Hücre-malzeme Etkileşim Araştırmalar Nanogözenekli Altın Patterns mikroimalat

Bu prosedürün genel amacı, nano gözenekli altın mikro desenler üretmek ve bunların hücre kültürü ile uyumluluklarını göstermektir. Bu, önce şablon veya fotoğraf litografik maskeler oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, nano gözenekli altın için öncü alaşımı modellemek için maskelerden altın ve gümüşü birlikte püskürtmektir.

Daha sonra, altın gümüş alaşım desenleri, nano gözenekli altın kaplamalar üretmek için nitrik asit içinde alaşımlanır. Son adım, hücreleri nano gözenekli altın mikro desenler üzerinde kültürlemek ve bunları immün boyamaktır, son olarak, hücre materyali etkileşimlerini ölçmek için görüntü analizi ile birlikte floresan ve taramalı elektron mikroskobu kullanılır. Bu tekniğin, karbon nano tüpler gibi nano yapılı kaplamalar oluşturmak için diğer yöntemlere göre ana avantajı, nano gözenekli altının mikrofabrikasyon uyumluluğu, yüksek etkili yüzey alanı, karo bazlı kimya ile işlevselleştirme kolaylığı, elektriksel iletkenlik ve biyouyumluluktan yararlanmasıdır.

Bu yöntem, malzeme nanoyapısının elektriksel, mekanik, biyolojik ve kimyasal özellikler üzerindeki etkisi gibi malzeme bilimi ve biyomühendislik alanlarındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu yöntem, nano yapının hücre morfolojisi üzerindeki etkisi hakkında fikir verir. Biyosensörlerin, ilaç dağıtım sistemlerinin ve enerji depolama platformlarının geliştirilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu prosedüre, bir inç x üç inç mikroskop slaytlarını ve küçük kapak fişlerini bir piranha solüsyonu ile temizleyerek başlayın, küçük kapak fişlerini bir porselen immüno-boyama teknesine yükleyin ve tekneyi ve mikroskop slaytını pirana solüsyonuna daldırın. Temizleme prosedürüyle ilgili ayrıntılar için metin protokolüne bakın. Temizledikten sonra numuneleri kristalizasyon kaplarına aktarın ve üç dakika boyunca di su ile durulayın.

Numuneleri tüy bırakmayan havluların üzerine yerleştirin ve milimetre ölçekli desenler oluşturmak için nitrojen tabancasıyla kurutun. 250 mikron kalınlığındaki silikon elastomer levhaları biyopsi zımbası ile delin. İşlenmiş elastomer levhaları %70 izopropanol içine batırarak temizleyin ve ardından nitrojen tabancası ile kurutun.

Ardından zımba tabakasını tüy bırakmayan bir havlu üzerine yerleştirin ve temizlenmiş kapak fişlerini şablonun üzerine, örnek yüzeyi şablona bakacak şekilde hizalayın. Milimetre altı ölçekli desenler oluşturmak için şablonu kapak kızaklarıyla birlikte bir taşıyıcı gofret üzerine aktarın. Temizlenmiş bir mikroskop yerleştirin, dönen bir ayna üzerinde kaydırın ve partikülleri bir nitrojen tabancasıyla üfleyin.

Cam slaytın üzerine 1,5 mililitre hekza metil dilan dağıtın. Plastik bir pipet kullanarak, slaydı art arda 500 RPM'de beş saniye ve 1500 RPM'de 30 saniye döndürerek hekza metil dilanı yayın. Bittiğinde, slaytı 115 santigrat derecede sıcak bir tabakta yedi dakika pişirin ve ardından beş dakika soğumaya bırakın.

Ardından, dört mililitre pozitif bir fotoğraf dağıtın. Cam kızağa direnin. Daha önce açıklanan koşulları kullanarak slaytı döndürerek fotoğraf direncini yayın.

Slaytı 115 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde 1,5 dakika pişirin ve UV ışınlarına maruz kaldıktan ve piştikten sonra çıkarın. Pozlanan fotoğrafı çözün. Slaytı pozitif bir fotoğrafa batırarak direnin.

Geliştiriciye en az 3,5 dakika direnin. Bittiğinde, slaytı DI suyla iyice durulayın ve geliştirilen desenleri optik mikroskop altında inceleyin. Ardından, numuneleri bağımsız olarak altın, gümüş ve krom püskürtme biriktirebilen bir püskürtme makinesine yükleyin.

10 militorr Argonne püskürtme kromunun altında 300 dakika boyunca 10 dakika boyunca metal biriktirmeye başlamadan önce numuneleri 50 watt'ta 25 watt'ta 300 saniye boyunca temizleyin. Daha sonra 400 watt'ta 90 saniye boyunca altın püskürtün, ardından 200 watt'ta gümüş ve 100 watt'ta altın ile 10 dakika boyunca altın ve gümüşü birlikte püskürtün. Gümüş püskürtme kaynağını kapatmadan yaklaşık 10 saniye önce altın püskürtme kaynağını kapatın.

Numuneleri püskürtme makinesinden çıkardıktan sonra numuneleri püskürtme makinesinden çıkarın. Onları yaklaşık 180 mililitre pozitif bir fotoğrafta sonikleştirin. Döngüler arasında iki dakikalık duraklamalarla 10 döngü 22. sonikasyon için striptizciye direnin.

Bittiğinde, numuneleri di su ile durulayın ve bir nitrojen tabancası ile kurulayın. Metal desenleri mikroskop altında inceleyin. Ardından, biriken metali ortaya çıkarmak için iki cımbız kullanarak foto dirençli olmayan kaplamalı numunelerden elastomer şablonu soyun.

Küçük kapak fişlerini nitrik aside batırmadan önce 30 saniye boyunca 10 watt'lık hava plazması ile işlemden geçirin. De alaşım mikroskop, 15 dakika boyunca 55 santigrat derecede %70 nitrik asit içeren bir behere daldırarak kayar. Alaşımlama işlemi tamamlandıktan sonra, numuneleri art arda üç kez di su kaplarına daldırarak durulayın.

Numuneleri tüy bırakmayan havluların üzerine koyun ve nitrojen tabancasıyla kurutun. Bir sıcak plakanın sıcaklığını 150 ila 300 santigrat derece arasında ayarlayın. Ardından, ani sıcaklık değişimini en aza indirmek için numuneleri yavaşça sıcak yüzeye indirin.

Beş dakika sonra, numuneleri soğuması için sıcak plakadan çıkarın. Nano gözenekli altın örneklerini polistiren kaplara yerleştirin ve 30 saniye boyunca 10 watt'ta hava plazması ile işlemden geçirin. Daha sonra numuneleri 24 kuyulu doku kültürü plakasına aktarın.

Her birine 500 mikrolitre tam kültür ortamı ekleyin. Plakaları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de hücreleri tohumlayana kadar saklayın. Murin astrosit hücrelerini kültür ortamı ile T 75 şişelerinde tutun.

Hücreler %70 birleştiğinde, önce eski ortamı çıkararak ve hücreleri PBS ile yıkayarak bunları geçirin. Passeng koşullarıyla ilgili ayrıntılar için metin protokolüne bakın. Kültür plakalarını inkübatörden çıkardıktan sonra, harcanan ortamı kuyucuklardan aspire edin ve hücreleri camın üzerine tohumlayın.

Santimetre kare başına 25.000 hücre yoğunluğunda kapak kaymaları ve son hacmi bir mililitredir. Numuneler üzerinde homojen bir hücre kaplaması sağlamak için kültür plakasını sallayın ve hücreler analiz edilmeye hazır olduğunda kültür plakasını inkübatöre yerleştirin. Kullanılmış ortamı kuyulardan çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın.

Hücreler PBS'de% 4 para formaldehit içinde sabitlendikten ve iki kez yıkandıktan sonra, beş dakika boyunca PBS'de% 0.1 Triton X 100'ün% 500 mikrolitre içinde geçirgen. PBS yıkamasını iki kez tekrarlayın ve hücreleri temiz kuyulara aktarın. Numunelerin üzerine 80 mikrolitre boyama solüsyonu sürün ve 20 dakika boyunca alüminyum folyo ile kaplı olarak saklayın.

Başka bir PBS yıkamasının ardından, hücreleri PBS'de beş dakika boyunca üç nanomolar DPI ile boyayın. Hücreleri bir kez daha PBS ile yıkayın ve di'ye batırın, ardından hücreleri camın üzerine monte edin. Slaytları montaj ortamıyla kapatın ve şeffaf oje görüntüsüyle kapatın.

Nano gözenekli altın, ikincil bir elektron detektörü kullanarak 10 kilovolt elektron enerjisinde 50.000 x büyütmeli bir taramalı elektron mikroskobu ile yüzeyler. Bunu takiben, uygun filtre küpleri ile 10 x büyütmede ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak numunelerin farklı noktalarında kompozit hücre görüntüleri yakalayın. Resimdeki görüntüleri açın J. Görüntüleri tek tek kanallara bölün.

Bunları sekiz teklife dönüştürün. Arka planı çıkarın ve medyan filtreleme ile düzeltin. Ardından gözenekleri, hücre gövdelerini ve çekirdekleri vurgulamak için eşiği manuel olarak ayarlayın.

Birleştirilmiş gözenekleri veya hücreleri ayırmak için havza komutunu kullanın. Parçacık analizi parametrelerini ayarlayın ve parçacıkların sayısını, ortalama alanı ve parçacıkların kapsama yüzdesini çıkarmak için komutu yürütün. Son olarak, birden çok görüntünün toplu analizini gerçekleştirmek için dahil edilen makro dosyalarını değiştirin.

D alaşımlamasından önce ve sonra biriken metal desenlerin renk değişimi burada görüntülenir. Simli kaplama, alaşım üzerindeki gümüş açısından zengin alaşım içeriğinden kaynaklanmaktadır. Film gözle görülür şekilde turuncu kahverengi bir renk alır.

Burada, fotoğraf litografik tarafından üretilen daha ince özellikler gösterilmektedir. Metalin desenlenmesi. Nano gözenekli altın filmlerin ısıl işlemiyle farklı zayıf morfolojiler elde edilebilir.

Kesit görüntüsü, filmlerin film kalınlığı boyunca homojen bir şekilde alaşımlanıp alaşımlanmadığını ortaya çıkarır. Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri, boşlukların boyutunu ve kapsama yüzdesini belirlemek için ikili görüntülere bölünebilir. Bu çıktıyı oluşturmak için kod JoVE web sayfasından indirilebilir.

Nano gözenekli altın bir yüzey üzerinde kültürlenen yapışık murin astrosit hücrelerinin temsili bir floresan görüntüsü burada resmedilmiştir. Görüntünün tek tek kanalları, hücre materyali etkileşimini analiz etmek için ikili görüntüler üretmek üzere bölünebilir ve bölümlere ayrılabilir. Segmentli hücre iskeleti görüntüleri, hücre alanını ve yüzey kapsamını ölçmek için kullanılabilir.

Segmentli hücresel çekirdek görüntüleri hücre sayımı için yararlıdır. Bu çıktıları oluşturmak için kodlar JoVE web sayfasından indirilebilir. Burada, PO film yapışması, gözeneklilik olmaması ve aşırı ısıl işlem dahil olmak üzere nano gözenekli altın yapıların imalatındaki hataların görsel bir özeti gösterilmektedir.

Bu prosedürü takiben, diğer yöntemler, nanoyapı hücre adezyonunun etkisi ve gen ekspresyonunun etkisi gibi ek soruları daha fazla yanıtlamak için orman mikroskobu, hücre lizisi ve PCR'de elektrokimyasal karakterizasyon yapılmasını önermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, nano gözenekli altın desenlerinin nasıl üretileceğini ve mikroskobun dijital görüntü analizi ile hücrelerle etkileşimlerini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamalısınız. Sonuç -ları. Nitrik asit, sülfür asit ve hidrojen peroksit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman yetiştirmek de dahil olmak üzere önlemler alınması gerektiğini unutmayın.