Golgi-Cox Boyama ile dendritik morfoloji ve sinaptik bağlantı üzerinde olumlu bir Erken Deneyimi, Tactile uyarılması Etkileri, görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, yaşamın erken dönemindeki dokunsal stimülasyonu takiben nöronlarda meydana gelen morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için altın G Cox boyama tekniklerini kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle postnatal üçüncü günden postnatal 21. güne kadar günde üç kez dokunsal stimülasyon uygulanarak gerçekleştirilir. İkinci adım ise, hayvanlar inceleme yaşına ulaştığında perfüze edilmeleri ve beyinlerinin Goldy cos solüsyonunda saklanmasıdır.

Ardından, beyinler Aome ile dilimlenir. Son adım, beyinlerin GOGI eş boyama tekniği ile emdirilmesidir. Nihayetinde, GOGI eş prosedürü, morfolojik değişikliklerin analizine olanak tanıyan bireysel nöronların görselleştirilmesi için kullanılır.

Goy Cox tekniğinin güzelliği, nöronların yapısını nicel olarak belirlememize ve bunu davranışsal sonuçlarla ilişkilendirmemize olanak tanımasıdır. Bu tekniğin etkileri gelişimsel bozukluklara kadar uzanmaktadır; zira taktil stimülasyonun bu bozuklukların hem davranışsal hem de anatomik iyileşmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Bu yöntem sıçanların nöroanatomisi hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer model organizmalara ve insan beyin dokusuna da uygulanabilir.

Deneyim bağımlı plastisiteye dair anlayışımızı geliştirmek için hayvanlar, doğumdan sonra yiyecek ve suya serbest erişimle birlikte 12 saatlik ışık-karanlık döngüsünde tutulur. Her dişi sıçan, yavrularıyla birlikte ayrı olarak barındırılır. Tutma/taşıma ile ilgili ek stresleri önlemek için yavrular, P 3'ten itibaren taktil stimülasyon alır.

Yavruları sabahki taktil stimülasyon seansından önce tarttıktan sonra, yavruları kendi kafesleriyle birlikte ayrı bir test odasına taşıyın. Ev kafesini 24 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin. Taktil stimülasyona hazır olunduğunda, anneleri ev kafesinden çıkarın ve yiyecek ile su bulunan geçici bir kafese yerleştirin.

Damı ve geçici kafesi yetiştirme odasında tutun. Ardından, ana kafesi iki yarıya bölmek için sert bir levha kullanın. Daha sonra, her batımdaki yavruların yarısını rastgele dokunsal stimülasyona tabi tutulmak üzere atayın; diğer yarı ise kontrol grubu olarak hizmet etsin.

Grupları ayırt etmek için yavruların arka bacaklarını ve kuyruklarını kalıcı bir markör ile işaretleyin; taktil stimülasyon grubundaki yavruları kafesin bir tarafına, kontrol grubundaki yavruları ise diğer tarafına yerleştirin. Yumuşak bir tüy tozlayıcı kullanarak 15 dakikaya ayarlanmış bir zamanlayıcı kurun. Taktil stimülasyon grubundaki tüm yavruları 15 dakika boyunca kesintisiz olarak aynı anda fırçalayın.

Genç sıçan yavruları genellikle birbirlerine sokulurlar ve derin bir uyku döngüsüne girmiş gibi görünürler, bu da tüm yavruları aynı anda uyarmayı oldukça kolaylaştırır. Yavrular büyüdükçe, bazılarının yürümesi ve çevreyi keşfetmesiyle daha aktif hale gelirler. Seans sırasında, her yavrunun eşit miktarda uyarıldığından emin olmak için etrafta dolaşan yavruları grubun içine geri taşıyın.

15 dakikalık taktil stimülasyonun ardından, anneyi kafesine geri yerleştirin ve kafesi tekrar üretim odasına taşıyın. Bu işlem günde üç kez tekrarlanır. Son taktil stimülasyon seansından sonraki 19. günde, yavruları annelerinden ayırın. Yavrular, aynı cinsiyetten beş veya altı diğer sütten kesilmiş hayvanın bulunduğu kafeslerde barındırılır; sıçanlar, inceleme yaşına gelene kadar standart barındırma koşulları altında rahatsız edilmeden bırakılır.

Hayvanlar 100 günlük olduğunda örnekler toplanır. Ötanazi ve intrakardiyak perfüzyonun ardından beyin çıkarılır. Bu işlem sırasında serebellumun bütünlüğünün korunmasına dikkat edilir.

Beyinleri, 20 mililitre Goldy Cox çözeltisi ile doldurulmuş opak bir Nalgene şişeye yerleştirin ve burada 14 gün boyunca bekletin. 14 gün sonra, çözeltiyi %30'luk bir sukroz çözeltisi ile değiştirin. Kesit alma işlemine geçmeden önce beyinleri iki ila beş gün boyunca sukroz çözeltisinde tutun.

Yırtılmaları veya düzensiz kesimleri önlemek için beyni, Sano akrilik yapıştırıcı ile kesim tablasına sabitlemeden önce kurulayın; tüm beynin tablaya sıkıca sabitlendiğinden emin olun. Ardından, Vibram rezervuarını kesim bıçağını örtecek şekilde %6 sukroz çözeltisi ile doldurun. Vibram hızını ve genliğini beşe ayarlayın.

Beyni 200 mikron kalınlığında kesitlere ayırın ve kesitleri %2 jelatinize edilmiş bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. İlgili tüm kesitler toplanana kadar, kesme işlemi boyunca kesitlerin ıslak kaldığından emin olun. Nemlendirilmiş bir kağıt yardımıyla baskı uygulayarak kesitleri lamların üzerine sabitleyin.

Lamları bir lam rafına yerleştirin ve en az 12 saat, ancak dört günden daha uzun olmayan bir süre boyunca nem odasında saklayın. Boyama prosedürüne başlamak için 12 adet cam boyama kabını etiketleyin ve hazırlayın. İlk olarak, lamları bir dakika boyunca distile su içerisinde bekletin.

Ardından, lamları amonyum hidroksit içerisine yerleştirin ve 30 dakika boyunca karanlıkta tutun. Distile suda bir dakika daha beklettikten sonra, lamları ışık koruması altında 30 dakika boyunca Kodak Fix içerisine yerleştirin. Artan konsantrasyonlu alkol çözeltileri serisiyleledehidratasyona tabi tutmadan önce lamları bir kez daha distile suya yerleştirin.

Son alkol yıkamasından sonra, lamları 15 dakika boyunca bir üçüncü çözeltiye yerleştirin. Son olarak, lamları 15 dakika boyunca hemo D içerisine yerleştirin. Hazır olduğunda, lamların üzerine lamel kapatmak için paramount kullanın ve mikroskopla incelemeden önce lamların havada kurumasına izin verin.

Gelişim sürecinde taktil stimülasyon uygulanan bir sıçandaki Golgi Cox boyamalı parametal nöronun temsili bir fotoğrafı buradadır. Büyütülmüş fotoğraf, terminal dendritler üzerindeki dendritik dikenleri göstermektedir. Soldaki daha açık renkli görüntü kontrol grubundaki bir sıçana, daha koyu renkli görüntü ise taktil stimülasyon alan bir sıçana aittir.

Bu grafik, gelişim sürecinde taktil stimülasyon alan veya almayan yetişkin sıçanların CG üç bölgesindeki nöronlar için ortalama apikal ve bazaler dendritik karmaşıklığı temsil etmektedir. Bu prosedürü izleyerek, ek sorular sormak istediğimizde tüm beyni boyamış olmamız sayesinde aynı beyin dokusuna geri dönüp bu soruları yanıtlayabilme avantajına sahip oluyoruz. Bu teknikleri geliştirerek, araştırmacıların taktil stimülasyonun kafa travması veya diğer nörolojik yaralanma türlerinin tedavisi için bir terapi olarak faydasını keşfetmelerinin yolunu açmış olduk.

Bu teknik, nörobilim araştırmacılarının beyin travmaları ve gelişimsel bozuklukların tedavisindeki potansiyelini keşfetmesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, yavru farelere dokunsal stimülasyonun zenginleştirici deneyiminin nasıl sağlanacağı ve bireysel nöronlar ile sinapsların görselleştirilme yöntemleri hakkında kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.