Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

Deneyin genel amacı, glutamatın eksitatör sinapslardan salınımının ardından astrositik membranlardan temizlenme zaman sürecini tahmin etmektir. Bu sürecin ilk adımı, geniş spektrumlu glutamat taşıyıcı antagonisti TBOA'nın doymuşluk altı bir konsantrasyonunun yokluğunda ve varlığında, akut beyin kesitlerindeki astrositlerden sinaptik olarak aktive edilen glutamat taşıma olayını kaydetmektir. İkinci adım ise, sinaptik olarak aktive edilen glutamat taşıyıcı akımlarını, uyandırılmış yanıtın diğer tüm bileşenlerinden ayırmak için kayıtları analiz etmektir.

Ardından, kontrollü koşullarda kaydedilen taşıma olayından filtreleme sürecini çıkararak, TBOA varlığında kaydedilen taşıyıcı akımları analiz edilip filtreleme zaman seyri tahmin edilir. Astrosite membranlarından glutamat temizlenmesinin zaman seyri elde edilir. Sonuçlar, fare hipokampusundaki astrositlerin, sinaptik olarak salınan glutamatı hücre dışı boşluk tabanından temizlemek için yalnızca birkaç milisaniyeye ihtiyaç duyduğunu göstermektedir.

Bu yaklaşım, fizyolojik ve patolojik durumlar sırasında farklı beyin bölgelerindeki astrositik alım kapasitesindeki değişiklikleri tespit etmek için hassas bir araç sunmaktadır. Bu yaklaşımın, örneğin floresan glutamat indikatörleri üzerindeki hızla ayrışan glutamat reseptörü antagonistlerinin yer değiştirme analizine veya difüzyon reaksiyonu bilgisayar simülasyonlarına dayanan diğer yöntemlere göre temel avantajı, astrositlerden glutamat temizlenmesinin doğrudan deneysel okumasını ve yüksek bir zamansal çözünürlük sağlamasıdır. Bu yöntem, beyindeki sinaptik iletimin mekânsal ve zamansal dinamiklerini anlamamıza olanak tanır.

Bu yöntem, Alzheimer hastalığı gibi belirli nörolojik bozukluklarda meydana gelebilen glutamat, difüzyon ve alım ile ilgili patofizyolojik değişiklikleri yorumlamamıza yardımcı olabilir. Bu prosedüre, diseke edilmiş bir fare beynine bistüri ile beş kesi yaparak başlayın. İlk olarak, olfaktör bulbları ve frontal korteksi çıkarın.

İkinci olarak serebellumu çıkarın. Ardından sol ve sağ temporal lobları çıkarın. Sonra iki beyin hemisferini orta sagital kesi ile ayırın.

Ardından, her bir beyin kesitinin lateral yüzeyini soğuk vibram taban plakasına yapıştırın. Beynin dorsal tarafı Vibram bıçağına bakmalı ve ventral tarafı, vibrato bıçağından uzak olacak şekilde agar bloğu ile temas etmelidir. Daha sonra vibrato taban plakasını diseksiyon odasına sabitleyin.

Kesit kalınlığını 250 micrometers olarak ayarlayın ve kesme işleminden önce bıçağın genişliğini düzenleyin. Bıçak korteks ve hipokampustan geçtikten sonra, korteks hipokampusu orta beyinden ayırmak için bir skalpel kullanın. Ardından, kesitleri 30 dakika boyunca 34 degrees Celsius'de beklettikten sonra, bir kesiti 34 degrees Celsius'deki daldırma haznesine yerleştirin.

Bu prosedürdeki elektrofizyolojik kayıtlar için kullanmadan önce, dilimleri 30 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın, ardından bir dilimi kayıt haznesine aktarın. Dilimi nokta aydınlatma veya I-R-D-I-C altında görsel olarak inceleyin. Astrositler, sinaptik stimülasyon için küçük hücre gövdeleri ve belirgin çekirdekleri aracılığıyla tanımlanabilir.

Bipolar paslanmaz çelik bir elektrodu, patch yapmayı planladığınız astrositten yaklaşık 100 µm uzağa yerleştirin. Astrosite patch uygulayın ve çok hafif bir vakum uygulayarak whole cell konfigürasyonuna geçiş yapın. Ardından, sinaptik olarak aktive edilen taşıma olayının kolaylaştırılmış kısımlarını izole etmek için her 10 ila 20 saniyede bir tekli ve çiftli stimülasyonları dönüşümlü olarak uygulayın.

Öncelikle, kontrollü koşullarda ve 10 µM geniş spektrumlu glutamat taşıyıcı antagonist TBOA varlığında, çiftli stimülasyonlarla elde edilen en az 20 sweep'in ortalamasını alın. Ardından, kontrol koşullarında ve 10 µM TBOA varlığında, tekli stimülasyonlarla elde edilen aynı sayıdaki sweep'in ortalamasını alın ve tekli stimülasyonlarla elde edilen ortalama izi, çiftli stimülasyonlarla elde edilen ortalama izden çıkarın. Bu adım, STO geometrisinin ve ikinci stimulus tarafından uyarılan sürdürülebilir potasyum akımının izole edilmesini sağlar.

Bir sonraki aşamada, eşli darbeler iletmek için kullanılan PUL aralığına uygun bir zaman aralığı ile tekli stimülasyonlarla elde edilen ortalama iz kaydırılır; ardından zaman kaydırmalı olarak tekli stimülasyonlarla elde edilen ortalama yanıt, daha önce elde edilen ikinci stimülasyona verilen ortalama yanıttan çıkarılır. Bu adım, ikinci stimülasyonla uyarılan taşıyıcı akımının kolaylaştırılmış kısmını izole eder. Çoğu durumda, bu adım sürdürülen potasyum akımını tamamen ortadan kaldırır.

Eğer durum böyleyse, FSTC izolasyonu tamamlanmıştır; dekonvolüsyon analizine geçebilir ve astrositlerden glutamat temizlenmesinin zaman seyrine ulaşabilirsiniz. Ancak bazı durumlarda, küçük ve süregelen bir potasyum akımı hâlâ mevcut olabilir ve daha fazla analiz gerekebilir. İşlemi gerçekleştirdikten sonra kalan süregelen potasyum akımının genliğini ölçün.

Önceden açıklanan analiz, ölçülen sürekli potasyum akımının genliğini bu denklemdeki a olarak belirleyerek, mono eksponansiyel fonksiyonun genliğini kalıcı sürdürülen potasyum akımının genliğiyle ölçeklendirir. Ancak yükselme zaman sabiti, sürekli bir potasyum akımının izole edildiği ayrı deneylerde tahmin edilen ortalama yükselme değerini temsil eder. Farmakolojik olarak yüksek doyurucu konsantrasyonda TBOA kullanıldıktan sonra, ortaya çıkan mono eksponansiyel fonksiyon FSTC ve sürekli potasyum akımından çıkarılır.

FSTC izolasyonunu tamamlamak için. Flaşla aktive edilmiş taşıma olayını izole etmek üzere; kontrol koşullarında ve 10 micromolar TBOA varlığında, ışık yolu açıkken elde edilen en az 20 süpürmenin ortalamasını alın; ardından kontrol koşullarında ve 10 micromolar TBOA varlığında ışık yolu kapalıyken elde edilen aynı sayıdaki süpürmenin ortalamasını alın ve ışık yolu engelliyken elde edilen ortalama izi, ışık yolu açıkken elde edilen ortalama izden çıkarın.

Bu adım, stimülasyon artefaktının kaldırılmasını ve FTC'lerin izole edilmesini sağlar; bu aşamada kontrol koşullarında ve 10 µM TBOA ile kaydedilen taşıma akımı (FSTC veya FTC) sığdırılır ve bunlar çoklu üstel bir fonksiyonla fit edilir; 10 µM TBOA ile kaydedilen taşıyıcı akımının sönümlenme fazını en iyi tanımlayan ve bu fonksiyona göre mono-üstel olarak sönümlenen, anlık yükselen bir fonksiyon oluşturulur. Ardından, filtreyi türetmek için 10 µM TBOA ile kaydedilen taşıyıcı akımı fitinden elde edilen mono-üstel fonksiyon çıkarılır (deconvolve edilir). Daha sonra, kontrol koşullarındaki taşıyıcı akımı fitinden filtre çıkarılır.

Glutamat temizlenmesinin genel zaman seyri hakkında nicel bir tahmin elde etmek için, bu prosedürü uygularken dalga formunun OID değerini hesaplayın. Taşıma olaylarının, filtrenin lineer rejimde çalıştığı ve taşıma üzerinde yalnızca lineer distorsiyonlar oluşturduğu deneysel koşullar altında kaydedildiğini onaylamak önemlidir. Bu işlem, taşıma akımının boyutunu değiştiren manipülasyonlar kontrol edilerek gerçekleştirilebilir.

Damga yolunu değiştirmeyin. Bu videoyu izledikten sonra, beyindeki glutamat, difüzyon ve alım hakkında bilgi elde etmek için astrositik kayıtların nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.