Name: Yüz Nakli Xenopus laevis Embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Öğrenin Xenopus laevis embriyolarında yüz dokusu nakli yöntemini. Bu teknik, kraniyofasiyal gelişimi ve sinyal etkileşimlerini incelemek için kullanılır. Araştırmacılar oral gelişimdeki yeni sinyalleri keşfetmek amacıyla bu yöntemi uygulayabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz kurbağa yetiştiriciliği ve embriyo hazırlanmasına yardımcı için yaptığı yardım için Radek Sindelka ve Cas Bresilla teşekkür ederim. Bu çalışma HLS Laura Jacox için hibe R01DE021109 yoluyla NIH tarafından finanse edildi Harvard Üniversitesi&#39;nde Herschel Smith Yüksek Lisans Bursu ve F30 bireysel burs hibe F30DE022989-01 NIDCR aracılığıyla tarafından finanse edildi.

1.. Hazırlanması Reaktifler <ol><li> 10x MBS: Barth Salin (MBS) solüsyonu 17 Modifiye 10x 1 L hazırlayın. Tablo 1, Kimyasalları, malzemeler ve talimatlarına bakın. Tüm çözümler için distile su kullanın. Tam çözünme gerçekleşene kadar, bir karıştırma çubuğu kullanılarak, bir cam kapta karıştırılır. Bütün çözeltiler, oda sıcaklığında yapılmalıdır. </li><li> 1x MBS: 1x MBS 1 L için damıtılmış su içinde 900 ml 10x MBS çözeltisi 100 ml seyreltin. 1 M CaCl2 çözeltisi 0.7 ml ilave edilir. </li><li> 0.1x MBS: İnceltilmiş 1x MBS 0.5x MBS çözeltisi 1 L ve 0.1x MBS çözeltisi 2 L hazırlamak. 0.1x MBS çözelti 1 L için, 10 mg / ml gentamisin solüsyonun 1 ml. Gentamisin ile 0.1x MBS çözelti, uzun süreli embriyo kültürü için kullanılacaktır. </li><li> Ficoll / MBS: 0.5x MBS çözeltisi 500 ml Ficoll 400 15 gram ekleyin. Kuvvetlice karıştırın. Bir karıştırma çubuğu ilave edin ve tam olarak Ficoll (birkaç saat) eriyene kadar karıştırılır. </li><li> % 70 etanol:% 70 etanol kullanılarak% 100 etanol ile seyreltilirdistile su. </li></ol> 2. Cam Çalışma Araçlar hazırlanması <ol><li> İğne hazırlama: Bir iğne çektirmenin yükleyin kılcal boru. <ol><li> İğne çektirmesi ayarları: Tablo 2&#39;de gösterilen ayarlara göre iğne çekin. Özel reaktifler ve ekipman Tablo açıklandığı gibi ayarları bir Sutter Instrument Co Model P-80/PC mikropipet çektirmesi ve kılcal borulama için vardır. Ancak, bu ayarlar Sutter iğne çektirmenin özgüdür ve diğer makineler için ayarlanması gerekir. Makinenin üretici tarafından belirtildiği gibi ayarlar, bir rampa testi kullanılarak belirlenebilir. </li><li> Prosedür için hazırlık 4-6 iğneler çekin. İğneler, tipik olarak 2-3 mm uzunluğunda olan, cam ucunun esnek, saç benzeri kısım tamamen çıkarılır şekilde kesilmesi gerekmektedir. Ucu, nispeten sert, ancak bir kesme aracı olarak kullanılmak üzere hala yeterince dar olmalıdır. Şekil 1A ideal iğne fotoğrafa bakın. </li&gt; <li> Merkezine doğru bir kil şeritli bir Petri kabındaki iğneler saklayın. , Kil içine her iğne mili basın yerde tutmak ve uzak alt ve yanlardan kırılgan keskin ucunu tutmak için. </li></ol></li><li> Ek araçlar için, uzun standart desen forseps, bir Bunsen beki, ve 3-4 cam Pasteur pipetler (Boyut 5 ¾) bir çift cam kapak fişleri edinin. </li><li> Pipet aracı: Bir pipet aracı yapmak için, Bunsen beki ışık ve ucu erir ve delik tamamen mühürler, kapalı, yuvarlak ucunu oluşturan, öyle ki, onu dönerken alev mavi parçası haline bir cam Pasteur pipet ucu yerleştirin . Yuvarlak, kapalı uç, daha sonra işlem sırasında embriyolar tutan kil çanak depresyonlar yapmak için kullanılır. Şekil 1B bakınız. </li><li> Cam köprüler:, cam köprüler yapmak dikkatlice kapak kayma cam 3 mm parçalar 3 mm kopmak uzun standart desen forseps kullanın. T kapak kayma parçasını tutarkenDört kenarlar aşağıya yumuşatmak ve eğri kadar weezers, küçük bir cam kubbe oluşturan, alev içinde cam yerleştirin. Kenarları artık keskin olmalıdır. Şekil 1C bakın. </li><li> Onları takarak cam kapak kayma köprüleri depolamak, bir Petri kabı alt astar, modelleme kil, aşağı kenarları. Köprünün üst toprak yüzeyi üzerinde kalacak şekilde köprüler yerleştirin. Çıkarmak zor olabilir, çünkü köprü sonları ve tamamen kil köprü embed yok bu çok zor gibi itmeyin. Bir alev veya% 70 etanol ile Sterilizasyon sonrasında, köprüler deneme deney tekrar edilebilir. </li></ol> 3. Embriyo Operasyon için hazırlık <ol><li> Modelleme kil ile küçük 60 mm plastik Petri hattı. Kullanımlar arasında, bulaşık ve kil yüzey damıtılmış su ile iyice yıkandı ve daha sonra% 70 etanol ile edilmektedir. NOT: kullan, kırmızı, beyaz ya da sarı, yerel bir satın alınabilir Van Aken Plastalina kil modelleme,y ya da sanat mağaza. Bir bültenleri kalıntısı nedeniyle siyah kil tavsiye edilmez. </li><li> % 3 Ficoll 0.5x MBS çözeltisi ile çanak doldurun. Daha yüksek tuz konsantrasyonu, doku ayrışmayı önler, ve polisakarit Ficoll pozisyonda yüz tutan yardımcı çözelti, kalınlaştırmak için yardımcı olur. </li><li> Bir sahne 20 embriyo vücudunun derinliği hakkında, kil sığ, 2-3 mm depresyonlar yapmak için yakılmış Pasteur pipet aracını (bkz. Şekil 1) kullanın. Çanak her iki tarafında, yanı sıra 20-30 depresyon, 1-2 mm olun, yani 40-60 çöküntü toplam vardır. Forseps ile kilin içine harfleri oyarak, bir tarafı LOF / GOF, ve diğer yan yabani tip etiketleyin. </li></ol> 4. Hastaların ameliyattan Embriyo Hazırlık <ol><li> Elde ve kültür Ksenopus standart yöntemler kullanılarak 17 embriyolar laevis&#39;den. Kurbağa yetiştiriciliği ayrıntılı bir açıklaması için, Sive vd. 17&#39;ye bakınız lütfen <ol><li> Önce deneme obta için kırk sekiz saatdişi kurbağa yumurta ve in vitro fertilizasyon gerçekleştirin. </li><li> Bir hücre aşamasında veya 2 hücreli aşamada 2 hücrelerine 0,5-1 başlıklı membran GFP mRNA&#39;nın ng, ayrıca istenen herhangi bir mRNA veya anti-sens morfolino-tadil edilmiş antisens oligonükleotidler (&quot;morpholinos&quot;) enjekte edilir. Bir hücre aşamasında, yaklaşık 70-90 dakika sürer. 1-3 nl bir toplam hacim enjekte edilir. (Örneğin GFP veya RFP RNA gibi) bir flüoresan protein için RNA kodlama bölgesinin yerine, bir FITC etiketli morfolino veya floresan ile etiketlenmiş dekstran enjekte edebilir. Floresan doku nakli iyileşir ve baş kalır olup olmadığını belirlemek için çok önemlidir. </li><li> Kapaklı bir mRNA mMessage mMachine SP6 ya da T7 kiti kullanılarak bir doğrusallaştırılmış plasmid hazırlanabilir. Morpholinos tasarlanmış ve Gen Araçlar LLC aracılığıyla sipariş edilebilir. Arzu edilen etki için gerekli morfolino miktarı, her gen için 18 tespit edilmelidir. </li><li> Bu aşamaya gelene kadar, 19-20, 48 saat boyunca 15 ° C &#39;de enjekte edilen embriyolar saklayın. (Fya da sonraki tüm adımlar, sahne embriyolar Nieuwkoop ve Faber 19 Xenopus Laevis&#39;den olan Normal tabloya göre.) NOT: Ameliyat gününde, her ikisi de bir alıcı ve verici embriyolar nakli en iyi şekilde çalışması için, diğer bir aşamada içinde olmalıdır. Bununla birlikte, morpholinos (&quot;morphants&quot;), enjekte edilmiş embriyolar, bazen daha yavaş yabani tür daha geliştirmek veya kontrol morphant embriyolar, bu morphant ve yabani tip embriyolar her ikisi de aynı aşamada gerekli deneyler koordine etmek adrestir. Morphants önce edilen prosedüre, 12-24 saat boyunca daha yüksek bir sıcaklıkta muhafaza edilmesi gerekebilir. Embriyolar eşleşen aşamalarında bulunabilir olasılığını arttırmak için, embriyolar çeşitli sıcaklıklarda muhafaza edilebilir. Deneyden önceki yirmi dört saat, bir 15-18 ° C&#39;de 18-20 ° C ve yabani tip embriyoların bir kaç yemekler, yer ve morphants içine embriyolar bölmek gerekir </li></ol></li><li> Transplantasyon deney, REM gününde15&#39;ten ° C inkübatör embriyolar ove ve Nieuwkoop ve Faber 19 göre onları sahneye. Onlar geç neurula (evre 19) daha genç iseler aşamasına 19 gelinceye kadar, 1-2 saat oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Bir flüoresan mikroskop altında enjekte edilen embriyolar Screen. Deney için üniforma, parlak floresan göstermek embriyolar seçin. </li><li> Çalışma alanının yakınında yığılmayı ve olası kirleri çıkarmak. % 70 etanol ile çalışma yüzeyi, Stereomikroskopta ve tüm araçlar aşağı silin. </li><li> Embriyolar aşamada 19 indiğinizde, bir stereo mikroskop altında # 5/45 Dumont forseps kullanarak vitellin membran kaldırmak. <ol><li> Donör ve alıcı embriyoların her birinin 20-30 vitellin membran çıkarın. </li><li> İlk birkaç yüz nakli deneyleri için, tek bir, her durum için bir kaç embriyo ile uygulama gerekir. Yöntem, zor ve hızlı ve başarılı bir şekilde, daha büyük bir ölçekte kullanılabilecek önce dikkatli bir uygulama gerektirir. Bir u çalışabilir/ deneme 20 nakli yapıyor p. </li></ol></li><li> Bir plastik kullanarak işletim çanak içine host embriyolar hareket açıklığı bir embriyo (en azından birkaç milimetre) daha geniş olacak şekilde kesilmiş ucu ile transfer pipet mezun oldu. Embriyolar yüzey gerilim patlayacak gibi, kabarcıklar veya su yüzeyine embriyolar dokunmamak için dikkatli olun. </li><li> Kil embriyonun posterior, kil çöküntü içine embriyolar eklemek için # 5/45 forseps kullanın. Yavaşça depresyon çıkıntılı, embriyonun üst çeyrek, kafa bırakarak forseps kullanılarak embriyonun bazlar etrafında kil kapatın. </li><li> Tüm ana embriyoların çöküntüler içinde sabitlendikten sonra, plakanın diğer tarafına taşımak ve girintiler içine verici embriyolar eklemek başlar. Kendi kuyularda embriyolar güvence işlemi tekrarlayın. </li></ol> 5. Yüz Nakli Cerrahisi Sahne <ol><li> Bıçak Kesme: kaldırılması için bir kesme bıçağı olarakdonör EAD doku, uygun bir şekilde kırık cam kılcal iğne (adım 2.3 ve bkz. Şekil 1) kullanın. NOT: Bir doğrudan parmakları arasında kılcal (bu küçük elleri olan insanlar için iyi çalışır) ya da bir bir böcek pim tutucu iğne monte edebilirsiniz tutabilir. Bir iğne tutucu içine yüklenen Electrosharpened tungsten iğneler 17 yerine bir kılcal tüp iğnenin kullanılabilmektedir. Belirli Reaktifler ve Ekipmanları Tablo önerilen pin sahipleri ve tungsten iğneler bakın. </li><li> Bir stereomikroskop altında, çimento bezinin solundaki embriyonun kafası içine iğne takın. Bu kafa ile, embriyo dışından geçer ve ön bağırsağa böylece iğne, derin olarak yerleştirilen olmalıdır. Tüm EAD nakli için, kesik foregut için embriyonun dışarıdan uzanmalıdır. Ektoderm sadece nakli için, kesikler sığ olmalı ve sadece ektoderm boyunca uzanır. <ol><li> Sağ tarafına soldan iğne Flickçimento bezinin tüm genişliği boyunca, baş. Hareket temiz bir kesim verir gibi vuruşunu önemlidir. Kesim bir gösteri için teknik ve Şekil 2B bir özeti için Şekil 2A bakın. Çimento bezi ve gözleri kesimler için önemli yerler vardır. Kesim sırası sonucu etkilemez ve kullanıcının tercihine veya ellilik bağlı olarak değişebilir. </li></ol></li><li> Çimento bezinin sol sınırında, bir önceki kesme başında iğne yerleştirin ve sol gözün alt ulaşana kadar yukarıya doğru iğneyi fiske. Bu, sol gözün alt çimento bezinin sol sınır dikey parçasını oluşturur. </li><li> Çimento bezinin sağ sınırında iğne yerleştirin ve sağ gözün alt ulaşana kadar yukarıya doğru iğneyi fiske. Bu, sağ göz altına çimento bezinin sağ sınır dikey parçasını oluşturur. </li><li> Tam olarak doku, Flic tüketim içindoku serbest bir yatay kesim oluşturarak, sağ göz alt sol gözün tabanından iğne k. Keser EAD eksplant olarak ektoderm ve endoderm dahil olmak üzere, foregut için embriyonun dışarıdan uzanabilir. Alternatif olarak, sığ kesik ektoderm okunur EAD nakli için de kullanılabilir. EAD doku çıkarıldığında, çimento bezinden uzanan, ön bağırsağa embriyonun dışarıdan dikdörtgen bir delik olmalıdır için sadece bir gözde (yukarıdan aşağıya) altında. Delik sağ göz (yan yana) iç sınırına sol gözünün iç sınırına kadar uzanmalıdır. Şekil 2BB bakın. </li><li> Nazikçe iğnenin ucunda kesilmiş doku itin ve host embriyolar içeren çanak kısmına tampon aracılığıyla kaldırın. Yüzey havaya doku maruz bırakmayın ya da hasar görecektir. </li><li> Donör için olduğu gibi, ev sahibi embriyo aynı doku tüketim. Konak EAD eksplant atın veya yerleştirilmek kaydedinkarşılıklı nakli için, donör yüzüne t. </li><li> # 5/45 forseps kullanılarak elde edilen konak deliğe donör eksplant yerleştirin. </li><li> Donör doku doğru yerleştirildiğinden ve tam olarak takıldığında, dikkatle yerine nakli tutmak için embriyonun yüzünde (Şekil 1 ve Şekil 2BC bakınız) bir cam köprü yerleştirin. Köprünün uçları yerde tutarak, kil içine girmelisiniz. Köprü hafifçe nakli o kafası dışarı yapışmasını veya derin başının içinde yatan olmadan, ev sahibi kafası ile aynı hizada olacak şekilde nakledilen doku, basınç uygulamak gerekir. Baş hafifçe kapak kayma tarafından basık, ama çok fazla baskı ile embriyonun zarar vermemek için dikkatli olmak olabilir. Nakli 5 dakika içinde yapılmalıdır. NOT: Deneyimli bir araştırmacı, 2-3 saat boyunca, deney başına yaklaşık yirmi nakli gerçekleştirebilmektedir. Bu dönemde embriyolar aşamada 20-22 ilerleme olacaktır. Yüz nakli Tamamlanıyoraşamada 21 veya 22 s at sonuçlarını etkilemez. (Aşamalarında 22-26 at) sonradan nakli yapılan ancak kret-serbest EAD orta hat bölge yüzüne kranial nöral krest hamle olarak daralmış gibi daha zor olabilir. Nakilleri genelinde tutarlılık önemlidir. </li></ol> 6. Yüz Nakli Sonrası operasyon Kurtarma <ol><li> Şifa genellikle 2-3 saat sürer. Cam köprü yerinde tutan verici doku ile kil çöküntüler içinde rahatsız oda sıcaklığında embriyolar bırakın. </li><li> Nakli iyileşmiş sonra, dikkatli, cam köprüleri kaldırmak forseps kullanarak embriyoların tabanı etrafında kil çıkarın ve bir plastik nazikçe depresyonların dışında embriyoların vakum transfer pipet mezun kullanın. </li><li> Yarım gentamisin temiz 0.1x MBS ile dolu etiketli uygun bir Petri kabı içine embriyolar koydu. </li><li> Bu w, aşama aşama 40 larva besleme gelene kadar, birkaç gün boyunca 15 ° C ya da 18 ° C &#39;de embriyolar büyümektavuk yüz fenotipleri attı olabilir. <ol><li> Gentamisin 0.1x MBS Çözelti günlük değiştirilmesi gerektiğini ve herhangi bir ölü embriyolar diğer embriyoları kirlenmesini ve ölümü önlemek için derhal kaldırılmalıdır. </li><li> Ağız aşamada 40 açılır. Aşamada 40-41 anda, biri nakledilen doku flüoresanını görüntüleyerek yerinde iyileşmiş kalmasını kontrol etmelisiniz. Nakilleri bazen düşebilir, bu yüzden bir bütün attı embriyolar yerine donör doku emin olmalısınız. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGorlin%2C+RJ+%22Syndromes+of+the+head+and+neck%22">Syndromes of the head and neck</a>. , Oxford University Press. UK. (1990).</li>
<li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniofacial+birth+defects%3A+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Gen.+A%22%5BJournal%5D)">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus%3A+cement+gland%2C+primary+mouth+and+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Dev. 136, 1071-1081 (2009).</li>
<li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilbert%2C+SF+%22Developmental+Biology%22">Developmental Biology</a>. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (2010).</li>
<li>Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).</li>
<li>Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoiogenetic+neural+inducing+activity+of+the+presumptive+neural+plate+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeogenetic+neural+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Homeogenetic neural induction in Xenopus.</a> Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).</li>
<li>Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triple+origin+of+skull+in+higher+vertebrates%3A+a+study+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras.</a> Dev. 117, 409-429 (1993).</li>
<li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+%3A+I%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+relationships+between+placodes%2C+facial+ectoderm%22%5BJournal%5D)">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I.</a> Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).</li>
<li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+II.+The+prosencephalic+neural+plate+and+neural+folds%3A+Implications+for+the+genesis+of+cephalic+human+congenital+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities.</a> Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).</li>
<li>Lievre, A. L., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+cranial+sensory+ganglia+and+the+potentialities+of+their+component+cells+studied+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras.</a> Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).</li>
<li>Kennedy, A., Dickinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis%3A+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).</li>
<li>Trainor, P., Tam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+of+the+mouse+embryo-+codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+the+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches.</a> Dev. 121, 2569-2582 (1995).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%22">Early Development of Xenopus laevis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpholino+injection+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morpholino injection in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing. New York. (1994).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kritik Adımlar ve Sınırlamalar: EAD yüz nakli işlem süresi ve yoğun çalışır. Bu mükemmel uygulama, sürekli elleri ve maharet gerektirir. Yüz nakli protokol verimli kaldırmak ve nakli doku için araştırmacının becerisine dayanır. Bir konağın yüzüne nakli eklemek için çok uzun sürerse, konak yüz sözleşme ve iyileştirmeye başlayacak. Forseps ince yüz bölgesini genişletmek için kullanılabilir. Önemli yara daralma oluştu Ancak, nakli de iyileşme olmaz ve konağın yüz deliğe sığacak şekilde azaltılabilir gerekebilir. Tra...

Kraniyofasiyal gelişimi sırasında doğumsal kusurları 1-2, önemli dokuları ve onların sinyal katkılarını altında yatan mekanizmaları anlamak için tespit edilmelidir. Kurbağa Xenopus laevis, ektoderm ve endoderm doğrudan 3-4 yan yana olan &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD), gelen ağız ve burun delikleri formu dahil olmak üzere yüzün bir parçası olarak. EAD ayrıca çene ve diğer yüz bölgelerini oluşturan 5 kranial nöral, dahil çevredeki dokuları etkilemek için bir sinyal merkezi olarak görür. Doku gelen konak bölgeyi çıkardıktan sonra, bir ev sahibi embriyo bir donörden nakledilen nerede EAD işlevine katkıda genleri tanımlamak için, bir &#39;yüz nakli&#39; tekniği geliştirildi. Nakilden sonra, yüz gelişme elde değerlendirilir. Böylece, fonksiyon kaybı (LOF) ya da EAD belirli bir genin fonksiyonu (GOF) kazancı etkisi, yerel olarak incelendiğinde burada h geri kalanıead ve vücut vahşi tip dokusu oluşur. Vahşi tip dokuya özgü gen, küresel LOFveya GOF olan embriyoların içine nakledilen olduğu karşılıklı nakli, gerçekleştirilebilir. Transplantasyon sık Xenopus&#39;ta kullanılan ve civciv 6 inceler. Örneğin, Ksenopus nakli homogenetic nöral indüksiyon, lens ve nöral yetkinlik ve nöral krest göç 7-10 ele almıştır. Bıldırcın-civciv kimerik aşılama anterior nöral plaka, anterior nöral sırt, nöral ve kafatası kemikleri 11-14 gelişimini analiz etti. Bu Xenopus kraniofasiyal geliştirme çalışması için ilk nakil tekniktir. Bu teknik olası ağız 5 bazal membran oluşumunu düzenleyen Wnt önleyicileri Frzb1 ve Crescent için yeni bir rolü olduğunu göstermiştir. Xenopus laevis kraniofasiyal geliştirme çalışması için ideal bir model embriyo büyük olarak, harici bir geliştirmend yüz sağlayan, kolayca görülebilir mikromanipülasyon ve gelişim görüntüleme. Yüz gelişimini yatan mekanizmalar kurbağa yapılan bulgular, insan gelişiminin 4,15-16 içgörü sağlamak olduğunu belirten, korunmuş görünür.

<table><tbody><tr><td>Pastör pipeti</td><td>VWR</td><td>14672-400</td><td>Kireç Camı&nbsp;</td></tr><tr><td>Boyut 5 3/4 Pamuk</td><td>Tıkalı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dereceli Transfer Pipeti</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td>Tek Kullanımlık&nbsp;</td></tr><tr><td>#5/45 forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları Dupont medical</td><td>11251-35</td><td>Açılı 45&deg;</td></tr><tr><td>Standart Desen Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11000-20</td><td>Düz; tırtıklı uç; paslanmaz çelik</td></tr><tr><td>Kılcal Boru (iğneler için)</td> <td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>Borozil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID / Fiber</td></tr><tr><td>Kapak kayması&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 252</td><td>24 x 60 mm&nbsp; mikro kapaklı cam;</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>İğne Çektirmesi&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>İğne Çektirme: durdurulan Filament: FB300B</td><td>En benzer, şu anda mevcut olan iğne çektirmesi P-97'dir. Filamentler için 3,0 mm genişliğinde Sutter 3,00 mm kare kutu filamentler kullanın.</td></tr><tr><td>Model P-80</td><td>Alevli / Kahverengi mikropipet çektirme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss Stereomikroskop Fostec'ten</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aydınlatma Fostec</td><td></td><td>2 fiberoptik kollu bir ışık kutusu kullanın. &nbsp;</td></tr><tr><td>Nikel Kaplama Pim Tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26018-17</td><td>Çene Açma Çapı: 0-1 mm</td></tr><tr><td>Moria Nikel Kaplama Pim Tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26016-12</td><td>Çene açıklığı Çapı: 0-1 mm</td></tr><tr><td>Tungsten İğneleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10130-05</td><td>0.125 mm Çubuk çapı</td></tr><tr><td>Van Aken Plastalina</td><td>Blick</td><td>#33268-2981</td><td></td></tr><tr><td>Modelleme Kili- beyaz, kırmızı veya sarı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMashine SP6 veya T7 Kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr></tbody></table>

yüz nakli<em&gt; xenopus laevis</em&gt; embriyolar

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Doğumsal kusurları 1 700 her canlı doğumda bir görülür, ancak etyolojisi nadiren nedeniyle kraniofasiyal gelişme sınırlı anlayış bilinmektedir. Sinyal yolları ve dokular gelişen yüzün desenleme sırasında hareket nerede olduğunu belirlemek için, bir &#39;yüz nakli&#39; tekniği kurbağa Xenopus laevis embriyoların geliştirilmiştir. Olası yüz kağıt ürün (&quot;Extreme Ön Alan&quot; (EAD)) ihtiva eden bir bölge tailbud aşamada bir verici embriyo kaldırılır ve eşdeğer bölgesi kaldırıldı ki aynı aşaması bir dizi embriyo, transplante edilir. Bu, bir ana bilgisayar veya donor dokusu, bir gende bir kayıp ya da fonksiyon kazancı ve / veya bir soy etiket içeren bir kimerik bir yüz oluşturmak için de kullanılabilir. Yüz bölgesi kolayca büyük ve gibi şifa sonra, gelişme sonuç izlenen ve vericiden veya çevredeki konak dokularının içindeki sinyal yolunun rollerini işaret edilir. Ksenopus, yüz gelişimi için değerli bir model birmikromanipülasyon için ccessible. Geliştirme hızla meydana geldiği çoğu embriyolar, kısa bir süre boyunca, tahlil edilebilir. Kraniofasial süreçler Xenopus ve memeliler arasında korunmuş görünen bu yana kurbağa bulguları, insan gelişimi ile ilgili bulunmaktadır.

Şekil 2BC gösterildiği gibi nakledilen doku tamamen, Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, nakil sonrası ana kafa içine sokulur ve uygun bir embriyonun yüzüne yerleştirilen bir cam köprü sahip olmalıdır. Nakli başarılı olmak için nakledilen donör dokusu düzgün, ev sahibi açılması için ölçekli gerekir. Şekil 3B ve 3C&#39;de görüldüğü gibi, EAD doku, herhangi bir şekilde, baş kısmından itibaren çıkıntı olmamalıdır. Şekil 3B &#39;de gösterild...

Xenopus arasında yüz doku &quot;Extreme Anterior Etki&quot; nakli için bir tekniktir embriyolar geliştirilmiştir laevis&#39;den. Doku kraniofasial gelişimi için ve yüz bölgeleri arasındaki etkileşimleri sinyalizasyon için yerel gereksinimleri çalışma izin, başka içine bir gen ekspresyon kökenli taşınmış olabilir.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Bu prosedürün genel amacı, xenopus Levi embriyoları arasında ekstrem anterior domain veya EAD yüz dokusunu nakletmektir. Bu işlem, öncelikle farklı genetik arka planlara sahip donör ve alıcı embriyolardan EAD dokusunun çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, donör embriyolardan alınan EAD eksplantları, alıcı embriyoların yüz bölgelerine yerleştirilir.Son adımda, nakledilen embriyolar gözlem için fertilizasyon sonrası 60 ila 70 saat boyunca tutulur. Nihayetinde, nakledilen hayvanların kraniofasiyal gelişimindeki değişiklikleri gözlemlemek için parlak alan ve floresan mikroskobu kullanılabilir. Bu yöntem, ekstrem anterior domainden kaynaklanan oral gelişim için gereken yeni sinyaller gibi, kraniofasiyal deformiteler konusundaki anlayışımızı geliştirmek adına kraniofasiyal gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Operasyon öncesinde, kapiler tüpleri bir iğne çekiciye yerleştirin ve ardından her bir iğneyi, cam ucun iki ila üç milimetrelik esnek kıl benzeri kısmı tamamen ayrılacak şekilde çekerek dört ila altı adet iğne hazırlayın.Uç nispeten sert, ancak bir kesme aracı olarak kullanılabilecek kadar dar olmalıdır. Ardından bir bunsen beki yakın ve cam pastör pipetinin ucunu alevin mavi kısmına yerleştirin; pipeti, uç eriyene ve delik tamamen kapanıp kapalı ve yuvarlak bir uç oluşturana kadar döndürün. Cam köprüler yapmak için, standart uzun desenli pensler kullanarak lamel camından üç milimetreye üç milimetrelik parçaları dikkatlice kırarak koparın.Ardından, kapatma lamı parçasını bir cımbızla tutun ve camın dört kenarı da yumuşayıp aşağı doğru kıvrılarak küçük bir cam kubbe oluşturana kadar camı alevde tutun. Daha sonra, 60 milimetrelik plastik bir Petri kabını kırmızı, beyaz veya sarı modelleme kili ile astarlayın. Ve kabı %3phi ile doldurun.0,5 XMBS çözeltisini hazırlayın. Ardından, deneyden 48 saat önce, alevle sterilize edilmiş bir pipet ucu kullanarak kille yaklaşık 20. evre embriyo vücut derinliğinde, 2-3 mm derinliğinde 40 ila 60 adet sığ çukur oluşturun. Dişi kurbağalardan yumurtalar alın ve bunları in vitro ortamda dölleyin.Ardından, embriyoları kaplanmış membran, GFP mRNA ve varsa diğer mesajlarla enjekte ettikten sonra, 19 ila 20. evreye ulaşana kadar 48 saat boyunca 15 °C'de saklayın. Transplantasyon deneyinin yapıldığı gün, tekdüze ve parlak floresans gösteren enjekte edilmiş embriyoları seçmek için bir floresan mikroskop kullanın. Operasyon yüzeyini, stereo mikroskobu ve aletleri %70 etanol ile sildikten sonra, stereo mikroskop altında her bir seçilen embriyonun Vitale membranını çıkarmak için 5 numara 45 Dumont penset kullanın.Ardından, ucu kesilmiş plastik dereceli bir transfer pipeti kullanarak konak embriyoları operasyon kabına taşıyın. Embriyoların hava-su arayüzüne temas etmemesine dikkat edin. Embriyoları posterior tarafları aşağı bakacak şekilde kil çukurlara yerleştirin ve pens yardımıyla, baş kısmı çukurdan dışarıda kalacak şekilde kilin her bir embriyo tabanının etrafını nazikçe kapatın. Donör kısmını önce çıkarmak için, çekilmiş iğnelerden birini embriyonun baş kısmındaki tutkal bezinin soluna, embriyonun dışından geçip baş üzerinden önbağırsağa ulaşacak kadar derine yerleştirin.Temiz bir kesi elde etmek için iğneyi, sement bezinin tüm genişliği boyunca başın sol tarafından sağ tarafına doğru hızlıca hareket ettirin. Ardından iğneyi, sement bezinin sol sınırındaki kesinin başlangıcına yerleştirin ve sement bezinin sol sınırından sol gözün altına kadar dikey bir kesi oluşturmak için iğneyi sol gözün altına ulaşana kadar yukarı doğru hızlıca hareket ettirin. Sonrasında iğneyi sement bezinin sağ sınırına yerleştirin ve sement bezinin sağ sınırından sağ gözün altına kadar dikey bir kesi oluşturmak için iğneyi sağ gözün altına ulaşana kadar yukarı doğru hızlıca hareket ettirin.Ardından dokuyu tamamen çıkarmak için, iğneyi sol gözün altından sağ gözün altına doğru hareket ettirerek dokuyu serbest bırakacak yatay bir kesi yapın. Şimdi çıkarılan dokuyu nazikçe iğnenin ucuna itin ve tampon çözelti içinden geçerek kabın konak embriyolarının bulunduğu kısmına kaldırın. Az önce gösterildiği gibi dokuyu konak embriyodan çıkarıp konağı ve EAD eksplanını atın, ardından donör eksplanını oluşan konak boşluğuna yerleştirin.Donör doku doğru şekilde konumlandırılıp dikkatlice tamamen yerleştirildikten sonra, transplantı sabit tutmak için önceden hazırlanmış cam köprülerden birini embriyonun yüzeyine yerleştirin ve köprünün uçlarını sabitlemek için kile batırın. Operasyondan sonra embriyoları iki ila üç saat boyunca oda sıcaklığında rahatsız etmeden dinlendirin. Ardından, transplantlar iyileştiğinde, cam köprüleri embriyolardan ve kil tabakasını embriyoların taban çevresinden dikkatlice kaldırın.Ardından, embriyoları bulundukları çukurlardan nazikçe vakumlamak için plastik dereceli bir transfer pipeti kullanın. Embriyoları, yarıya kadar temiz, Gentamisin takviyeli 0.1 XMBS ile doldurulmuş, uygun şekilde etiketlenmiş bir Petri kabına aktarın ve embriyoları evre 40'a ulaşana kadar birkaç gün boyunca 15 ila 18 °C'de büyütün. MBS solüsyonunu her gün değiştirin ve transplant edilen dokuyu, eksplantın yerinde iyileşmiş olduğunu onaylamak için floresan ile görüntüleyin.Nakledilen dokular, az önce gösterildiği gibi transplantasyon sonrası konak kafasına tamamen yerleştirilmeli ve naklin başarılı olması için konak açıklığıyla doğru boyutta olmalıdır. Hatalı konumlandırılmış eksplantların bu iki görüntüsünde gözlemlendiği üzere, EAD dokusu kafadan hiçbir şekilde dışarı taşmamalıdır. Ayrıca, burada gösterildiği gibi yüz transplantı, donör vücuttaki konumuna göre döndürülmemelidir.Birkaç saat sonra, nakledilen doku ve çevresindeki yüz bölgesi iyileşmeli ve ertesi güne kadar embriyo, bu görüntülerde gösterilen örneğe benzer bir görünüm almalıdır; nitekim floresan mikroskopisinin, iyileşme sürecinde nakledilen dokunun yerinde kaldığını doğrulamak için kullanılabileceği az önce gösterilmiştir. 42. evrede, nakledilen kontrol dokusu ağız oluşumuna katkıda bulunacak ve floresan yeşil rengini koruyacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, bir embriyodan diğerine EAD dokusu naklinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Bu yöntemin kullanımıyla, EAD'nin hangi germ tabakasının veya bölgesinin yüz gelişimine en kritik düzeyde katkı sağladığının belirlenmesi kolaylaştırılmaktadır.

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Zebra balığı hücre nakli, doku spesifik kimeralar üretmek için genetik ve embriyoloji kombinasyonu sağlar. Bu video gastrula laboratuarımızda önbeyin komissür oluşumu sırasında, Astroglial nüfus ve özel rehberlik ipuçları rollerini araştırmak için izin hücre transplantasyon sahnelenen göstermektedir.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Hayvan kapaklar eksprese gen ürün (ler), gelişmekte olan kanadını...

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Bu video protokol transgenik üretmek için bir yöntem...

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Kraniofasial kıkırdaklar diğer dokuları ile yakın temas içinde gelişir ve canlı hayvan işlemek için zordur. Elektroporasyon erken embriyonik etkileri atlayarak kraniyofasiyal iskeletin büyüme sırasında moleküler araçlar sunmak için kullanıyor. Bu yaklaşım, aday moleküllerin etkin bir şekilde test etmek için bize izin...

Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Bu protokol Xenopus laevis neurulas gelen premigratory kranial sinir kret (NC) teşrih nasıl açıklanır. Bu eksplantlar, fibronektin ve in vitro kültürlenmiş üzerine kaplanır, ya da arka ana embriyolara aşılanabilirler. Bu teknik NC epitel-to-mezenşimin geçiş, göç, ve farklılaşma mekanizmaları eğitim veriyor.

Diseksiyonu<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Sinir Crest için<em&gt; In vitro</em&gt; Eksplantasyon Kültür veya<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantasyon

Xenopus laevis embriyoların hastanın ağız boyutunu ve şeklini ölçmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokol, geleneksel boyutu ölçümleri, hastanın ağız geliştirme ve kusur daha sofistike analizlerine olanak sağlamak için geometrik morfometrik ile birleştirilir.

Orofasial fenotipleri Niceleme Xenopus

Xenopus embriyolarında, blastocoel'in çatısından alınan hücreler pluripotenttir ve çeşitli dokular oluşturmak üzere programlanabilir. Burada, erken nöral gelişimin temel in vivo ve in vitro özelliklerini araştırmak için bir test sistemi olarak amfibi blastocoel çatı eksplantlarını kullanma protokollerini açıklıyoruz.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Hayatta kalmak için gerekli genler mutant satırları oluşturmak için teknik engel oluşturmaktadır. Leapfrogging ölümcül germline mutasyonlar taşıyan vahşi-türü hayvanlar oluşturmak için ilkel germ hücre transplantasyonu ile düzenleme genom birleştirerek kaçınmanızı sağlar. Leapfrogging de F1 nesil homozigoz null mutantların üretimi verimli verir. Burada, nakli adım gösterilmiştir.

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

Bu makalede, kraniyofasiyal gelişim sırasında bazal ön beynin sinyal ve paternleme özelliklerini test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği anlatılmaktadır.

Yüz Gelişimini Değerlendirmek için Kuş Ön Beyin Kimeraları Oluşturmak

Hücrelerin ekstirpasyonu ve nakli gibi embriyolojik manipülasyonlar erken gelişimi incelemek için önemli araçlardır. Bu protokol, zebra balığı embriyolarında bu manipülasyonları gerçekleştirmek için basit ve etkili bir transplantasyon cihazını tanımlar.

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Öğrenin Xenopus laevis embriyolarında yüz dokusu nakli yöntemini. Bu teknik, kraniyofasiyal gelişimi ve sinyal etkileşimlerini incelemek için kullanılır. Araştırmacılar oral gelişimdeki yeni sinyalleri keşfetmek amacıyla bu yöntemi uygulayabilir.

Yüz Nakli

Daha fazla video keşfet