Yetişkin Zebra Balığının Bireysel ve Sürülerini Kaydetmek için Otomatik Bir 3D İzleme Sistemi Kullanma

Bu prosedürün genel amacı, zebra balıklarının veya diğer sucul hayvanların üç boyutlu hareket modellerini incelemek ve bunların kinematik, mekânsal ve sosyal özelliklerini analiz etmektir. Bu sayede genetik mutasyonlar ya da kimyasal ve çevresel faktörler nedeniyle meydana gelen davranış değişikliklerinin tespit edilmesi mümkün olur. Bu işlem, öncelikle sistemin kalibre edilmesiyle gerçekleştirilir; bu adım aynı zamanda kırılma nedeniyle oluşan belirgin görüntü bozulmalarını da düzeltir.

İkinci adım, nispeten yüksek zamansal çözünürlükte video karelerini aynı anda en az iki farklı açıdan kaydetmektir. Ardından, yazılım balıkların yörüngelerini yeniden oluşturur. Gürültü etkisini azaltmak ve örtüşme veya kümelenme meydana geldiğinde balığın konumunu belirlemek için gelişmiş algoritmalar uygulanır.

Son adım, verilerin analiz edilmesi ve hızlanma, dönüş açısı, gözlem kabındaki yatay ve dikey dağılım, bireyler arası mesafeler ve ilgi duyulan diğer parametreler için istatistiksel analizlerin gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, yüksek hızlı kalibre edilmiş 3D takip, mutant zebrafish'lerdeki davranışsal eksiklikleri ve ilaçların çeşitli davranışsal sistemler üzerindeki etkilerini incelemek için yararlıdır. İlaç keşfi amacıyla, sistemin bir avantajı, balıkların davranışlarının 3D olarak incelenmesine olanak tanımasıdır.

Balıkların doğal olarak üç boyutta hareket etmeleri ve birden fazla balığın aynı anda kaydedildiği durumlarda, grubun uzamsal konfigürasyonlarını incelerken 2D kaydın oldukça yanıltıcı olabilmesi nedeniyle bu durum önemlidir. Sistemin bir diğer avantajı ise, düzeltilmediği takdirde mevcut konfigürasyonunda önemli ölçüm hatalarına yol açabilen ışık kırılmasını düzeltmesidir. Zebra balıklarını içeren gözlem kabı, gözlem odasına yerleştirilmiştir.

Hazne ayrıca bir kamera, kabın üzerinde yaklaşık 45 derecelik açıyla asılı duran bir ayna ve LED ışık çubukları içerir. Kayda başlamadan önce, kap duvarı ve su yüzeyi konumlarını ve kaydedilen karelerin ölçeklendirme faktörünü belirlemek için sistemi kalibre edin; ayrıca ışığın sudan havaya geçerken oluşturduğu kırılma hatasını da düzeltin. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, cansız bir balıkla deneme çalışması yapılmalıdır.

Ayna veya kamera konumları kaymışsa ya da izleme ile ilgili sorunlar yaşanıyorsa yeniden kalibrasyon yapılmalıdır. Bir kayıt oturumuna başlamak için, işaretlere kadar suyla doldurulmuş gözlem kabını gözlem haznesine yerleştirin. Kabın ayakları hizalama deliklerine yerleştirilmelidir.

Yarı şeffaf veya opak duvarlar, kamera bakış açısına göre uzak tarafa ve sağa bakacak şekilde kapları yerleştirin. Ardından, bölmedeki ışıkları açın, balıkları kabın içine koyun ve perdeleri kapatın. Kayıt modülünü açtığınızda, kabın ön ve üstten görünüm görüntüleri ekranda belirecektir.

Başlangıçta, elde edilen görüntü ideal olmayabilir ve bu nedenle balık ile arka plan arasında yeterli kontrast sağlamak için bazı ayarlamalar gerekebilir. Görüntüyü ayarlamak için kamera kontrolünü seçin ve ardından açılan genel ayarlar penceresinde burada gösterilen kutucukların işaretini kaldırın; ardından görüntünün aşırı pozlanmaması için perde hızını (shutter) ve kazancı (gain) ayarlayın. Sonra, kamera kontrol penceresinin sol tarafında beyaz dengesi rengini seçin ve yeni pencerede otomatik (auto) kutucuğunun işaretini kaldırarak hem ön hem de üst görünümde en iyi renk kontrastını elde etmek için kırmızı ve mavi değerlerini ayarlayın.

Ayarlamalar tamamlandıktan sonra birden fazla düzeltme yapılması gerekebilir. Kayıt modülünün ana menüsünden, bir klasör oluşturmak veya seçmek için veri konumunu seçin. Her kaydın, deney klasörünün bir alt klasörü olması gereken kendine ait bir klasörü olmalıdır.

Şimdi kaydı başlat düğmesine basın ve kayıt süresi için dakika cinsinden bir tam sayı girin, ardından tamam düğmesine basın; böylece deneysel kayıt oturumu başlayacaktır. Kayıtlar tamamlandığında, yol yeniden yapılandırmasını başlatmak için kalibrasyon klasöründeki hayvan konteyner verilerini ve yazışma verileri alt klasörlerini, daha önce kayıt sırasında oluşturulan klasörlere kopyalayıp yapıştırın. Ardından yazılımın trajektori modülünü açın. Daha sonra, kayıt modülü ile oluşturulan klasörü seçmek için veri konumu düğmesine basın.

Ardından, önce parametreler penceresini açmak için sistem kurulum düğmesine basın ve üst uç alt görünüm renk eşiklerini ayarlayın. 1000 iyi bir başlangıç değeridir. Daha sonra, üst uç, alt görünüm boyut eşiklerini seçin.

Orta büyüklükteki bir zebra balığı için uygun bir başlangıç boyutu 10'dur; büyük bir balık için 20, küçük bir balık için ise 5 kullanın. Bu eşik değerleri ne kadar yüksek olursa, yazılımın gürültüyü algılama olasılığı o kadar azalır. Ancak, değer çok yüksek olduğunda, yazılım balığı tespit edemeyebilir.

Deneyin ilerleyen aşamalarında bu eşik değerlerini yeniden ayarlamak gerekebilir. Üst boyut eşiği için genellikle 3000 değeri yeterlidir. Özgül uzunluk için ise 220 olan ön ayarlı değeri koruyun.

Balık sayısı, gözlem tankındaki balık sayısını ifade eder. Maksimum nokta sayısı, toplam kare sayısını ifade eder; bu sayıyı kaydedin veya aklınızda tutun ve Tamam'a basın. Ardından, arka planı edin seçeneğini belirleyin.

Bir sonraki pencerede iki alanın doldurulması istenecektir. Arka plan yüklendikten sonra, farenizi kullanarak üç kırmızı kutuyu ayarlayın; bu kutular, yazılımın balıkları aradığı alanları belirler. Soldaki kutuyu küçültün.

Yan görünüm yalnızca kalibrasyon için kullanıldığından, şimdi yörüngeleri oluşturmaya başla düğmesine basın ve yol yeniden yapılandırması başlayacaktır. İdeal olarak, etiket balığın görüntüsü üzerine yerleştirilmelidir; eğer etiket sıklıkla yanlış yerleştiriliyorsa, bilgi penceresini açın. Burada, yalnızca balığın ana hatlarının görüldüğü ideal bir durumu görüyoruz.

Aşırı gürültü oluşması durumunda, ana menüden durdur düğmesine basın ve yeni renk ve boyut eşik değerleri seçin. Ayrıca, kırmızı kutucukların hafifçe küçültülüp küçültülemeyeceğini kontrol edin. Örneğin, üst kısımda su hareketlerinin oluşturduğu gürültüyü hariç tutmak için 3D ekrandaki yörüngeyi izleyin.

Fare ile sağ tıklayarak, araştırmacı 3B konfigürasyonun döndürülmesi veya ötelenmesi arasında seçim yapabilir. Veri işlemeye başlamak için veri işleme modülünü açın, araç çubuğundan projeyi seçin ve ardından açılır menüden yeniyi seçip bir deney adı girin. Ardından, projeyi düzenle seçeneğini seçin.

Ardından projeye ekleyin, ardından yeni grup seçeneğini seçin ve deneysel grup için bir isim girin. Şimdi sağ penceredeki deneysel grubu seçin. Araç çubuğunun değişeceğini unutmayın.

Düzenleme grubunu seçin, ardından gruba ekle ve sonrasında yeni ölçümler seçeneklerini belirleyin. Bu işlem bir tarayıcı penceresi açacaktır. Ardından, kayıt sırasında oluşturulan klasörü açın, trajectories alt klasörünü seçin ve ardından point smoothened dosyasını seçin.

Burada grup A için sunulan örnekte altı dosya, grup B için ise dört dosya yüklenmiştir. Analize başlamak için sağ penceredeki düzleştirilmiş nokta dosyasını seçin. Ardından açılır menüden veri işlemeyi ve tek değerli uç noktaları seçin.

Örnekleme amacıyla, süreye bağlı dondurma (duration freezing) seçeneğini belirleyin. Programa aşina olmanız için hız eşiği ve süre eşiği cinsinden dondurma ayarlarını belirtmenizi sağlayacak bir pencere açılacaktır. Derinlik seviyesi sayısının ve burst frekansının belirlenmesine olanak tanıyan yol katetme mesafesi derinlik dağılımı (travel distance depth distribution) gibi diğer örnekleri deneyin.

Bu seçenek seçildiğinde, varsayılan yaklaşık 200 uç nokta eşiği kullanılarak toplu işlem hesaplamaları gerçekleştirilecektir. Varsayılan ifadesi, sınırlandırıcıların belirlenmiş olduğu anlamına gelir. Örneğin, şu anda derinlik dağılımı üç derinlik seviyesi için ve açısal dağılım dört bölüm için hesaplanmaktadır.

Parametreler oluşturulduktan sonra, oluşturulacak dosyanın konumunu ve adını isteyen yeni bir pencere açılacaktır. Bunlar CSV formatında kaydedilecek ve diğer yazılımlara aktarılabilecektir. Burada, Şekil A kontrol için tipik bir örnek kareyi göstermektedir.

Zebra balığı, şekil B ise sabah oturumu sırasında kaydedilen, MK 801 ile işlem görmüş zebra balıkları için tipik bir örnek kareyi göstermektedir. Kontrol grubundaki zebra balıklarının tabana yakın ve birbirlerine yakın oldukları görülmektedir. Buna karşılık, MK 801 uygulanan zebra balıkları üst kısma yakın konumdaydılar ve birbirlerinden önemli ölçüde uzak yüzdüler.

Burada, kontrol grubu zebra balıkları ile 10 µM MK 801 ile tedavi edilen zebra balıkları için bir sabah oturumu ve bir öğleden sonra oturumuna ait iki temsilci yörünge sunulmuştur. Bu şekilde, kontroller ve 10 µM MK 801 ile tedavi edilen balıklar için her iki oturuma ait ortalama sosyal mesafeler sunulmakta olup, burada her iki grup için ortalama bireyler arası mesafelerin zaman çizelgeleri verilmiştir.

Şekil A'da, sabah oturumu için zebra balığının 10 eşit derinlik seviyesindeki dağılımını ve B'de, öğleden sonraki oturum için dağılımı görüyoruz. Deney gruplarının dört radyal zon üzerindeki zamansal dağılımı burada görülmektedir. Küçük resim, bu zonların merkezden çevreye doğru konumlarını göstermekte olup, burada deney gruplarının dört kadran üzerindeki zamansal dağılımını görüyoruz.

Küçük resim kadranların konumunu göstermektedir. Çift çizgiler beyaz duvarları, tek çizgiler ise şeffaf duvarları temsil eder. Kamera, küçük resmin solunda, yani birinci ve dördüncü kadranlara en yakın konumda yer almaktadır.

Siyah yıldızlar sabah oturumundaki gruplar arasındaki karşılaştırmaları, gri yıldızlar ise öğleden sonraki oturumlardaki karşılaştırmaları belirtmektedir. Son olarak, zebra balığının sabah ve öğleden sonraki oturumlardaki katettiği mesafenin X, Y, Z bileşenleri burada gösterilmiştir. Ortalama ve standart hata ortalaması sunulmuştur.

Sistemle çalışırken, verilerin kalitesinin kayıt kalitesine bağlı olduğunu unutmayın; bu nedenle sistemin iyi kalibre edildiğinden ve kamera ayarlarının optimal olduğundan emin olun. Geri kalanı kolaydır ve yalnızca farklı adımlara aşina olma meselesidir.