Name: Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T19:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 35 s
Description: Öğrenin, triklosanın RBL-2H3 mast hücrelerinde degranülasyon üzerindeki inhibitör etkilerini, organik solvent kullanmadan floresans mikroplaka testiyle nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, alerji ve astım tedavileri için yüksek verimli tarama olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

LMW ve RHK Biyomedikal Bilim ve Mühendislik (GSBSE) bir sources en Enstitüsü tarafından desteklenir; RHK de Maine Tarım ve Orman Deneme İstasyonu tarafından desteklenmiştir. Ek finansman Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIH P20-GM103423), Maine Tarım ve Orman Experiment Station (Grant sayısı ME08004-10, Jag), Tide Merkezi (NSF Grant # 1.008.498) Rising Maine ADVANCE Üniversitesi tarafından sağlandı ve phrma temel (Jag) den Farmakoloji / Toksikoloji bir Araştırma Başlatan Grant. Biz Dr teşekkür ederim. Antijen ve hücreler David Holowka ve Barbara Baird. Biz Hina Hashmi, Alejandro Velez ve ekipman ve emirleri ile yardım için Andrew Abovian minnettarız. Bu Maine Tarım ve Orman Deneme İstasyonu yayın sayısı 3311 olduğunu.

2004 yılında, Naal ve ark. 1 degranülasyonu yüksek verimlilik testleri için bir mast hücre biyosensör geliştirildi. Bu bizim TCS çalışmaları için uyarlanmış ve bu video ayrıntılı var ki sağlam bir testtir. Önceki Naal ve ark. 1 denemesi, mast hücre degranülasyonu rutin olarak β-heksosaminidaz 59-61 ile değerlendirilir, ancak bu yöntemler, bir erken örnekleme bir anda okunur edildiği Fluorometreler faydalanılmıştır. Önemli olarak, Naal ve ark. onların bir mikro okuyucu kullanarak da...

Mast hücreleri son derece astım anahtar arabulucu olarak hizmet immün efektör hücreleri, alerji, parazit savunma ve kanser 13-16 granül vardır. Degranüle için aktif kadar güvenli bir şekilde sitoplazmik granül alerjik ve inflamatuvar mediatörlerin depoladığınız Onlar, hemen her vaskülarize doku 15 bulunur. Degranülasyonunun gibi histamin, triptaz ve lökotrienler 15 olarak farmakolojik olarak aktif mediatörlerin salınımı ile sonuçlanır membrana bağlı granül, en ekzositoz olduğunu. Türü başlatılmasında Bu işlem sonucu ben parazitlere karşı savunma montaj yanı sıra, alerjik astım ve kanserojen yanıtları 15 başlatmada kritik aşırı duyarlılık reaksiyonları. Mast hücreleri ve bazofiller FcεRI reseptörleri, imünoglobulin E (IgE) ve 17 için yüksek afiniteli reseptör çıkarırlar. Bir alerjen ya da antijene maruz kalma çok Ig-bağlı reseptör FcεRI 17 toplama neden olur ve bu stirosin fosforilasyon olaylarını, iç mağazalarından fosfolipaz C kalsiyum akış aktivasyonu ve hücre 18 içine kalsiyum akışı bir çağlayan: degranülasyon işlemi başlatır Ig-bağlı Fc reseptörleri &quot;çapraz bağlama&quot; O-adlandırılır. Bu, kalsiyum girişini degranülasyonu için gerekli olan ve bundan başka, granül ekzositozu 15 neden önce membran ile granül füzyon işaret eder. Deneysel olarak, bir kalsiyum iyonofor yukarı olmak ya da alt akışında bir toksik madde tarafından bir yol hedefin tanımlanması için izin doğrudan aslında tüm sinyal transdüksiyon kalsiyum girişini adımı 20&#39;ye önce adımlar atlar hücre zarı 19 üzerinden servis aracı kalsiyum için kullanılabilir kalsiyum 20 sinyal. Degranülasyon histamin 6 yanında granüller doğrusal bir serbest hücre yüzer içine, β-heksosaminidaz salınımını izleyerek hızlı ve etkili bir şekilde ölçülebilir, ancak, Iin daha kolay tahlil floresan ürünü için basit bir enzim-substrat reaksiyonu ve bir mikroplaka okuyucu kullanılarak tespit etmek. Gibi protokol bölümünde ayrıntılı olarak bu mikro-tahlil ile, β-florojenik substrat bölünme 4-metilumbelliferil-N-asetil-β-D-glucosaminide rakamlarla başlangıçta Naal ve ark. Sağlam bir yöntem, 1 dayanmaktadır heksozaminidaz. Triklosan burada vurgulanır ile Biz, ilaç ve toksik maddelerin test etkileri tahlil değiştirdiniz. Bu yöntem, güvenilir bir degranülasyonu miktarını belirler, örneğin, akış sitometrik-tabanlı algılama yöntemleri 21, pahalı olmayan bir alternatif olan ve anti-alerjik ilaçlar geniş bir yelpazede yüksek verimli tarama için güzel bir şekilde bir aday potansiyeline sahip, yanı sıra immunotoksik veya alerjik kimyasallar. Bu son nokta 21. Yüzyılda 2007 Ulusal Araştırma Konseyi raporu &quot;Toksisite Test ışığında özellikle önemlidir: Bir Vizyon ve bir Stratmadır &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> bu da fareler gibi geleneksel laboratuar hayvanlarının pahalı kullanımını azaltmak için hücre kültürü kullanan yüksek verimli toksikoloji testleri geliştirilmesi için savunmaktadır). Naal ve arkadaşları. 1 tarafından geliştirilen ve bize 2 tarafından değiştirilen degranülasyonunun protokolü, homolog insan mukozal mast hücreleri veya bazofil 3-5 için iyi kabul modeli RBL-2H3 hücre hattı, kullanır. (Kültürlenmesi RBL-2H3 hücreleri için Yöntemler Hutchinson ve ark ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 22). Bu deney, büyük olasılıkla, bağlı mast hücre tipine adapte edilebilir. Triklosan (TCS) hastaneler, kişisel bakım ürünleri ve tüketim malları 23,24 fazla 30 yıldır kullanılan bir geniş spektrumlu antimikrobiyal olduğunu. TCS&#39;nin antimikrobiyal özellik için Tesir inhibe enoil-asil ile muhtemelen, yağ asidi biyosentezi inhibisyonutaşıyıcı protein redüktaz 25,26. Bu tür duş jeli, el kremi, diş macunu, diş macunu, ve% 0.3 ya da 10 mM 24 kadar konsantrasyonlarda sabunda gibi tüketici ürünleri için çok geniş bir yelpazede dünya çapında bulunur. TCS yaygın kullanımı insanlarda 27-29 ve nehir ve akarsu 30 saptanabilir düzeyde sonuçlandı. Allmyr ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma. 27 TCS ve metabolitleri plazma ve emziren anneler süt hem de mevcut olduğunu göstermiştir. Önemli olarak, TCS kolayca deri 31-37 emilir. Queckenberg ve ark. 37 mast hücrelerin bulunduğu cilt, önemli konsantrasyonu ile sonuçlanan, 12 saat içinde insan deri içine bir ~ 70 mM TCS krem ~% 10 emilme bulduk. TCS insan alerjik deri hastalığı 7-11 yönetmek için klinik olarak gösterilmiştir, ama TCS alerjik deri hastalıkları hafifletir hangi mekanizma 38 bilinmeyen olmuştur. Floresan mikro testi ayrıntılı açıklamalar yapmak Kullanımıd bu video, son zamanlarda 2 mcM kadar düşük konsantrasyonlarda TCS, önemli ölçüde bu klinik verileri 2 için potansiyel bir açıklama getirmek, mast hücre fonksiyonu ve degranülasyonuna azalttığı göstermiştir. Bu klinik veriler için bir açıklama sağlamak için ek olarak, Palmer vd bulgular. 2 TCS Kalsiyum girişi aşağı sinyal molekülleri hedef olduğunu göstermektedir. Birçok immünolojik ve diğer biyolojik süreçlerde sinyal kalsiyum önemi nedeniyle, TCS potansiyel olarak gerekli biyolojik süreçlerin çok çeşitli olumsuz etkileri olabilir. Aslında, Udoji ve ark. 39 ASR önemli bir doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu, insan doğal katil hücre litik aktivitesini baskıladığı gösterdi. Alerjik deri hastalığı (ya da tam tersine, bir immunotoxicant gibi) bir tedavi aracı olarak potansiyel ötesinde, TCS da Topu 40-49 bir endokrin olabilir. Bu nedenle, çözüm bu kimyasal hazırlamak konusunda net bir prosedür itoksikoloji ilgilendiren s. TCS küçük hidrofobik molekülün olduğu için, organik bir araç genellikle su içinde daha fazla çözünür hale getirmek için kullanılır. TCS test edilmiştir en toksisite çalışmalarında, hazırlama, örneğin etanol, aseton, 2,50,51 veya yağ gibi bir organik çözücü yardımı ile su içinde çözünme yer almıştır. Ancak, çoğu kez bu çözücülerin ve böylece test kimyasal veriler 51 yorumlanması zorlaştıran, kendileri biyolojik olarak aktiftir. Aslında, Rufli et al. 52 ve diğerleri 53, bu akut toksisite deneylerinde test solüsyonları toksisite eserler oluşturmak için kimyasal çözücüler potansiyeli nedeniyle, kimyasal yöntemlere göre fiziksel yöntemler kullanılarak hazırlanır önerilir. Daha önce TCS% 0.24 etanol / su (hacim / hacim) içinde çözüldü ve 30 dakika azaltan RBL mast hücre degranülasyonunu 2 sonike göstermiştir. % 0.24 &#39;den daha yüksek konsantrasyonlarda Etanol mast hücre degra engellemek için gösterilmiştirnulation 54,55-örnekler toksisite çalışmaları organik çözücülerin potansiyel karıştırıcı etkileri. Sadece bu organizma ya da çalışma için kullanılan hücreler üzerinde çözücülerin etkisi dikkate alınması önemlidir, ama aynı zamanda bu test kimyasal kendisinde bir çözücü etkisini izlemek için önemlidir. Örneğin, Skaare ve ark. 51 yağların erime fonksiyonunun tam kaybına yol ise polietilen glikol TCS (genellikle diş macunu ve gargara bulunan) eritilmesi sağlıklı kadın kadınlarda anti-bakteriyel ve anti-plak etkilerini zayıflattı bulundu. Bu nedenle, farklı çözücüler yeteneği TCS da dahil olmak üzere toksik madde ve modüle etmek için ilaç, etkilerini tahlil tasarımında dikkate alınmalıdır. Yağ veya lezzet Katkı maddelerinin kullanımı çeşitli ürünler 50,51 içinde TCS etkilerini etkileyebilir. Organik çözücüler kullanma ihtiyacı ortadan kaldırmak için bir çaba olarak, organik bir sol ve kullanımı ortadan kaldırarak TCS 2 çözülmesi için yöntem üzerine geliştirilmişdelik. Bu protokol, ısı (≤ 50 ° C) ile sulu tampon doğrudan TCS granül çözülür ve daha sonra UV-Vis spektrofotometresi bu TCS stok konsantrasyonu doğrulayın. TCS 40 uM (kadar suda çözünür olduğu için bu gelişmeler mümkündür <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) ve 50 ° C (ısıtıldığında, bozulmaya karşı dayanıklı gösterilmiştir <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. TCS da güçlü 4.200 L / mol / cm 12 molar sönüm katsayısı ile 280 nm 58 de emmek için bilindiği gibi biz de, UV-Vis spektrofotometre yararı var. Bu protokol, düşük maliyetli ve hızlı bir şekilde tesbit de dahil olmak üzere bir organik çözücü yardımı olmadan, bir tampon içine TCS granüller çözmek için basit ama etkili bir yol sağlarkonsantrasyon ve mast hücre degranülasyonu kimyasal etkileri izlenmesi için güçlü bir floresan mikro testi açıklar.

<table><tbody><tr><td> RBL-2H3 Cells </td><td>ATCC</td><td>CRL-2256</td><td> Kullandığımız hücreler bir hediyeydi, ancak ATCC'den de temin edilebilirler< </td></tr><tr><td> > Triclosan/Irgasan </td><td>Sigma</td><td>72779 CAS# 3380-34-5</td><td> Düşük nemli bir ortamda saklanmalıdır </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td>Gibco</td><td>25300-054 CAS# 3380-34-5</td><td> </td></tr><tr><td> EMEM </td><td>Lonza</td><td>12-611F</td><td> </td></tr><tr><td> Fetal Boval Serum </td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td> </td></tr><tr><td> Gentamisin Sülfat </td><td>Lonza Biological Sciences</td><td>17-518</td><td> </td></tr><tr><td> Albumin, Bovine Serum </td><td>Calbiochem</td><td>12659 CAS# 9048-46-8 </td><td> </td></tr><tr><td> Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; %10 çözüm) </td><td>Pierce</td><td>28314 CAS# 9002-93-1</td><td> </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>J.T Fırıncı</td><td>4153-01 CAS# 75277-39-3</td><td> </td></tr><tr><td> Magnezyum Klorür </td><td>VWR</td><td>BDH0244-500G CAS# 7791-18-6</td><td> </td></tr><tr><td> D-(+)-Glukoz </td><td>Biyomedikaller</td><td>152527 CAS# 50-99-7</td><td> </td></tr><tr><td> Potasyum Klorür Kristali </td><td>J.T Fırıncı</td><td>3046-01 CAS# 7447-40-7</td><td> </td></tr><tr><td> Kalsiyum klorür dihidrat </td><td>Acros Organics</td><td>207780010 CAS# 10035-04-8</td><td> </td></tr><tr><td> Glisin </td><td>Sigma</td><td>G8898 CAS# 56-40-6</td><td> </td></tr><tr><td> 4-Methylumbelliferyl-N-asetil-&beta;-D-glukozaminid (4-MU) </td><td>EMD Biyolojik Bilimler</td><td>474502-250MG CAS # 37067-30-4</td><td> Folyoya sarın &ndash; ışığa duyarlıdır </td></tr><tr><td> Anti-DNP Mouse IgE </td><td>Sigma</td><td>D8406</td><td> Reaktifin konsantrasyonu 1 mg/ml'dir. Alikot 25 &mikro; l&nbsp; reaktifi ayrı mikrosantrifüj tüplerine ve Parafilm'e yerleştirin. Alikotları -20 ° C'de saklayın; Kullanılmayan C ve 2-8 derecede kullanılan alikotu saklayın; 1 aydan daha uzun olmamak üzere C. </td></tr><tr><td> DNP-BSA </td><td>Cornell Üniversitesi'nden Dr. David Holowka ve Dr. Barbara Baird'den hediye</td><td></td><td> Öneri: yaşam teknolojileri DNP-BSA kataloğu# <a href="http://www.invitrogen.com/search/global/miniPDPAction.action?query=A23018">A23018</a> </td></tr><tr><td> Kalsiyum İyonofor A23187 </td><td>Sigma</td><td>C75-22-1mg</td><td> Ionophore, 400 &micro eklenerek bir tozdan yapıldı; l&nbsp; iyonofor şişesine taze% 100 DMSO ve -20 ° C'de tutulur; C Not: iyonoforu 3 aylık son kullanma tarihinden başarıyla sonra kullandık </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>Sigma</td><td>D2650 CAS# 67-68-5</td><td> </td></tr><tr><td> Asetik Asit </td><td>VWR</td><td>BDH3094-2 CAS# 64-19-7</td><td> </td></tr><tr><td> Susuz Sodyum Karbonat </td><td>Sigma</td><td>222321 CAS # 497-19-8</td><td> </td></tr><tr><td> Sodyum Klorür </td><td>Sigma</td><td>71376 CAS# 7647-14-5</td><td> </td></tr><tr><td> Hidroklorik Asit </td><td>VWR</td><td>BDH3026 CAS# 7647-01-0</td><td> </td></tr><tr><td> Referans Tamponu, pH 7 </td><td>VWR</td><td>BDH5046</td><td> </td></tr><tr><td> Referans Tamponu, pH 10 </td><td>VWR</td><td>BDH5072</td><td> </td></tr><tr><td> Referans Tamponu, pH 4 </td><td>VWR</td><td>BDH5018</td><td> </td></tr><tr><td> pH elektrodu depolama çözümü </td><td>VWR</td><td>14002-828</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Equipment:</td></tr><tr><td> DU 7500 Spektrofotometre </td><td>Beckmann</td><td>Artık satılmadı</td><td> </td></tr><tr><td> Synergy 2 plaka okuyucu Gen5 Mikroplaka Veri Toplama ve Analiz Yazılımını Kullanır </td><td>BioTek</td><td>Modül S</td><td> </td></tr><tr><td> Hematocytometer </td><td>Hausser Scientific</td><td> 3110</s></td><td> </td></tr><tr><td> 7 x&nbsp; 7 CER HOT/STIR, 120 V Kombinasyon sıcak plaka/manyetik karıştırma plakası </td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td> </td></tr><tr><td> Doku kültürü su banyosu </td><td>VWR</td><td>Model# 89032-206</td><td> </td></tr><tr><td> Doku Kültürü biyolojik güvenlik kabini SafeGARD (TC davlumbaz) </td><td>Fırıncı Şirketi</td><td>Model# SG403A-HE</td><td> </td></tr><tr><td> Doku kültürü inkübatörü </td><td>ThermoScientific</td><td>Model# 3598</td><td> </td></tr><tr><td> Pipetman </td><td>VWR</td><td></td><td> Aralık: P2-P1000 </td></tr><tr><td> Balance </td><td>Mettler Toledo</td><td>Model# AG204</td><td> </td></tr><tr><td> pH metre </td><td>Symphony/VWR</td><td>Model# SB70P</td><td> </td></tr><tr><td> Pipet-Aid </td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-100</td><td> </td></tr><tr><td> Combitip dağıtıcı </td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">Recipes:</td></tr><tr><td> Asetat Tamponu, pH 4.4 </td><td>0.12 M asetik asit yapın ve 10 N NaOH ile pH 4.4'e titre edin. Bu, 1 L MilliQ suya 5,3 ml buzlu asetik asittir: (1 L)*(0,12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1,37 g) = 5,3 ml, çünkü buzulun yoğunluğu 1,37 g/ml'dir</td><td>Otoklavlanmış cam şişeye steril filtre</td><td></td></tr><tr><td> Substrate (4-MU) </td><td>Sigma M-2133, 250 mg, C < altı > 18 < / alt >H < alt > 21 < / alt > NO < alt > 8 < / alt >, FW 379.4 CAS (37067-30-4) -20 derece saklayın; C Stok: DMSO'da 0.12 M (1 ml DMSO'da 46 mg), 37 °C'ye kadar sıcak; C, girdap, sonikat 10 dk. ılık su ile su banyosu sonikatöründe, tekrar girdap</td><td>Her deney için, asetat tamponunda 1.2 mM'lik nihai konsantrasyon için asetat tamponunda (100x seyreltme) taze substrat çözeltisi yapın</td><td></td></tr><tr><td> Glisin Karbonat Tamponu, pH 10 </td><td>26.7 g glisin 47.1 g susuz sodyum karbonat 1 L için deiyonize su ekleyin, ve pH'ı 10</td><td>Steril filtreyi otoklavlanmış cam şişeye</td><td></td></tr><tr><td> Tyrodes (2 L), pH 7.4 </td><td>135 mM NaCl: 15.78 g (veya 270 ml 1 M) 5 mM KCl: 10 ml 1 M stok 1.8 mM CaCl2: 7,20 ml 0,5 M stok 1 mM MgCl2: 4,00 ml 0,5 M stok 5,6 mM glikoz: 2,02 g (11,2 ml 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml 1 M stok ~ 9.7-7.4 <td>align="center">Otoklavlanmış cam şişeye steril filtre</td><td></td></tr><tr><td> RBL Cell Media </td><td>Fetal sığır serumunu çözün (FBS, -20 ° C'de saklanır; C) 37 &°C'de yaklaşık 4 saat; C su banyosu Standart steril tekniği takip edin L-glutamin ile (Earle' ile) 1 L minimum esansiyel ortam (MEM) çıkarın 800 ml MEM elde etmek için biraz MEM dökün, 200 mL ılık FBS ekleyin Steril pipet ile 1 L ortama 1 ml gentamisin sülfat antibiyotik ekleyin Sadece otoklavlanmış ve yalnızca hücre kültürü kullanımı için işaretlenmiş ortam şişelerini kullanın.</td><td>Steril filtre (0,2 mm) otoklavlanmış cam şişeye</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kullanılan plastik malzeme:</td></tr><tr><td> 200 &micro; l&nbsp; 96 raflı tek kullanımlık steril pipet uçları </td><td>VWR</td><td>53509-009</td><td> polipropilen </td></tr><tr><td> 1.000 &mikro; l&nbsp; HighRecovery </td><td>VWR</td><td>89003-420</td><td> polietilen </td></tr><tr><td> 10 &micro; l&nbsp; mikro uç düşük bağlayıcı steril </td><td>VWR</td><td>14217-704</td><td> polipropilen </td></tr><tr><td> Yüksek G kuvveti için tek kullanımlık/konik mikrosantrifüj tüpleri </td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td> polipropilen </td></tr><tr><td> Tek kullanımlık/dereceli/konik/steril 50 ml&nbsp; vidalı kapaklı santrifüj tüpleri </td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td> polipropilen </td></tr><tr><td> Tek kullanımlık/dereceli/konik/steril 15 ml&nbsp; vidalı kapaklı santrifüj tüpleri </td><td>VWR</td><td>21008-103</p</td><td>> polipropilen </td></tr><tr><td> CELLSTAR Doku Kültürü İşlem Görmüş T-25 Filtre Kapaklı Şişe </td><td>Greiner Bio One</td><td>690175</td><td> polistiren </td></tr><tr><td> CELLSTAR Doku Kültürü İşlem Görmüş T-75 Şişesi, Filtre Kapaklı </td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td> polistiren </td></tr><tr><td> CELLSTAR 10 ml&nbsp; Kağıt/Plastik Sarılı Serolojik Pipet </td><td>Greiner Bio One</td><td>607180</td><td> polistiren </td></tr><tr><td> CELLSTAR 2 ml&nbsp; Kağıt/Plastik Sarılı Serolojik Pipet </td><td>Greiner Bio One</td><td>710180</td><td> polistiren </td></tr><tr><td> CELLSTAR 5 ml&nbsp; Kağıt/Plastik Sargılı Serolojik Pipet </td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td> polistiren </td></tr><tr><td> CELLSTAR 25 ml&nbsp; Kağıt / Plastik Sarılı Serolojik Pipet </td><td>Greiner Bio One</td><td>760180</td><td> polistiren </td></tr><tr><td> 1 cm küvet </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> polistiren </td></tr><tr><td> CELLSTAR, 96W Mikroplaka, Doku Kültürü İşlemli, Siyah, Kapaklı 96 oyuklu Plaka </td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td> polistiren </td></tr><tr><td> Combitips </td><td>Eppendorf</td><td> 022266501</td><td> Polipropilen/ polietilen </td></tr></tbody></table>

organik solvent kullanımı olmadan triklosan etkileri: rbl-2h3 mast hücre degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir mikroplaka testi

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast hücreleri alerjik hastalık ve parazitlere karşı bağışıklık önemli rol oynamaktadır. Bir kez (bir alerjen tarafından gibi) aktif, onlar degranüle, bir süreç bu alerjik aracıların ekzositoz ile sonuçlanır. Ilaç ve toksik maddeler ile mast hücre degranülasyonu modülasyonu insan sağlığı üzerinde olumlu veya olumsuz etkileri olabilir. Mast hücre fonksiyonu fare bazofilik lösemi mast hücrelerinin kullanımı (RBL-2H3), 3-5 insan mukozal mast hücrelerinin yaygın olarak kabul modeli ile ayrıntılı olarak disseke edildi. 6 mast hücrelerinden histamin ile birlikte doğrusal olarak serbest bırakılır, mast hücre granül bileşen ve alerjik aracı β-heksosaminidaz, kolay ve güvenilir için uygun olan bir mikroplaka deneyinde ölçülebilir floresans yoğunluğunu verecek şekilde bir florojenik substrat ile reaksiyon yoluyla ölçülebilir yüksek verimli çalışmaları 1. Başlangıçta Naal ve ark. 1 tarafından yayınlanan, böylece tarama o için bu tahlil degranülasyonu uyarlanmışf ilaç ve toksik maddeler ve burada kullanımı göstermektedir. Triklosan birçok üründe mevcut olan ve bu etkinin mekanizması bilinmemektedir, ancak, insan 7-11 alerjik deri hastalığı tedavi edici bir yardımcı olduğu bulunmuştur geniş spektrumlu bir antibakteriyel maddedir. Burada, mast hücre degranülasyonu üzerinde triklosan etkisi için bir analiz gösterilmektedir. Biz son zamanlarda triklosan güçlü mast hücre fonksiyonu 2 etkilediğini gösterdi. Bir organik çözücü kullanımını önlemek için bir çaba olarak, triklosan ısı ve karıştırma ile bir sulu tampon halinde doğrudan eritildi ve elde edilen konsantrasyon 12 (ε 280 = 4.200 L / M / cm kullanılarak), UV-VIS spektrofotometresi kullanılarak teyit edilir. Bu protokol, daha genel olarak da bir alerjik potansiyel mast hücre degranülasyonunu üzerindeki etkilerini belirlemek için çeşitli kimyasalları ile kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir ve.

50 kadar ısıtıldığında ° C de 90 dakika boyunca, ASR UV Vis absorbans spektrumu Şekil 1 &#39;de gösterilen, 280 nm&#39;de bir zirve ile yaklaşık 260 ve 300 nm arasında güçlü, hafif bir eğri, üretir. 280 nm Molar soğurma katsayısı yayınlanan 4,200 L / mol / cm 12 olduğu için UV-VIS spektrofotometresi, bu nedenle, konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilecek önemli bir araçtır. Biz TCS 50 ° C ısıtma (veriler gösterilmemiştir) ardından, tüm degranülasyonunun deney zaman dilimi içinde çözüm dışarı düşmemesi buld...

Mast hücre degranülasyonu, alerjik aracıların salınması, alerji, astım ve parazit savunmada önemlidir. Burada degranülasyonunun uyuşturucu ve toksik etkileri değerlendirmek için teknikleri 1 göstermek, yöntem son zamanlarda antibakteriyel madde triklosan 2 güçlü inhibitör etkisi sergilemeye kullandı.

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mast hücresi degranülasyonu üzerindeki kimyasal etkileri değerlendirmek için bir floresan mikroplaka testi kullanmaktır. Bu protokolde, anti-mikrobiyal ajan triklosanın inhibitör etkileri, organik bir çözücü kullanılmadan gösterilmiştir. Bu, ilk olarak mast hücrelerinin gece boyunca bağlanmalarına izin vermek için 96 oyuklu bir plakaya kaplanması ve ısıtma yoluyla organik çözücüler kullanılmadan sulu bir çözelti içinde triklosan hazırlanmasıyla elde edilir.Trian çözeltisinin konsantrasyonu daha sonra ultraviyole görünür spektroskopi kullanılarak hızlı bir şekilde belirlenir. İkinci bir adım olarak, hücreler, trian varlığında veya yokluğunda IgE eğik çizgi antijeni veya bir kalsiyum iyonofor ile uyarılır, bu da mast hücresi degranülasyon markörü beta hekzosaminidazın süpernatan içine salınmasına neden olur. Beta heksosaminidazın hücre süpernatantına salınması, floresan ürünü bir mikroplaka okuyucuda miktarı tayin edilen bir beta heksosaminidaz substratı kullanılarak ölçülür.Triklosan veya diğer test kimyasallarının mast hücresi üzerindeki etkisini ölçmek amacı ile degranülasyon sonuçları elde edilmektedir. Bu, triklosanın floresan bazlı bir mikroplaka

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, bazofil degranülasyonunu indüklemek için bir antijenin alerjik potansiyelini değerlendirmek için bir in vitro yöntemi açıklıyoruz. β-hekzosaminidaz, kimyasal aracı salınımının bir indeksi olarak kullanılır ve β-heksosaminidazın enzim aktivitesi, florojenik bir substrat kullanılarak ölçülür.

İnsanlaştırılmış Mediatör Enzim Salınım Testi: İn Vitro Bazofil Degranülasyon Yanıtını İzleyerek Test Antijeninin Alerjik Potansiyelini Taramak İçin İmmünokimyasal Bir Yöntem

Bu video, mast hücrelerinin degranülasyon aktivitesini belirlemek için bir kolorimetrik testi göstermektedir. Mast hücreleri tarafından salınan enzim, substratı hidrolize eder ve renkli bir ürün üretir. Mast hücrelerinin degranülasyon aktivitesi, hücredeki toplam enzim içeriği ile normalize edilmiş hücre dışındaki enzimlerin salınım yüzdesi olarak ölçüldü.

Bir hedef kimyasalın etkisini incelemek için mast hücresi degranülasyon testi

Bu video, CXCR4 kemokin reseptörlerini eksprese eden glioblastoma hücrelerini içeren bir hücresel testi göstermektedir. Tahlil, ajan etkileşimi üzerine floresan değişikliklerini ölçmek için kalsiyuma duyarlı bir boya kullanır ve hücresel sinyalleşme dinamikleri hakkında içgörüler sunar.

CXCR4 ile Etkileşime Giren Ajanların Tanımlanması için Hücresel Bir Test

Bu videoda, bir degranülasyon testi yoluyla nötrofil aktivasyonunu ve granül ekzositozunu izlemek için bir test gösterilmektedir. Proinflamatuar bileşikler tarafından aktive edildikten sonra, jelatinaz içeren nötrofiller içindeki sitoplazmik granüller hücre zarı ile birleşerek yüklerini boşaltır. Süpernatanttaki jelatinaz varlığı, nötrofil aktivasyonunu ve degranülasyonu doğrulayan bir florofor konjuge jelatin substratının hidrolizi yoluyla değerlendirilir.

Nötrofil Aktivasyonunu ve Jelatinaz Salınımını İzlemek için Bir Degranülasyon Testi

Erken endotel hücre (EEC) göçünün araştırılması, bazı hastalıkların patofizyolojisini anlamak ve terapötik müdahale için potansiyel olarak yeni stratejiler belirlemek için önemlidir. Aşağıdaki protokol, EEC'nin araştırılması için uyarlanmış hücre göçünü değerlendirmek için teknikleri açıklamaktadır.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Burada, antimikrobiyal aktivite için enzimleri hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için protokoller sunuyoruz. Mikroslayt difüzyon testi ve boya salım testi, kalitatif ve kantitatif enzimatik aktivite değerlendirmesi için hedef bakteri substratlarını kullanır.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Burada, izole ve fare peritoneal mast hücreleri yetiştirmek için bir protokol mevcut. Biz de onların fonksiyonel karakterizasyonu için iki protokol tarif: hücre içi ücretsiz Ca2 + toplama ve degranulation tahlil floresan bir görüntüleme dayalı yayımlanan β-hexosaminidase Renkölçer miktar üzerinde.

Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Burada, tipik olarak tip 1 alerjik reaksiyonlarda gözlenen efektör hücrelerin degranülasyonunu simüle etmek için insan IgE reseptörü ile transfected bir sıçan bazofilik lösemi hücre hattı kullanarak mediatör salınım testini sunuyoruz. Bu yöntem, alerjenlerin biyolojik aktivitesini son derece hassas, tekrarlanabilir ve uyarlanabilir bir şekilde araştırır.

Alerjen Gücü için Okuma Olarak İnsanlaştırılmış Arabulucu Sürümü Tahlil

Burada, geliştirilmiş bir kemotaksi test protokolü sunuyoruz. Bu protokolün amacı, geleneksel bakteriyel kemotaksi yöntemlerinin adımlarını ve maliyetlerini azaltmak ve bitki-mikrop etkileşimlerini anlamak için değerli bir kaynak olarak hizmet etmektir.

Kök Eksüdalarında Rhizobacterial Kemoattractants'ın Hızlı Tanımlanması için Geliştirilmiş Bir Kemotaksi Tahlili

Öğrenin, triklosanın RBL-2H3 mast hücrelerinde degranülasyon üzerindeki inhibitör etkilerini, organik solvent kullanmadan floresans mikroplaka testiyle nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, alerji ve astım tedavileri için yüksek verimli tarama olanağı sunar.

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi (Video) | JoVE Journal

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

Daha fazla video keşfet