fonksiyon kaybı; UV hassasiyeti, güneş yanığı eğilimleri, bronzlaşamama ve yaşamın ilerleyen dönemlerinde dört kata kadar melanoma riski ile ilişkilidir.Bu çalışmalar için ilaç olarak four scullin'i seçtik; çünkü bu madde, defektif bir melanokortin reseptörü sinyal yolunu baypas edebilmekte ve melanositleri, iyi bir mc one R sinyal yoluna sahip olduklarına ikna ederek bol miktarda melanin üretmelerini sağlamaktadır. Bu melanin deride birikerek hayvanları UV radyasyonuna karşı korur. Bu yöntemin deri ile ilgili derinlemesine bilgi sağlayabildiğini bilsek de, aynı zamanda kanser önleme açısından da önemli olabilir.UV radyasyonun cilt kanserlerinin büyük çoğunluğu için temel karsinojen olduğunu ve cilt korumasının uygulanmasının UV hasarına karşı koruma sağladığını bildiğimizden, intraperitonal enjeksiyonlar gerçekleştirilir. İğne yerleştirildikten sonra ve içerik enjekte edilmeden önce, iğnenin bir kan damarına, bağırsaklara veya idrar torbasına girmediğinden emin olmak için aspirasyon yapıldığından emin olun. Sezaryene kaçınmak için IP enjeksiyonlar sağ taraftan yapılmalıdır. Forline ekstraktı hazırlandıktan ve fare isoflorin ile kısa süreli olarak anesteziye alındıktan sonra.İnhalasyon sonrası, metin protokolüne uygun olarak, hayvana ketamin ve ksilazin IP enjeksiyonu ile ek anestezi uygulayın. Sedasyonun doğrulanması için ayak parmağı sıkıştırma testi yapın. Dorsal kürkü tıraşlamak için 0,25 milimetre cerrahi hazırlık başlığı ile donatılmış elektrikli makas kullanın.Kılları temizlemek için bir tüy dökücü krem kullanın. Ardından, cildin yanmasını veya başka şekilde zarar görmesini önlemek için, krem tamamen temizlenene kadar sırt derisini nazikçe silmek amacıyla hemen suyla ıslatılmış gazlı bez pedler kullanın. Hayvanı, iyileşmesi için ısıtıcı bir ped üzerindeki temiz bir kafese yerleştirmeden önce kurulamak için yumuşak kağıt havlular kullanın.Genel olarak, çeker ocak altında inhalasyon yoluyla isof fluorine kullanarak forskolin veya kontrol solüsyonlarının topikal uygulamasını kolaylaştırmak için fareler kısa süreli olarak anesteziye alınmalıdır. İşleme, isof fluorine ile doyurulmuş bir kağıt havlu içeren, kapağı kapalı ve isof fluorine ile doyurulmuş şeffaf bir cam kavanoz ile başlayın. Formuna uygun, naylon, hava geçirgen bir filtre taktıktan sonra, sedatize edilmiş hayvanı temiz ve emici bir tezgah pedine yerleştirerek, gönüllü kas hareketlerini baskılayacak kadar kısa bir süre filtre üzerinde tutarak fareyi anesteziye alın.Parmak sıkma testi uyguladıktan sonra, 400 µL ham forline ekstraktını hayvanın sırtındaki deri üzerine damlatarak aktarın. Ardından, ekstraktı açıkta kalan sırt derisinin tüm yüzeyine yaymak için pipet ucunun yan tarafını kullanın. Pigment kaybını önlemek için fareyi kafesine geri koyun ve anesteziden tamamen ayılana kadar dikkatle gözlemleyin.Siklik A MP etkileri, kafa karıştırıcı UV hassasiyet deneylerinden kaynaklanmaktadır. Reflektif kolorimetri gerçekleştirmek için UV maruziyetinden iki gün önce tüm topikal tedavileri kesin. Fare, izoflorür inhalasyonu ile kısa süreli anesteziye alındıktan sonra.Taşınabilir başlığı, cihazla birlikte verilen standartlaştırılmış beyaz yüzey üzerine yerleştirerek kolorimetreyi kalibre edin. Taşınabilir ölçüm başlığını, bir santimetrekarelik yuvarlak açıklığın deri üzerine tamamen bastırıldığından emin olarak, hayvanın dorsal derisine paralel şekilde yerleştirin. Dorsal derinin farklı bölgelerinden en az üç ayrı ölçüm yapın.Hayvan başına ve tedavi grubu başına ortalama L skorunu, artı veya eksi standart sapma ile birlikte hesaplayın. Minimal eritem dozunu veya MED'i belirlemek için, her hayvan çeşitli UV dozlarına maruz bırakılacaktır. İlk olarak, her delik üzerine bandajda delikler açmak için bir santimetrekarelik dairesel kesime sahip ağır hizmet tipi bir delgeç kullanarak bir parça UV geçirmez bant hazırlayın.Bant kullanımı. Kolayca sökülebilecek küçük bir bant parçası uygulayın. UV maruziyeti için, bandı anestezi uygulanmış farenin sırt yüzeyine yerleştirin.Hayvanın gözleri açıksa, kurumadan ve UV maruziyetinden kaynaklanabilecek yaralanmaları önlemek için suni gözyaşı uygulayın. Tepe çıkışı 313 nanometre ve aralığı 280 ile 370 nanometre olan iki UVB lambasından oluşan UV kaynağını açın. UV fotometre ile ölçülen UV iletim hızına göre çıkışı doğrulamak için, kuzuya sabit bir UV çıkışına alışması için süre tanıyın; ardından UVB sensörlü bir UV fotometre kullanarak her bir istenen doz için UV maruziyet süresini hesaplayın.Örneğin, lambalarınızın UVB çıkışı santimetrekare başına 2,4 milliwatt olarak ölçülmüştür. Bu nedenle, metrekare başına beş kilojoule uygulamak için, buradaki hesaplamaya göre cildin 208 saniye boyunca UVB radyasyonuna maruz bırakılması gerekir. Ardından, seçilen radyasyon dozunu ardışık olarak uygulamak için, sedatize edilmiş hayvanın ventral yüzeyi aşağı gelecek şekilde yerleştirilerek homojen UV maruziyeti sağlayın.Uygun zamanda, delikleri kapatan küçük bant parçalarını çıkarın. Örneğin, kare metre başına 40 kilojoule en yüksek doz ise, fare lambanın altında 27 dakika 47 saniye kalacaktır ve bu doza karşılık gelen delik başlangıçta açılacaktır. Ancak, kare metre başına beş kilojoule koşulu için bant, 208 saniyelik pozlama süresiyle birlikte çıkarılacaktır.UV maruziyeti sonrası kalan sürenin sonunda, bandı dikkatlice çıkarın ve hayvanları kafeslerine geri döndürmeden önce anesteziden ayılmaları için sıcak ve sessiz bir yere yerleştirin. Minimal eritemli doz veya MED değeri, deri üzerindeki maruz kalan tüm dairede eritem ve/veya ödem ile tanımlanan inflamasyona neden olan minimum UV dozuna karşılık gelir. Fareyi, UV maruziyeti olan bölgelerde belirgin eritem veya ödem alanları olup olmadığını gözlemlemek için 24 ila 48 saat boyunca takip edin.Bazen kalan ilk tıraş artıkları, alttaki cilt eritemini veya ödemini maskeleyerek MED testinin yorumlanmasını zorlaştırır; cildin %70 etanol ile ıslatılması, cildi çok daha yorumlanabilir hale getirir. Tüm cilt bulgularını fotoğraf yoluyla belgeleyin ve ardından fareleri hayvan tesisine geri götürün. Bu deneylerde, farelerin epidermiste melanositleri tutmasını ve sonuç olarak melanin biriktirmesini sağlayan K 14 kök hücre faktörü transgenini içeren, anodic anodic veya anodic arka planlarında C 56 black six fareler üretilmiştir.Burada gösterilen epidermiste, açık ten uzatma fare kohortlarına beş gün boyunca günde iki kez topikal olarak ya taşıyıcı veya %40'lık ham colus fors coly kök ekstresi uygulandı. Topikal tedavilerin epidermal pigmentasyon üzerindeki etkileri, hem görsel inceleme hem de yansıtıcı renk görüntüleme ile belirlendi. Kök ekstresinin uygulanması, K 14 SCF transgenik arka planda güçlü bir epidermal koyulaşma ile ilişkilendirildi, ancak genetik olarak eşleştirilmiş non-transgenik hayvanlarda bu durum gözlenmedi; bu durum, farmakolojik olarak indüklenen melaninin birikmesi için interfolliküler epidermal melanositlerin mevcut olması gerektiğini göstermektedir.Epidermiste, kök ekstraktı bitkisel fitokimyasalların ve dört galinin varlığı nedeniyle derin bir renge sahip olsa da, cilt kararması yalnızca ilacın boyama etkisinden kaynaklanamaz. Burada gösterildiği üzere, günde iki kez topikal olarak uygulandığında non-transgenik hayvanlar kök ekstraktı ile cilt kararması göstermezken, forskolinin melanin etkileri iki gün gibi kısa bir sürede kaydedilmiştir. Maksimal kararma, bu şekildeki font mason ve dorsal cilt kesitlerinin melanin boyaması ile gösterildiği üzere birkaç gün sonra belirginleşmiştir.Melanizasyon derecesi doz bağımlıdır; günde bir kez 15 gün boyunca veya günde iki kez beş gün boyunca four skin ile tedavi edilen hayvanlar benzer miktarlarda cilt kararması göstermiştir. Ayrıca, her iki tedavi grubunda da four skin maruziyetine bağlı belirgin bir toksik etki gözlemlenmemiştir. Bu nedenle, beş günlük hızlandırılmış tedavinin, dorsal cildin güvenli melanizasyonunu standart günde bir kez uygulanan tedavi kadar etkili bir şekilde teşvik ettiği sonucuna vardık.Bu şekil, MED testiyle ölçüldüğü üzere, forline kaynaklı epidermal mein'in derin bir UV koruması sağladığını; buna karşın, beş gün boyunca günde iki kez vehikül ile tedavi edilen K 14 SCF extension fareleri için ortalama MED değerinin 5,0 ± 0,0 kJ/m² olduğunu göstermektedir. Topikal four galin ile tedavi edilen kohortlar için ortalama MED 30,0 ± 0,0 kJ/m²'den daha yüksekti. Aslında, 30,0 kJ/m²'lik bir doz eritem oluşturmak için yetersiz kalmıştır. Standart force Glen dozajının kullanıldığı bu deneyde, tedavi edilen K 14 SCF extension fareleri için ortalama MED 50,0 ± 7,1 kJ/m² idi.Önemli bir nokta olarak, forskin ön işlemi, ya K 14 SCF aracılı epidermal melanositlerin eksikliği ya da tirozinaz yetersizliği nedeniyle melanin sentezleyemeyen hayvanların MED değerlerini etkilememiştir. Forskin uygulamaları UV maruziyetinden iki gün önce durdurulduğu ve UV maruziyeti sonrası devam ettirilmediği için, pigment dışı CAMP etkilerinin MED sonuçlarında rol oynamadığı sonucuna vardık. Aksine veriler, bu modelde forskin tarafından indüklenen UV korumasının mekanizmasının epidermal melanin olduğunu göstermektedir.Bu teknik bir kez kavrandığında, cilt pigmentasyonu yanıtının ve ultraviyole duyarlılığının kolay ve tekrarlanabilir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Hayvan modellerindeki uygulaması günde sadece birkaç dakika sürer ve deneysel sürenin büyük bir kısmı aslında UV radyasyonu ve MED testleri ile geçer. Bu prosedürü uygularken, cildin kademeli olarak bazal açık ten rengine geri döndüğünü unutmamak önemlidir.Melanin indüksiyonu, cildin uyarıldığı sürece koyu kalması, ancak uyarı ortadan kalktığında bronzluğun sonraki birkaç hafta içinde ciltten silinmesi bakımından yanık yanıtına çok benzer.

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, insan kaynaklı melanom hücreleri, bağışıklığı baskılanmış bir farenin yan bölgesine deri altından implante ediliyor. PDX modeli, in vivo koşullarda gözlenen tümör heterojenliğini ve melanom agresifliğini daha iyi özetleyen melanom hücrelerinin klinik öncesi araştırmasına izin verir.

Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellemesi: Melanom Fare Modelleri Oluşturmak İçin Bir Teknik

Bu video, kimyasalların topikal uygulamasıyla tümör başlangıcını incelemek için iki aşamalı cilt karsinogenezini indükleme prosedürünü açıklar. İlk adımda, kök hücrelerde mutasyonlara neden olarak tümör oluşumunu başlatan bir fare modelinin cildine bir mutajen olan DMBA uygulanır, ardından cilt papilloma oluşumunu hızlandıran bir büyüme uyarıcısı olan TPA uygulanır.

Kimyasal Kaynaklı İki Aşamalı Cilt Karsinogenezi Modeli: Cilt Kanserinin Deneysel Bir İn Vivo Fare Modeli

Bu videoda, insan derisini taklit eden bir fare modeli olan insanlaştırılmış bir fare modelinde UV duyarlılığını ölçmeye yönelik bir yöntem açıklanmaktadır. Ciltte kızarıklık veya ödem oluşturabilecek UV radyasyonunun minimum eritematöz dozunu (MED) belirliyoruz. Yöntem, UV duyarlılığını azaltmak için kullanılan ilaçların etkinliğini bulmaya yardımcı olabilir.

Minimum Eritematöz Doz Deneyi: Fare Modellerinde UV Duyarlılığını Ölçmek İçin Bir Yöntem

Biz kimyasallar tüp bebek hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için üç deneysel yöntemleri tarif: miktar 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve 3) melanin hücresel melanin boyama ve görüntü analizi tarafından ölçümü.

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

Aşağıdaki prosedür, genetik olarak tasarlanan bir fare modelini kullanarak, murine dorsal deride melansitik tümör başlamasını uzamsal ve temporal kontrol etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol makroskopik ve mikroskopik kutanöz Melanom inisiyasyonu açıklanmaktadır.

Mutant melanosit kök hücrelerinden Murine Melanoma başlangıcı uzamsal ve temporal kontrol

İki aşamalı deri karsinogenezi topikal olarak uygulanan iki kimyasal tarafından indüklenir. Bir mutajen 7,12-dimethylbenz[a]anthracene) epidermal hücrelerde mutasyonlara neden olur ve genel büyüme uyarıcı sürekli bir uygulama 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-asetat cilt papilloma oluşumunu hızlandırır.

Dimethylbenz[a]Anthracene ve 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Asetat (DMBA-TPA) Kullanarak Kimyasal Kaynaklı Cilt Karsinogenez Modeli

Bu protokolün amacı, fare derisinde öldürücü olmayan seviyelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) geçici in vivo üretimini indüklemek ve dokudaki fizyolojik tepkileri daha da teşvik etmektir.

Fare Derisinde Kök Hücre Nişlerinin Uyarılması ve Doku Rejenerasyonu, Değiştirilebilir Protoporfirin IX'a Bağlı Reaktif Oksijen Türlerinin Fotojenerasyonu ile Yerinde

Burada, melanositler için optimize edilmiş bir doğrudan yeniden programlama sistemi ve sorunsuz doğrudan yeniden programlama sağlayan yüksek verimli, konsantre bir virüs paketleme sistemi açıklanmaktadır.

Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

Protokol, farelerde Ultraviyole B maruziyetinin sistemik ve lokal cilt etkilerinin bir çalışmasını açıklar.

Farelerin Ultraviyole B Radyasyonuna Kronik Maruziyetinin İncelenmesi 

Çalışma, epikütan (EC) bağışıklama yoluyla farelerde bağışıklık tepkilerini modüle etmede cildin rolünü göstermektedir. Bir protein antijeni ile EC bağışıklaması, patojenle ilişkili moleküler paternlerle birleştirildiğinde temas aşırı duyarlılığında veya ters cilt kaynaklı baskılamada bağışıklık tepkilerini baskılayabilir. EC bağışıklaması, immünoterapiye etkili, iğnesiz bir yaklaşım olarak umut vaat etmektedir.

Epikütan İndüklenen İmmünomodülasyonun Murin Modeli

HNM'de erken yaşlanmayı tetiklemek için tBHP kullanılarak standartlaştırılmış bir protokol, büyüme durması, SA-β-galaktosidaz aktivitesi ve SASP faktörleri dahil olmak üzere temel yaşlanma belirteçlerini analiz etmek için standartlaştırılmış protokoller.

Tert-bütil hidroperoksit kullanarak birincil insan melanositlerinde stres kaynaklı erken yaşlanma için standart bir protokol

Öğrenin, forskolin ile farelerde epidermal melanin indüksiyonu ve UV duyarlılığı ölçümü yöntemini. Bu çalışma, farmakolojik olarak koruyucu pigmentasyonun geliştirilmesini göstermektedir.

Bir Insanlaşmış Fare Modeli epidermal melanin ve Karşı Koruma yanığı Farmakolojik İndüksiyon

Daha fazla video keşfet