Nicel In vitro Testi

Bu prosedürün genel amacı, statik koşullar altında in vitro olarak endotel hücrelerine yapışan nispi nötrofil sayısını ölçerek mikrovasküler endotel hücre inflamatuar aktivasyonunun derecesini belirlemektir. Bu, ilk olarak mikrovasküler endotel hücrelerinin sağlıklı birleşik tek tabakalarının ikinci adımda istenen deneysel uyaranla muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. Sağlıklı insan gönüllülerden gelen nötrofiller izole edilir ve daha sonra kalsiyum ile etiketlenir.

Daha sonra, etiketli nötrofiller endotel hücrelerine eklenir ve 20 dakika boyunca yapışmaya bırakılır, bu süre zarfında floresan spektro geometrisi ile bir ön yıkama ölçümü elde edilir. Son adımda, yapışmayan nötrofiller yıkanır, ardından bir yıkama sonrası ölçüm elde edilir. Sonuç olarak, kalsiyum etiketli nötrofillerin her tedavi koşulu altında endotel hücre tek katmanlarına yüzde ve nispi bağlılığı belirlenebilir.

Bu yöntem, farklı koşullar altında mikrovasküler endotelyal enflamatuar aktivasyonun nispi derecesini belirleyebildiğinden, insan enflamatuar biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ek olarak, bu test, test gününde lökositin mikrovasküler endotelyuma bağlanmasını içeren insan endotel bazlı hastalık süreçlerini incelemek için bir araç olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Hücrelerin çok az hücre kalıntısı ile sağlıklı bir parke taşı görünümü sergilediğini ve %100 birleşik olduklarını doğrulamak için faz kontrast mikroskobu kullanın.

HM VEC tek tabakaları tedaviye hazır olduğunda, hücreleri bir kez HBSS ile yıkayın ve daha sonra uygun kuyucuklara enflamatuar agonist olsun veya olmasın 0.3 mililitre taze mikrovasküler endotel hücre büyüme ortamı ekleyin. Burada HM VEC akciğeri, nötrofilleri izole etmek için üç saat boyunca TNF alfa ile muamele ediliyor Önce Polimorf hazırlığını kullanarak, yoğunluk gradyan çözeltisini oda sıcaklığına getirin. Daha sonra, antikoagülan bir tabaka varlığında sağlıklı bir insan gönüllüden 30 mililitre tam kan topladıktan sonra, 15 mililitrelik konik bir tüpte beş mililitre Polimorf preparatı üzerinde beş mililitre kan

Tam kanı 30 dakika boyunca 450 kez G ve 18 ila 22 santigrat derece arasında ayırın ve tüplerin iyi dengelendiğinden emin olun. Daha sonra opak pembe nötrofil tabakasının kirlenmesini önlemek için sarı plazma ve PBMC içeren tabakaları aspire edin. Nötrofilleri çıkarmak için, pipeti ve tüpü yavaşça döndürürken nötrofil tabakasını bir ila iki mililitrelik serolojik pipetle aspire edin.

Nötrofilleri birden fazla tüpten 30 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe çekin. Daha fazla kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile hacmi 50 mililitreye getirin. Hücreleri döndürdükten sonra, snat'ı aspire edin ve ardından yeniden canlandırın.

Nötrofilleri 30 saniye sonra kırmızı kan hücrelerini bitlemek için sekiz mililitre steril suda askıya alın. Sekiz mililitre hücre süspansiyonunu iki mililitre beş x kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS'ye hızlı bir şekilde ekleyin ve ardından hafifçe karıştırın. Hücreleri döndürdükten sonra, hücreleri tekrar kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS'de bir kez yıkayın, ardından peleti fenol kırmızısı olmadan 10 mililitre RPMI 1640'ta yeniden süspanse edin ve canlı hücreleri trian mavisi dışlayarak sayın.

Saydıktan sonra, yeniden askıya alınan hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve nötrofilleri fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ile mililitrede iki ila 4 milyon hücre ile seyreltin. Daha sonra hücrelere üç mikromolar konsantrasyona taze hazırlanmış kalsiyum çalışma solüsyonu ekleyin. Tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirerek hücre süspansiyonunu karıştırın ve ardından folyo ile kaplı tüpü 37 santigrat derecede inkübe edin.

30 dakika sonra, etiketli nötrofilleri santrifüjleyin ve ardından peleti 10 mililitre 37 santigrat derecede iki kez yıkayın. Fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640, ikinci santrifüjlemeden önce herhangi bir topaklanmayı gidermek için hücre süspansiyonunu 40 mikron steril bir filtreden geçirir. Nötrofilleri 10 mililitre 37 santigrat derecede yeniden süspanse edin.

Fenol kırmızısı içermez RP MI 1640. Ve sonra hücreleri bir kez daha saydıktan sonra, onları mililitrede 2 milyon hücreye seyreltin. Şimdi HM vec tek katmanlarını 0.5 mililitre 0.22 mikron filtre ile üç kez yıkayın, üçüncü yıkamadan sonra kuyucuk başına% 3 BSA içeren sterilize fenol kırmızı içermeyen RPMI 1640, ortamı aspire edin ve 0.3 mililitre hücre süspansiyonunda 600.000 kalsiyum etiketli nötrofil ekleyin veya nötrofil içermeyen 0.3 mililitre fenol kırmızı içermeyen RPMI 1640 48 oyuklu plakanın uygun kuyucuklarına daha sonra kokültürleri 20 dakika inkübe edin % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece ve daha sonra inkübasyon süresinin bitiminden hemen önce, 485 nanometre uyarma dalga boyunda ve 520 nanometre emisyon dalga boyunda bir spektrofotometrede her bir oyuğun floresan yoğunluğunu ölçün.

Ardından, ortamı çıkarmak için plakayı ters çevirin ve kalan sıvıyı çıkarmak için kağıt havluların üzerine hafifçe bastırın. Hm ve tek tabakaları ve nötrofilleri içeren kuyucukları, PBS'nin her kuyusu için 0.5 milimetre olacak şekilde kalsiyum ve magnezyum ile beş kez yıkayın. PBS'yi her seferinde aynı şekilde çıkarmak.

Kuyucukları oyuk başına 0.3 mililitre fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ile yenileyin ve ardından her bir kuyucuğun floresan yoğunluğunu az önce gösterildiği gibi ölçün. Son olarak, bu formülleri kullanarak, bir nötrofil bağlama testi kullanarak güvenilir tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kuyu başına yüzde yapışma ve nispi yapışmayı belirleyin, mikrovasküler endotel hücrelerinin sağlığının ve eş akıcılığının test gününde optimal olması önemlidir. Parke taşı görünümüne ve bir Fluor star Optima spektrofotometresindeki tek katmanların toplam akıcılığına dikkat edin.

Örneğin, floresan OD 520 nanometrenin, 10.000 ila 1 milyon etiketli nötrofil analiz edildiğinde doğrusal aralık içinde olduğunu unutmayın. İlginç bir şekilde, enflamatuar bir agonist ile tedavi edilen HM VEC akciğer tek katmanlarına daha fazla nötrofil eklendikçe, yapışma yüzdesi artar. P 38 map kinazın e selektin ekspresyonu için gerekli olduğu daha önce gösterilmiştir.

TNF'de, alfa ile muamele edilen insan endotel hücreleri ve inhibisyonu, kullanılan hücre sayısı spektrofotometrenin doğrusal aralığı içinde olduğu sürece, kuyucuklara eklenen nötrofil sayısının keyfi olduğunu göstermek için yapışan nötrofillerin sayısını azaltır. Burada, P 38 harita kinaz inhibitörü B IRB 7 96'nın yokluğunda veya varlığında TN F alfa ile muamele edilmiş HM VEC akciğer hücreleri ile bir nötrofil adezyon testi gösterilmiştir. Bu sonuçlar, P 38 mapk inhibisyonundan sonra nötrofil bağlanmasındaki nispi azalmanın benzer olduğunu göstermektedir.

Kuyu başına nötrofil sayısından bağımsız olarak, lektin, TNF alfa ile muameleden sonra endotel hücre yüzeyinde eksprese edilir ve nötrofil yüzeyinde bulunan gliko molekülleri ile elektrostatik etkileşimler yoluyla vaskülatürden nötrofilleri yakalar. Bu grafikte gösterildiği gibi, TNF alfa ile aktive edilmiş endotel hücrelerinin E selektine karşı bir antikor ile ön inkübasyonu, nötrofilleri bağlama yeteneklerinde yaklaşık% 75'lik bir azalma ile sonuçlanır. Bu testin esas olarak, bu görüntülerdeki nötrofil yapışma kaskadının ilk olaylarını değerlendirdiğini gösteren, tedavi edilmemiş ve TN ffat ile muamele edilmiş HM VEC akciğer tek tabakalarına bağlı kalsiyum etiketli nötrofiller, kontrol IgG veya E selektini ile önceden inkübe edilmiştir.

Poliklonal antikor gösterilir, yarı saydam ışık mikroskobu görüntüleri bu sütunda gösterilirken, bir floresein filtre seti kullanılarak aynı referans alanının floresan görüntüleri bu kuyucuklarda yer almaktadır. Az önce gösterildiği gibi PBS ile yıkamadan önce toplam nötrofil floresansının temsili görüntüleri bu kuyucuklarda gösterilmiştir. Az önce gösterildiği gibi PBS ile yıkandıktan sonra yapışan nötrofil floresansının temsili görüntüleri gösterilmiştir.

Not: TN FFA tedavisinden sonra s selektin poliklonal antikorunun varlığında azalan uyumdaki artış. Bu işlemi denerken, sağlıklı düşük pasaj sayılı endotel hücrelerinin kullanılması ve tam kan ve izole nötrofillerin toplandıktan sonraki iki saat içinde kullanılması önemlidir.