Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü Escherichia coli Ve Vibrio cholerae

Bu prosedürün genel amacı, aynı gün içinde hızlı ve rahat bir şekilde yetkin bakteriler üretmektir. Dönüşüm için onlara ihtiyaç var. Bu, bakterilerin önce LB agar üzerine kaplanması ve dört ila altı saat boyunca inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir.

Daha sonra, bakteri çimi agarın yüzeyinden dikkatlice toplanır ve pelet steril soğuk su veya tampon içinde yeniden süspanse edilir. Daha sonra bakteri peleti dört santigrat derecede üç kez yıkanır ve 40 mikrolitre içinde yeniden süspanse edilir. Son olarak, yetkili hücreler DNA varlığında elektroporasyona tabi tutulur.

Sonuç olarak, önemli miktarda ekipman, büyük hacimli bakteri kültürleri ve steril tamponlar gerektiren geleneksel yöntem kullanılarak elde edilenlerle karşılaştırılabilir bakteri dönüşümü seviyeleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, büyük santrifüjlere, rotorlara veya steril tamponların ve kültürlerin liderlerine ihtiyaç duymadan dönüşümün planlandığı gün herhangi bir laboratuvar suşundan hemen hemen taze, yetkin bakterilerin hazırlanabilmesidir Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler çok fazla mücadele etmeyecektir çünkü bu, bakteriyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan tekniklerin kısa bir varyasyonudur. Bu protokolün yaratıcısı, zaman içinde çok sayıda araştırmacı tarafından kullanıldığı ve optimize edildiği için tanımlanamaz.

Burada sunulan yöntem laboratuvarlarımızda yaklaşık yirmi yıldır kullanılmaktadır ve bu faydalı protokolü meslektaşlarımızla paylaşmak hedefimizdir. Bu yöntemin görsel gösterimi bir adım için önemlidir. Özellikle, burgu üzerindeki çimlerden bakteri toplanması nedeniyle plaka üzerindeki büyümeyi değerlendirmek deneyimli bir göz gerektirir.

Ve bu en iyi şekilde görselleştirilir. Prosedürü gösteren, Kanada, Edmonton'daki Alberta Üniversitesi'ndeki Dr.Te Koski'nin laboratuvarından bir araştırma görevlisi olan Bayan Theresa Brooks'tur. Öğleden sonra geç saatlerde bakteri kültürü hazırlığına başlamak için, steril bo silikat cam test tüplerinde bir ila beş mililitre otoklav LB suyunu aşılamak için az miktarda e coli veya v coray kullanın.

Aşılanmış test tüplerini bir silindir tamburuna yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede ve yüksek hızda inkübe edin. Çubuğun ortasını bir bunsen brülörünün alevinde cam yumuşayana kadar ısıtarak bir cam çubuktan hokey sopası şeklinde bir hücre yayıcı hazırlayın. Ardından, virajı nazikçe 135 derecelik bir açıyla yönlendirmek için cımbız veya pense kullanın.

Çubuğu uç ile ilk büküm arasındaki orta noktada bir kez daha ısıtın ve içe doğru 45 derecelik bir açıyla bükün. Antibiyotikli ve antibiyotiksiz lb havalandırıcılar hazırlayın ve dört santigrat derecede saklayın. Ertesi sabah.

Her bir LB agar plakasına 100 mikrolitre gece boyunca kültür koyun. Hücre yayıcıyı kullanarak, plakayı 37 santigrat derecede dört ila altı saat veya ince bir bakteri üremesi çimi görünür hale gelene kadar inkübe edin. Bir aşılama halkası kullanarak, plakadan yaklaşık iki milimetre çapında bir bakteri kütlesi toplayın ve bir mililitre buz gibi soğukta tekrar askıya alın.

İki milimolar kalsiyum klorür. Dört santigrat dereceye ayarlanmış bir soğutulmuş santrifüj kullanarak e coli için v coray veya steril çift damıtılmış su kullanıyorsanız, süspansiyonu 5.000 Gs'de beş dakika döndürün. Son süpernatan resüsü çıkardıktan sonra, peleti 40 mikrolitre kalsiyum klorür veya iki kez damıtılmış suda askıya alın ve buz üzerinde tutun.

Bir dönüşümü gerçekleştirmek için, 40 mikrolitrelik bakteri süspansiyonuna bir mikrograma kadar plazma DNA'sı ekleyin ve karışımı önceden soğutulmuş steril 0.2 santimetre boşluğa aktarın. Vete, vete'yi nabız kontrol modülünün elektroporasyon odasına yerleştirin ve 1.8 kilovolt ve 25 mikro phs'de yedik. Zaman sabiti yaklaşık 5.0 milisaniye olmalı ve ark oluşmamalıdır.

Hücreleri bir mililitre LB suyunda hızlı bir şekilde yeniden süspanse edin ve daha önce otoklav ızgara camı test tüpüne aktarın. Antibiyotik seçimi olmadan 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede havalandırılmış büyüme koşullarında inkübe ederek hücrelerin iyileşmesine izin verin. Bakterileri antibiyotikli LB ager plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Burada gösterildiği gibi, hızlı metodolojimizin dönüşüm verimliliğini, elektro yetkin bakterilerin hazırlanması için orijinal olarak doer ve arkadaşları tarafından tanımlanan geleneksel yöntemin bir uyarlaması ile karşılaştırmak için e coli ve V co dizisi ile bir dizi dönüşüm gerçekleştirdik. Dönüştürücü verim, e coli ve v coray için üç, tekrarlanan deneylerde mikrogram DNA aralığı başına altıncı CFU'nun altıncı ila 10'u arasındaydı. Elektro yeterlilik için geleneksel yöntemi kullanmak.

Hücre hazırlama, dönüştürücü verim, hızlı yöntem kullanılarak e coli ve v coray için üç tekrar deneyinde DNA'nın mikrogramı başına 10'a 10'a, beşinciye, 10'a altıncı CFU'ya on kat azalmış gibi göründü. Bu nedenle, dönüştürülmüş bakterilerin yüzdesini, dönüştürülmüş CFU'ları, aksi takdirde aynı yetkin hücre gruplarından sahte dönüşümlerden geri kazanılan CFU'ların sayısına bölerek belirledik. Dönüştürülmüş bakterilerin yüzdesi bir günlük içindeydi.

Hazırlama yöntemi ve dönüştürülen türlerden bağımsız olarak. Bu sonuçlar, hızlı yöntemin etkinliğinin, yetkin hücrelerin hazırlanmasına yönelik geleneksel daha uzun prosedürle karşılaştırılabilir olduğunu ve ieo, coray ve esia coli'nin temsili suşlarının hızlı prosedüre eşit derecede uygun olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik beş ila altı saat içinde yapılabilir ve düzgün bir şekilde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, bakterileri logaritmik büyüme evreleri sırasında hasat etmeyi, steril, taze hazırlanmış ve önceden soğutulmuş tampon su çözeltisinde yıkamayı ve elektroporasyonu geçtikten sonra LB'de yeniden süspanse olana kadar soğuk tutmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, laboratuvarınızda elektro yetkin bakteri suşuna özgü hücreleri, açılış çimlerinde yetiştirerek, büyümenin logaritmik aşamasında toplayarak ve daha sonra elektroporasyona hazırlık olarak soğuk tamponda yıkayarak nasıl hızlı bir şekilde oluşturacağınızı iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.