Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Bu prosedürün genel amacı, omuriliğin optimal mikroskobik görüntülemesi için zebra balığı embriyolarını diseke etmek ve monte etmektir. Bu işlem, öncelikle koriyus membranının mikro diseksiyonla çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise koriyus artıklarının temizlenmesi ve embriyoların bir lam üzerine pipetlenmesidir.

Ardından, fazla sıvı bir Kim wipe ile dikkatlice alınır ve ardından montaj medyumu eklenir. Son adım, bir embriyo itici ile embriyoların lam üzerinde yönlendirilmesi ve ardından kapatma camının uygulanmasıdır. Son olarak, post-mitotik hücre gövdelerinin dağılımını ve gelişen aksonların izlediği yolu göstermek için floresan veya parlak alan mikroskopisi kullanılır.

Bu yöntem, patern oluşumu, farklılaşma ve akson kılavuzluğundan sorumlu mekanizmaların neler olduğu gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, sinir sistemi gelişiminin birçok yönüne dair içgörü sağlayabilmesinin yanı sıra, gelişmekte olan kas gibi diğer dokulara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, deney başlangıcından önce mikroskop altında diseksiyon yapılması gerektiği için zorlanabilirler.

Bir pipet ucunu eski bir pipete, ardından bir misina ipini pipet ucuna yapıştırarak bir embriyo poker'i hazırlayın. Embriyo diseksiyonuna başlamak için, döllenmeden sonraki 24 saatlik yaşta olan en fazla 30 zebrafish embriyosunu PBS ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, bir cımbızla embriyonun başını sabitleyin ve bu sırada bir entomoloji iğnesi ile yumurta kılıfını uzaklaştırın. Ardından, embriyoları Petri kabının çok fazla vitellus kalıntısı bulunmayan bir bölümüne taşımak için embriyo iticisini kullanın. Sonra, mümkün olduğunca az sıvı çekecek şekilde embriyoları bir cam pastoral pipetle aspire edin.

Ardından, 21 adete kadar embriyoyu nazikçe bir lam üzerine pipetleyin. Embriyolara dokunmamaya dikkat ederek, fazla sıvıyı bir laboratuvar mendili ile dikkatlice çekin ve ardından embriyoların üzerine bir damla montaj medyumu ekleyin. Sonrasında, embriyoları yan tarafları üzerine gelecek şekilde iki veya üç sıra halinde yönlendirmek için embriyo iticisini kullanın.

Şimdi, bir lamelin her köşesine az miktarda vazelin ekleyin. Lameli, vazelinli tarafı aşağıya gelecek şekilde çevirin ve lameli embriyoların üzerine yerleştirin. Vazelin, aşırı sıkıştırmadan kaynaklanabilecek embriyo hasarlarını önlemeye yardımcı olur.

Gerekirse, 20 ila yüz mikrolitre aralığında bir pipetleyici kullanarak, montaj medyumu lamelle temas edene kadar lamelin her köşesine hafifçe vurun. Lamelin yanına daha fazla montaj medyumu ekleyin ve eklenen medyumun lamelin altına süzülmesini sağlayın. Şimdi, lamelin etrafını tamamen temizlemek için bir laboratuvar mendili kullanın.

Kapak lamına baskı uygulamayın, çünkü bu durum embriyolara zarar verebilir; alan uygun şekilde temizlendiğinde, kuru olduğunda ve üzerinde vazelin veya montaj medyumu bulunmadığında işlem gerçekleştirilir. Kapak lamının kenarlarını oje kullanarak mühürleyerek işlemi tamamlayın. Zebrafish embriyolarının montajından sonra, oak sac uzantısının üzerindeki birkaç HEMI segmenti görselleştirilmiştir.

Bu şekil, zebra balığı embriyosunun ventral omuriliğindeki NK X 6.1 ekspresyonunu göstermektedir. NK X 6.1 mRNA'sı, döllenmeden 24 saat sonra omuriliğin yaklaşık ventral yarısına dağılmıştır. Progenitör alan içerisinde, progenitör hücreler, omuriliğin medial kısmında bulunan taban plağının varlığı sayesinde post-mitotik hücrelerden ayırt edilebilmektedir.

DIC optikleri ile görüntülenmiştir. Münferit hücreler net bir şekilde ayırt edilebilmektedir ve ekspresyon yapan hücreler ile yapmayan hücreler arasında belirgin bir sınır mevcuttur. Progenitör hücrelerin döngüden çıkışına gen ekspresyonundaki değişiklikler eşlik eder.

Bu görüntü, postmitotik nöronlarda robo three ekspresyonunu göstermektedir. Robo reseptör ailesi, ekspresyonu postmitotik nöronların doğru şekilde sayılmasına olanak tanıyan akson kılavuzlama reseptörleridir. Bu daha lateral odak düzleminde, taban plakası ve progenitör bölgesinin belirgin olmadığını not ediniz.

Yan tarafa monte edilmiş bu embriyoda gösterildiği gibi motor aksonları işaretleyen znp one immünofloresansını görüntülemek için konfokal mikroskopi kullanılmıştır. Motor nöronlar, çevreleyen gelişmekte olan kas sistemini inerve etmek için döllenmeden 24 saat sonra omuriliğin ventral kısmından çıkarlar. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem 30 dakikada tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, dikkatli mikrodiseksiyon yoluyla dokuların bütünlüğünü korumanın önemli olduğunu unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, zebrafish embriyolarının vitrin hazırlama ve mikroskobik görselleştirme amacıyla vitellüslerini çıkarmak için mikrodiseksiyon tekniklerinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.