Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Bu prosedürün genel amacı, omuriliğin optimal mikroskobik görselleştirilmesi için zebra balığı embriyolarını incelemek ve monte etmektir. Bu, meşe topunun ilk mikroların diseke edilmesi ve çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, meşe kalıntılarını çıkarmak ve embriyoları bir lam üzerine pipetlemektir.

Daha sonra, fazla sıvı bir Kim mendili ile dikkatlice çıkarılır ve ardından montaj ortamı eklenir. Son adım, embriyoları bir embriyo pokeri ile slayt üzerine yönlendirmek ve ardından kapak fişinin uygulanmasıdır. Sonuç olarak, post mitotik hücre gövdelerinin dağılımını ve gelişmekte olan aksonların yörüngesini göstermek için floresan veya parlak alan mikroskobu kullanılır.

Bu yöntem, nörobiyoloji alanındaki modelleme, farklılaşma ve akson rehberliğinden sorumlu mekanizmaların neler olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, sinir sistemi gelişiminin birçok yönü hakkında fikir verebilse de, gelişmekte olan kas gibi diğer dokulara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, deneye başlamadan önce mikroskop altında diseksiyon gerektiğinden mücadele edeceklerdir.

Bir pipet ucunu geçmiş bir pipete yapıştırarak ve ardından pipet ucuna bir misina yapıştırarak bir embriyo pokeri yapın. Embriyo diseksiyonuna başlamak için 30'a kadar zebra balığı embriyosu yerleştirin. Döllenmeden 24 saat sonra PBS ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına.

Diseksiyon mikroskobu altında, meşe ağacını bir böcek pimi ile çekerken bir embriyonun kafasını bir çift forseps ile sabitleyin. Daha sonra embriyoları Petri kabının çok fazla yumurta sarısı kalıntısı olmayan bir kısmına taşımak için embriyo pokerini kullanın. Daha sonra, embriyoları mümkün olduğunca az sıvı çekerek bir cam mera pipetine aspire edin.

Daha sonra 21 embriyoyu bir slayta nazikçe pipetleyin. Embriyolara dokunmaktan kaçınırken bir laboratuvar mendili kullanarak fazla sıvıyı dikkatlice uzaklaştırın ve ardından embriyolara bir damla montaj ortamı ekleyin. Ardından, embriyoları iki ila üç sıra halinde yanlarına yönlendirmek için embriyo pokerini kullanın.

Şimdi, bir kapak fişinin her köşesine bir damla vazelin ekleyin. Kapak fişini, vazelin olduğu taraf aşağı bakacak şekilde çevirin ve kapak fişini embriyoların üzerine yerleştirin. Vazelin, embriyoların aşırı sıkışmadan zarar görmesini önlemek için hareket eder.

Gerekirse, 20 ila yüz mikrolitre aralığında bir pipetleyici kullanarak, montaj ortamı kapak kızağına temas edene kadar her bir köşedeki kapak kızağını hafifçe vurun. Kapak contasının yanına daha fazla montaj ortamı ekleyin ve eklenen medyanın kapak contasının altından fitillenmesine izin verin. Şimdi, kapak kaymasının etrafını tamamen temizlemek için bir laboratuvar mendili kullanın.

Kapak kızağına baskı uygulamayın, çünkü bu, uygun şekilde temizlendiğinde embriyolara zarar verebilir, alan kurudur ve üzerinde vazelin veya montaj ortamı yoktur. Kapak kaymasının kenarlarını kapatmak için oje kullanarak bitirin. Zebra balığı embriyoları monte edildikten sonra, meşe kesesi uzantısının üzerinde birkaç HEMI segmenti görselleştirildi.

Bu şekil, zebra balığı embriyosunun ventral omuriliğindeki NK X 6.1 ekspresyonunu göstermektedir. NK X 6.1 mRNA, döllenmeden 24 saat sonra omuriliğin kabaca ventral yarısına dağıtılır. Progenitör alan içinde, progenitör hücreler, omuriliğin medial kısmında bulunan taban plakasının varlığı nedeniyle post mitotik hücrelerden ayırt edilebilir.

DIC optiklerle görüntülenir. Tek tek hücreler açıkça ayırt edilebilir ve ifade eden ve ifade etmeyen hücreler arasında tanımlanmış bir sınır belirgindir. Progenitör hücre döngüsü çıkışına gen ekspresyonundaki değişiklikler eşlik eder.

Bu görüntü, post mitotik nöronlarda robo üç ekspresyonunu göstermektedir. Robo reseptör ailesi, ekspresyonu post mitotik nöronların doğru sayımına izin veren akson rehberlik reseptörleridir. Zemin plakasının ve progenitör bölgenin bu daha yanal odak düzleminde belirgin olmadığını unutmayın.

Bu lateral olarak monte edilmiş embriyoda gösterildiği gibi motor aksonları etiketleyen znp bir immünofloresan görüntülemek için konfokal mikroskopi kullanıldı. Motor nöronlar, çevredeki gelişmekte olan kas sistemini innerve etmek için döllenmeden 24 saat sonra omurilikten ventral olarak çıkar. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, dikkatli bir mikrodiseksiyon yoluyla dokuların bütünlüğünü korumayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı embriyolarının sarısını montaj ve mikroskobik görselleştirme için çıkarmak için mikrodiseksiyon tekniklerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.