Name: Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Öğrenin, yağ dokusundan bağışıklık hücrelerini izole etme yöntemini. Kollajenaz sindirimi ve santrifüjasyon ile makrofaj ve T hücrelerini akış sitometrisiyle nicelendirin. Bu teknik, immünometabolik hastalıklarda hücre popülasyonlarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JSO bir NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040) tarafından desteklenen, AK Amerikan Diyabet Derneği (7-10-MI-05) bir Doktora Sonrası Araştırma Bursu tarafından desteklenen ve AHH bir Amerikan Kalp Derneği Kurulmuş Araştırmacı Ödülü tarafından desteklenmektedir (12EIA8270000). Akış sistometri deneyleri VMC Sitometrisi paylaşılan kaynak yapılmıştır. VMC Sitometrisi Paylaşılan Kaynak Vanderbilt Sindirim Hastalıkları Araştırma Merkezi (DK058404) tarafından desteklenmektedir.

1. Reaktifler ve Malzemeleri Bundan önce deneysel protokol başlamadan, aşağıdaki reaktifler hazırlamak: <ol><li> % 70 etanol </li><li> 1X PBS </li><li> 1X DPBS (Ca ve Mg olmadan),% 0.5 BSA ile takviye edilmiş </li><li> FACS tamponu: 1X DPBS (Ca ve Mg), 2 mM EDTA,% 1 FCS </li><li> ACK tamponu: 150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3 ve su içinde 0.1 mM EDTA Na2 </li></ol> 2. Yağ Doku Hasat ve Hazırlık <ol><li> Her kurumun özel IACUC onaylı prosedürlere göre fareler Euthanize. </li><li> Iyice% 70 etanol ile kürk ıslak. </li><li> Kılıç şeklinde sürecinin seviyesinde (sternum alt kısmında) bir kesi yapmak ve herhangi bir büyük kan damarları sever özen, kalp ortaya çıkarmak için göğüs boşluğu açın. </li></ol> Not: Bu noktada, kadar diyafram olduğu gibi bırakmak da yararlı olurmümkün ve kan izin ve göğüs boşluğu dışına akmasına perfüzat için göğüs kafesinin sağ tarafında bir çentik kesmek için. <ol start="4"><li> Kan izin ve dolaşım sistemi kaçmak için perfüzat için sağ atrium klibi. </li></ol> Not: AT obez fareler, aşırı perikard ile uğraşırken kalbe erişime izin vermek için kaldırılması gerekebilir. <ol start="5"><li> Forseps ile kalp tutun ve yavaşça apeks ile sol ventrikül içine bir iğne takın. Yavaş yavaş 15 ml steril PBS ile perfüze fare. </li></ol> Not: akciğer doldurmak ve genişletmek başlar eğer perfüzyon oranını azaltın. <ol start="6"><li> Periton boşluğuna açın ve gonadal dokular önlemek için dikkatli kullanarak perigonadal yağ yastıkları kaldırın. </li><li> Bir yağ pedler,% 0.5 BSA ile takviye edilmiş 2 mi 1X DPBS (Mg veya Ca) olmadan içeren buz üzerinde tekne ağırlığında ve ince parçalar halinde AT kıyma. </li></ol>Not: başına AT miktarını sınırlandırın 1.2 g tekne tartın. AT miktarı 1.2 g aşarsa, iki tartmak tekne arasında eşit olarak bölmek. <ol start="8"><li> Buz üzerinde muhafaza edin örnekleri ve% 0.5 BSA, 10 mM CaCl2, ve 4 mg / ml kollajenaz, tip II ile desteklenmiş 1X DPBS içeren örnek hızında başına 3 ml kollajenaz sindirimi solüsyon hazırlanır. </li></ol> 3. Kollajenaz Sindirim <ol><li> Homojenat dökme edilir ve 1 ml DPBS (% 0.5 BSA) ve 3 ml kollajenaz sindirimi II çözeltisi ile tekne ağırlığında durulanarak 50 ml konik tüp aktarın. </li><li> 20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de döner bir çalkalayıcı (200 devir) ° C Homojenat inkübe edin. </li><li> Buz üzerinde konik tüpler ve yere 10 ml DPBS (% 0.5 BSA) ekleyin. </li><li> 10 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak serolojik defalarca homojenatı Karışım, ve yeni bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde 100 mikron filtre hücre süspansiyonları geçmektedir. </li><li> 4 ve D &#39;de 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücre süspansiyonu santrifüjörneğin; C. </li><li> Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon SVF hücre pelet 3 ml ACK tampon eritrositlerin kirletici lyse. </li><li> 4, 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de 12 ml FACS tamponu ve santrifüj hücre süspansiyonu ekleyin ° C </li><li> FACS tampon Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon SVF hücre pelet. </li></ol> Not: hücre pelet 50 ml konik tüp alt kapsıyorsa, 0.5-1 ml FACS tampon kullanmak içeri tekrar süspansiyon ne kadar FACS tampon için bir kılavuz olarak hücre pelet boyutu kullanın, aksi halde, 0,25-0,5 tekrar süspansiyon haline getirin ml. <ol start="9"><li> Yer buz üzerinde örnekleri ve karışım 40 ul FACS tampon maddesi, 50 ul tripan mavisi çözeltisi (% 0.2) ve 10 ul hücre süspansiyonu ile hücre sayımı için her bir numunenin 1:10 seyreltme alikotları hazırlamak. </li><li> Tripan mavi dışlama göre canlı hücre sayımı ve 5-10 x 10 6 hücre / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar hücre süspansiyonları seyreltin. </li></ol> 4. Hücre Yüzey Antijen boyanması <ol&gt; <li> 0.5-1 μg/10 6 hücre nihai bir konsantrasyona kadar anti-fare CD16/CD32 antikoru (Fc Bloku) ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Transferi örnekleri (≥ 10 6 hücre) için 12 x 75 mm polistiren yuvarlak alt tüpler. ATM ve T hücreleri analiz ise ayrı tüpleri hazırlayın ve gerekli tazminat ve modifiye floresan eksi bir (FMO) kontrol karşılamak için tüpler yeterli sayıda hazırlamak için ekstra hücreleri birleştirir. </li></ol> Not: Örnek olarak, F4/80 ve CD11b, aşağıdaki tazminat ve FMO kontroller dayalı ATM oranı miktarının zaman hazırlıklı olmak gerekir: - Boyanmamış (hücreler) - DAPI veya propidium iyodür (PI) tek leke (hücre; adım 5.1 kadar canlılığı boya eklemeyin) - F4/80 APC leke tek (hücre veya tazminat boncuk) - CD11b FITC (tek hücreler veya leketazminat boncuk) - FMO 1 (hücre): Rat IgG2a κ izotip kontrol APC + CD11b FITC + canlılığı boya (adım 5.1 eklenir) - FMO 2 (hücre): F4/80 APC + Rat IgG2b κ izotip kontrol FITC + canlılığı boya (adım 5.1 eklenir) <ol start="3"><li> (Reajanlar ve malzemeler, Tablo bakınız) uygun konsantrasyonda fluorofor konjuge birincil antikor ve / veya izotip kontrolleri ekleyin. </li><li> 30 dakika 4 ° C&#39;de ışık ve inkübe örnekler koruyun. </li><li> 4, 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de 2 ml FACS tamponu ve santrifüj hücre süspansiyonu ekleyin ° C </li><li> 2 ml FACS tamponu içinde tekrar süspansiyon ve süzün süpernatant SVF hücre pelletini. </li><li> ≥ 400 ul FACS tamponunda 5 4 ° C de dakika ve tekrar süspansiyon SVF hücre pelletini için hücre süspansiyonu 500 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 35 mikron hücre süzgecinden tüp üstleri ile donatılmış 12 x 75 mm polistiren yuvarlak alt tüplere örnekleri aktarın.</li><li> 4 ışık, ve mağaza örneklerinden koruyun ° C FACS analizi kadar. </li></ol> Not: En iyi sonuçlar için hücreler immeadiately analiz edilmelidir, ancak, bu protokol ile FACS analizi başarılı bir şekilde 4 ° C de 1-2 saat FACS tampon saklanan etiketli hücreleri üzerinde yapılmıştır Hücreler depolama süresi artırmak için sabit olması gerekiyorsa, etiketli hücreleri FACS analizden önce 24 saat 4 de 2% paraformaldehid ° C ile tespit edilebilir. Antikor şirketleri etiketli hücreleri bir haftaya kadar saklanabilir öneririz, ancak bu işlem kapsamında test edilmemiştir. 5. FACS Analizi <ol><li> Önce FACS analizi, ölü / canlı hücre ayrımı sağlamak için örnekleri ve uygun kontrollerin için canlılığı boya ekleyin. </li></ol> Not: Çok sayıda canlılığı boyalar ticari olarak mevcuttur, ancak DAPI ve PI uyarma / emisyon prof bağlı olarak tavsiye edilirfluorofor-konjuge antikor iles kullanılmaktadır. DAPI ve propidyum iyodür 0.2 mg / ml &#39;lik bir son konsantrasyonda her numuneye eklenir. <ol start="2"><li> İlgi hücre popülasyonu (ler) ölçeği üzerinde, böylece yan dağılım (SSC) ve öne dağılım (FSC) ayarlamak için, deney örnekleri, aynı doku izole boyanmamış bir negatif kontrol örneği, tercihen de hücreleri kullanır. </li></ol> Not: SVF hücrelerin AT analizi için, SSC doğrusal bir ölçekte FSC karşı bir günlük ölçekte görüntülenir önerilir. Genellikle çok büyük ve taneli olan ATM&#39;ler, analiz ederken SSC için bir günlük ölçek kullanımı özellikle önemlidir. <ol start="3"><li> Analiz edilen hücre (ler) türüne göre bir ilk ışık yayılımı kapısı çekmek ve lekesiz hücreler kadar (yaklaşık 10 2 merkezli) bir tek parametre histogram sol üzerinde olacak şekilde photomultiplier tüp (PMT) kazancı ayarlayın uygun kanallar için. &lt;/ Li&gt; </ol> Not: Bu lenfositler ve makrofajlar (veya diğer miyeloid hücreleri) nedeniyle otofloresans farklılıkları ayrı ayrı analiz edilmesi tavsiye edilir. <ol start="4"><li> Çok renkli tazminat gerçekleştirmek için tek lekeli denetimleri veya antikor yakalama tazminat boncuk kullanın. </li></ol> Not: tazminat boncuk kullanılması tavsiye edilir, ancak, her antikor uyumluluğu sağlanmalıdır. Örneğin, kompanzasyon boncuk izole edilmiş hücreler, uygun bir tek leke kontrol elde etmek için gerekli olduğu durumda, tavşan antikorları ile çapraz reaksiyona olmayabilir. <ol start="5"><li> Modifiye FMO kontroller dayalı deneysel kapıları ayarlayın. </li><li> Ilgi nüfusunun yaygınlığı dayalı olayların uygun sayıda toplamak ve deneysel veri kaydetmek için akış sitometresi ayarlayın. </li><li> İhracat FCS veri çevrimdışı analiz için dosyaları. Akış cytometr için çok sayıda program vardıry veri analizi. Biz Cytobank, investigatores internet erişimi 18 olan herhangi bir bilgisayardan rakamlar saklamak ve analiz veri ve oluşturmak sağlayan bir web-tabanlı bir platform tavsiye ederiz. Ayrıca, Cytobank veri kamu erişilebilir yapmak veya ortak erişimi kısıtlamak için olanağı sunar. </li></ol>

<ol><li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+Isolated+Fat+Cells.+I.+Effects+of+Hormones+on+Glucose+Metabolism+and+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).</li>
<li>Danse, L. H., Verschuren, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+oil-induced+yellow+fat+disease+in+rats.+III.+Lipolysis+in+affected+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue.</a> Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).</li>
<li>Weisberg, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+is+associated+with+macrophage+accumulation+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+in+fat+plays+a+crucial+role+in+the+development+of+obesity-related+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).</li>
<li>Mathis, D., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism%3A+an+emerging+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism: an emerging frontier.</a> Nature Reviews. Immunology. 11, 81(2011).</li>
<li>Stefanovic-Racic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+promote+macrophage+infiltration+and+comprise+a+substantial+proportion+of+obesity-associated+increases+in+CD11c%2B+cells+in+adipose+tissue+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver.</a> Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).</li>
<li>Feuerer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lean%2C+but+not+obese%2C+fat+is+enriched+for+a+unique+population+of+regulatory+T+cells+that+affect+metabolic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters.</a> Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).</li>
<li>Winer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+obesity-associated+insulin+resistance+through+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy.</a> Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).</li>
<li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+invariant+natural+killer+T+cells+by+lipid+excess+promotes+tissue+inflammation%2C+insulin+resistance%2C+and+hepatic+steatosis+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America.+109%22%5BJournal%5D)">Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophils+sustain+adipose+alternatively+activated+macrophages+associated+with+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis.</a> Science. 332, 243-247 (2011).</li>
<li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).</li>
<li>Talukdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+insulin+resistance+in+mice+fed+a+high-fat+diet+through+secreted+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase.</a> Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).</li>
<li>Hagman, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+quantifying+leukocyte+populations+in+human+adipose+tissue%3A+impact+of+enzymatic+tissue+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing.</a> Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10(2010).</li>
<li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45, 194-205 (2001).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Obezite metabolik sonuçlara bağışıklık sisteminin rolü artan ilgi AT bağışıklık hücreleri karakterize etmek için flow sitometri yaygın kullanımı yol açmıştır. Tam protokolü kendi deneyim ve ekipmanları mevcut dayalı laboratuarlar arasında farklılık olsa da, kritik adımlar kollajenaz sindirim, diferansiyel santrifüj, ve hücre yüzey antijeni etiketleme içerir. Bu makalenin amacı AT ve / veya akım sitometri performans ile çalışan sınırlı deneyimi ile araştırmacılara SVF AT ve izolasyonu için ayrıntılı bir protokol ve prati...

Tarihsel olarak, yağ dokusu (AT) enerji dengesi yanıt olarak genişler ve sözleşmeleri lipid depo, bir asal organı olarak incelendi. Şimdi AT aktif doğrudan beslenme davranışları ve sistemik glikoz dengesini etkileyen hormonlar, bir dizi salgılar dinamik bir endokrin organı temsil anlıyorum. Buna ek olarak, son on yıl içinde stromal vasküler fraksiyonu (SVF) yanı sıra, homeostasis katkıları için AT ikamet eden bağışıklık hücrelerinin çok sayıda nüfus için artan bir takdir olmuştur. Ilk olarak 1964 1&#39;de Rodbell tarafından tanımlanmıştır adiposit ve SVF bir kollajenaz sindirimi kullanma yeteneği ayrı ve ardından diferansiyel santri. Kollajenaz II genellikle adiposit insülin reseptörlerinin 1 bakım nedeniyle adiposit ve SVF ayrılması için kullanılır. AT erken, enzimatik fraksiyon öncelikle adipo çalışma istihdam edildimetabolizması Eritrosit ve preadipositlerden izole etmek. Daha yakın zamanlarda, akış sitometrelerinde yaygın olarak kullanılması ve ticari fluorofor-konjuge antikor giderek artan sayıda ile birlikte bu teknik, bağışıklık hücrelerinin AT karakterizasyonu kolaylaştırmıştır. AT iltihaplı bağışıklık hücrelerinin varlığı daha önce 2 tarif edilmiş olmasına rağmen, Weisberg ve arkadaşlarının seminal kağıtları. Xu ve ark. yayınlanan 2003 yılında inflamatuvar sitokinler salgılarlar ve AT-özel ve sistemik insülin direnci 3,4 ile ilişkili obezitede makrofajlar AT birikimi (ATM), belgelemek için ilk idi. Bu gözlemler soruşturma yeni bir alan temelinde son zamanlarda, &quot;immunometabolism,&quot; 5 icat olarak görev yaptı ve dendritik hücreler 6, mast hücreleri 7, T hücreleri 8 dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücre popülasyonlarının, karıştığı çalışmalarla takip edilmiştir -10, 11 B hücreleri, NKT hücreleri, 12, 13 eozinofiller ve nötrofiller obezite ilişkili insülin direncinin geliştirilmesinde 14,15. Bu makalenin amacı SVF AT hücreleri izole etmek ve ATM karakterize ve akış sitometri ile T hücreleri AT için kullanılan kollajenaz özeti tekniğin ayrıntılı bir açıklama sunmaktır. Bu protokol AT fare için optimize edilmiştir, ancak, izleyiciler 16 AT insan için bu tekniğin optimizasyonu hakkında geniş detay veren mükemmel bir makale okuyarak yararlanabilir. Bu makalenin hedef kitlesi sınırlı deneyimi AT fare ile çalışan ve akım sitometri performans ile araştırmacılar içerir. Zaman ve kaynak ile hücresel verim ve canlılığı dengelemek için birkaç pratik hususlar bağışıklık hücre popülasyonlarının AT tanımlamak için de en uygun akım sitometri kontrol grubu olarak sunulmaktadır. Protokolde ek olarak, okuyucu referr vardıruygun kontrolleri ve tazminatlar 17 dahil etmek akım sitometri teknik yönlerini bazı mükemmel bir tartışma için Basu ve ark. tarafından yapılan son vallahi makaleye ed.

<table><tbody><tr><td>DPBS (Ca veya Mg yok) 10 x 500 ml</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>kollajenaz</td><td>Sigma</td><td>C6885-5G</td><td></td></tr><tr><td>propidyum iyodür çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>P4864-10 ml</td><td></td></tr><tr><td>kararlı yığın 20 mikrolitre</td><td>Rainin</td><td>SS-L10</td><td></td></tr><tr><td>20 mikrolitre filtre uçları</td><td>Rainin</td><td>SRL10F</td><td></td></tr><tr><td>sabit yığın 250 mikrolitre uçlar</td><td>Rainin</td><td>SS-L250</td><td></td></tr><tr><td>1000 mikrolitre uçlar</td><td>Rainin</td><td>GPS-L1000</td><td></td></tr><tr><td>1000 mikrolitre filtre uçları</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>250 mikrolitre filtre uçları</td><td>Rainin</td><td>SR-L200F</td><td></td></tr><tr><td>FC Bloğu</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>fisher 100mn süzgeçler</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>orta ağırlıkta tabak</td><td>Fisherbrand</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>alüminyum folyo</td><td>Fisherbrand</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>kıyma makası</td><td>Fisherbrand</td><td>089531B</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>filtre üstü FACS tüpleri</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipet kutusu 200</td><td>BD Falcon</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 ml şırınga</td><td>BD Falcon</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>V Alt Plakalar</td><td>Costar</td><td>07-200-107</td><td></td></tr><tr><td>transfer ampul pipeti</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>Thermo Scientific</td><td>11 676 071</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan mat</td><td>Thermo Scientific</td><td>1368750</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Santrifüjü</td><td>Sorvall</td><td>75253839</td><td></td></tr><tr><td>Adaptörleri</td><td>Sorvall</td><td>75003723</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD16 / CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Konsantrasyonu: 0.5 - 1 &mu; g / 106 hücreleri</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare F4 / 80</td><td>eBioscience</td><td>17-4801</td><td>Florofor konjugat: APC Konsantrasyon: 0.2 & mu; g / 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: 17-4321</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Florofor konjugat: FITC Konsantrasyon: 0.5 & mu; g / 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: 11/1/4031</td></tr><tr><td>Ermeni Hamster anti-fare CD11c</td><td>eBioscience</td><td>12-0114</td><td>Florofor konjugat: PE Konsantrasyon: 0.8 &mu; g / 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: Dec-88</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare MGL1/2</td><td>R& D Sistemleri</td><td>FAB4297P</td><td>Florofor konjugat: PE Konsantrasyon: 0.1 & mu; g / 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: IC108P</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare CD206</td><td>R& D Sistemleri</td><td>FAB2535P</td><td>Florofor konjugat: PE Konsantrasyon: 0.1 & mu; g / 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: IC108P</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CCR2</td><td>R& D Sistemleri</td><td>FAB5538P</td><td>Florofor konjugat: PE Konsantrasyon: 0.1 & mu; g/ 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: IC013P</td></tr><tr><td>Ermeni Hamster anti-fare TCR&#946;</td><td>BD Biosciences</td><td>553174</td><td>Florofor konjugat: APC Konsantrasyon: 0.2 &mu; g / 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: 553956</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>552877</td><td>Florofor konjugat: PE-Cy7 Konsantrasyon: 0.8 & mu; g / 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: 552784</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>557956</td><td>Florofor konjugat: Alexa Fluor 700 Konsantrasyon: 0.2 & mu; g/ 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: 557963</td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 1. Malzemelerin ve Reaktiflerin Listesi.</td></tr></tbody></table>

yağ doku bağışıklık hücre İzolasyonu

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Obez kemirgenler ve insanların yağ dokusunda artış makrofaj infiltrasyonu (AT) keşfinden lokal ve sistemik insülin direnci ile bağışıklık hücre katkı ilgi yoğunlaşmasına yol açmıştır. Yalın ve obez AT farklı bağışıklık hücre popülasyonlarının izolasyonu ve miktar şimdi immunometabolism laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir; henüz çok dikkatli elde edilen verilerin güvenilir ve yorumlanabilir bir şekilde stromal vasküler hücre izolasyonu ve akım sitometri analizi hem alınmalıdır . Bu videoda, kıyma sindirmek ve bağışıklık hücre ile zenginleştirilmiş stromal vasküler kısmını izole nasıl gösterilmektedir. Daha sonra, biz antikor etiket makrofajlar ve T lenfositler ve nasıl akım sitometri deneylerde onlara doğru kapı için nasıl gösterir. Az yağlı beslenen yalın ve yüksek yağ ile beslenen obez fareler Temsilcisi akım sitometri araziler sağlanmaktadır. Bu analizin önemli bir unsuru, mutlaka antikorların kullanımımakrofajlar AT doğal autofluorescent kanallar, hem de uygun tazminat kontrollerin kullanımı floresan değil.

Diferansiyel santrifüj takip AT kollajenaz sindirim az yağlı (yağ% 10 kcal) veya yüksek yağ (yağ% 60 kcal) diyet (LFD ve YYD beslenen erkek C57BL/6J farelerin epididim yağ yastıkları gelen SVF izole etmek için kullanıldı sırasıyla) 16 hafta boyunca. SVF hücreleri, daha sonra FACS analizi ile uygun bir ATM (Şekil 1) ve T-hücreleri (Şekil 2) oranını ölçmek için bir fluorofor konjuge primer antikorlar ile işaretlenmiştir. Işık yayılımı, çift ayrımcılık ve canlılığı kapıları da dahil olmak ...

Yağ dokusu (AT) yoğun bağışıklık hücre aktivasyonu ve etkileşim bir sitedir. Bağışıklık sisteminin hemen hemen tüm hücreleri AT mevcut olan oranını obezite etkilenir. Bağışıklık hücre popülasyonlarının AT uygun izolasyon, miktar ve karakterizasyonu immunometabolic hastalık rolleri anlamak için önemlidir.

Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Bu prosedürün genel amacı, yağ dokusu bağışıklık hücrelerini izole etmektir. Bu, önce epidermal yağ yastıkçıklarının çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci aşamada kollajenaz ile yağ dokusu sindirilir.Daha sonra, yağ dokusu stromal vaskülatür fraksiyonu, diferansiyel santrifüjleme yoluyla izole edilir. Son adımda, yağ dokusu bağışıklık hücreleri, floro dört konjuge primer antikor ile etiketlenir. Sonuç olarak, yağ dokusunda bulunan canlı makrofajların ve T hücrelerinin oranı akış sitometrisi ile ölçülebilir.Merhaba, ben Alyssa Hasty. Bugün size bağışıklık hücrelerini yağ dokusundan nasıl izole edeceğinizi ve ölçeceğinizi göstereceğiz. Bu yöntem, genetik, farmakolojik veya beslenme manipülasyonunu takiben yağ dokusundaki bağışıklık hücresi popülasyonlarının nasıl değiştiği gibi immüno-metabolizma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bugün prosedürü göstermek Arian Kennedy ve Jeb ya da laboratuvarımdaki doktora sonrası arkadaşlar olacak. Ötenazi yapılmış hayvanın kürkünü %70 etanol ile iyice ıslattıktan sonra, ksifoid işlemi seviyesinde bir kesi yapın ve herhangi bir ana kan damarını kesmemeye dikkat ederek kalbi açığa çıkarmak için göğüs boşluğunu açın. Ardından, kanın ve parfüm sekizinin dolaşım sisteminden çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu klipsleyin.Daha sonra kalbi kavramak için bir çift forseps kullanın ve apeksten sol ventriküle yavaşça bir iğne sokun. Şimdi fareyi 15 mililitre steril PBS ile yavaşça perfüze edin. Daha sonra periton boşluğunu açın ve herhangi bir gonadal dokudan kaçınmak için dikkatli bir şekilde pereg gonadal yağ yastıklarını çıkarın.Yağ pedlerini,% 0.5 BSA ile desteklenmiş iki mililitre magnezyum ve kalsiyum içermeyen DPBS içeren buz üzerinde bir peynir altı suyu teknesine yerleştirin ve ardından yağ dokusunu ince parçalar halinde kıyın. Kıyma işlemi tamamlandıktan sonra yağın nasıl görünmesi gerektiği budur. Şimdi kıyılmış yağ dokusu homojenatını 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün.Webo'yu BSA ile takviye edilmiş bir mililitre DPBS ile durulayın ve yıkamayı konik tüpe dökün. Daha sonra, WHE teknesini üç mililitre kollajenaz çözeltisi ile durulayın ve yıkamayı tüpe dökün. Homojeni rotasyonel bir çalkalayıcıda 200 RPM ve 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.Daha sonra 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak homojenata 10 mililitre BSA takviyeli DPBS ekleyin. Daha sonra, sindirilmiş homojenatı birkaç kez tekrarlayın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir filtreden 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe geçirin.Hücreleri döndürdükten sonra, snat'ı boşaltın ve ardından stromal vasküler fraksiyon hücre peleti içindeki kontamine eritrositleri bitleyin. Üç mililitre CK tamponu ile. A CK arabelleğini etkisiz hale getirmek için hızlı bir şekilde faks arabelleği ekleyin.Yıkandıktan ve yeniden peletlendikten sonra, hücreler peleti faks tamponunda yeniden süspanse eder. Daha sonra canlı hücreleri trian mavisi dışlama ile sayın ve hücre süspansiyonunu mililitre başına beş ila 10 kez 10 ila altı hücrelik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Hücreleri anti-US CD 16, CD 32 FC bloke edici antikor ile buz üzerinde 10 dakika boyunca altı hücreye 10 başına 0.5 ila bir mikrogramlık bir nihai konsantrasyona inkübe ederek boyamaya başlayın.Daha sonra hücreleri 10 ila altı alikottan daha büyük veya buna eşit olarak bölün ve alikotları 12 x 75 milimetre polistiren yuvarlak tabanlı tüplere aktarın. Gerekli kompanzasyon ve modifiye edilmiş floresan eksi bir kontrolü karşılamak için ekstra hücreleri yeterli sayıda tüpte birleştirin. Daha sonra floro dört konjuge primer antikor ve izotip kontrollerini uygun konsantrasyonlarda uygun tüplere ekleyin.Numuneleri karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe ettikten sonra, numuneleri iki mililitre faks tamponunda iki kez yıkayın Resus, peletleri 400 mikrolitre veya daha fazla faks tamponuna eşit bir şekilde askıya alın İkinci yıkamadan sonra, numuneleri 35 mikrometre hücre süzgeci tüp üstleri ile donatılmış yeni 12 x 75 milimetre polistiren yuvarlak tabanlı tüplere aktarın. Analizden hemen önce, uygun numunelere canlı ölü hücre ayrımı için bir canlılık kalıbı ekleyin. Ardından, günlük ölçeğinde yan saçılmayı ve doğrusal ölçekte ileri saçılımı ayarlamak için lekelenmemiş bir negatif denetim kullanın.Daha sonra, analiz edilen hücre tipine bağlı olarak bir ilk ışık saçılma kapısı çizin ve fotoçoğaltıcı tüp kazancını, boyanmamış hücreler tek bir parametre histogramının en solunda olacak ve yaklaşık olarak uygun kanallar için iki işaretin eğilimi üzerinde ortalanacak şekilde ayarlayın. Antikor yakalama kompanzasyon boncuklarını kullanarak, çok renkli telafisini gerçekleştirin ve ardından deney kapılarını önceden hazırlanmış modifiye edilmiş floresan eksi bir kontrole göre ayarlayın. Son olarak, ilgilenilen popülasyonun yaygınlığına dayalı olarak uygun sayıda olay toplayın ve deneysel verileri kaydedin.Bu ilk yoğunluk grafikleri serisinde, idrar epidermal yağ dokusundan izole edilen stromal vasküler fraksiyon hücreleri, yağ dokusu makrofajlarının tanımlanması için F four 80 ve CD 11 B için boyandı. Bu ilk üç panel, ışık saçılımı çift ayrımı ve canlılık kapıları dahil olmak üzere ilk geçit stratejisini göstermektedir. Bu sonraki iki panelde, deney kapılarını ayarlamak için kullanılan temsili modifiye floresan eksi bir kontrol gözlemlenebilir.Bu örnekte, F dört 80 ve CD 11 B antikorları, otofloresan ve spesifik olmayan bağlanmayı hesaba katmak için uygun izotip kontrolleri ile değiştirildi. Kadran kapıları daha sonra canlı F dört 80 CD 11 B pozitif yağ dokusu makrofajlarını tanımlamak için çizildi. Düşük yağlı ve yüksek yağlı beslenen farelerden izole edilen F dört 80 pozitif CD 11 B pozitif yağ dokusu makrofajlarının oranı daha sonra bu temsili yoğunluk grafiklerinde gösterildiği gibi karşılaştırılabilir.Bu sonraki panel serisinde, ilk ışık saçılma kapısı, herhangi bir otofloresan miyeloid hücrenin dahil edilmesini önlemek için lenfosit popülasyonu ile sınırlandırıldı. Bu son iki panel çiftinde, CD dört pozitif ve CD sekiz pozitif yağ dokusu T hücreleri için temsili geçit gösterilmiştir. Canlı yağ dokusu lenfositleri ilk olarak TCR R beta tcr için kapılandı.R beta pozitif yağ dokusu T hücreleri daha sonra CD dört ve CD sekiz ekspresyonu için kapılandı. Yüksek yağlı ve düşük yağlı beslenen farelerin yağ dokusundan izole edilen TCR beta pozitif T hücrelerinin ve CD dört pozitif ve CD sekiz pozitif T hücrelerinin oranı daha sonra karşılaştırılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, yağ dokusu bağışıklık hücrelerinin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, murin periaortik ark yağ dokusundan floresan etiketli nöral krestten türetilmiş adipoz türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. İzolasyonu takiben, NCADSC'ler tespit edilir, floresanla aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak sıralanır ve daha sonra hücre proliferasyonunu teşvik ederek bir plaka üzerinde kültürlenir.

Murin Periaortik Yağ Dokusundan Yağ Kaynaklı Kök Hücrelerin İzole Edilmesi

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

Nedeniyle obezite ve diğer yandaş arasındaki şiddetli ve negatif bağlantı, rol adipoz araştırma hastalığında oynadığı ve genel sağlık garantilidir. Biz izolasyon ve yerinde kullanarak adipoz çalışması için izin yağ depolarında eksizyonu ve in vitro yöntemler bir protokol mevcut.

Yerelleştirme, Kimlik ve Eksizyon Kemirgen Yağ depolarının

Gen ekspresyonlarını ve kollajenolitik aktivitelerini değerlendirmek için stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fare inguinal (subkütan) ve perigonadal (viseral) yağ dokusu depolarından izole etmek için gerekli teknikleri sunuyoruz. Bu yöntem, immünomanyetik hücre ayrımı kullanılarak Sca1yüksek yağ kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) zenginleştirilmesini içerir.

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma<sup&gt; yüksek</sup&gt; Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)

Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Floresan aktif hücre sıralamasını kullanarak fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek oranda uygulanabilir yağ progenitör hücrelerini izole etmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

Burada, &gt;90% işlem süresi azalması, yüksek hücre canlılığı ve geniş uyumlulukla karakterize edilen yağ kaynaklı kök hücreleri ve adipositleri verimli şekilde izole etmek için standart bir yöntem sunuyoruz.

Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu

Öğrenin, yağ dokusundan bağışıklık hücrelerini izole etme yöntemini. Kollajenaz sindirimi ve santrifüjasyon ile makrofaj ve T hücrelerini akış sitometrisiyle nicelendirin. Bu teknik, immünometabolik hastalıklarda hücre popülasyonlarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Daha fazla video keşfet