Name: Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Öğrenin, fare embriyonik ince bağırsaklarından elde edilen enterik sinir progenitörlerinin kantitatif hücre göç analizini. Bu yöntem, gelişimsel biyolojide çeşitli büyüme faktörlerinin etkisini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz görüntü işleme ve analiz için tavsiye Denis Flipo teşekkür ve David W. Silversides kimin laboratuvar olarak Gata4p [5kb]-GFP fare hattı oluşturuldu. Pilon Araştırma laboratuvarında CIHR, NSERC, FRQS ve FRQNT tarafından finanse edilmektedir.

Etik beyanı Fareleri içeren deneyleri tıbbi araştırmalarda kullanılan hayvanların bakım ve manipülasyon için Hayvan Bakım kurallar Kanada Konseyi takip yapıldı. Hayvanların manipülasyon içeren protokolleri Montreal Quebec Üniversitesi&#39;nden kurumsal etik komitesi tarafından onaylandı (Comite Institutionnel de Koruma des Animaux; referans numarası 0512-R3-650-0513). 1.. Kollajen Jeller hazırlanması Bir doku kültürü kaputu altında, steril bir şekilde çalışır. <ol><li> Standart antibiyotik dahil tam 5x DMEM&#39;yi (Eagle modifiye temel orta) hazırlayın. 20 ml su içinde DMEM tozu ve NaHCO 3 0,925 g 3.37 g çözülür. 0.22 um&#39;lik bir filtreden geçirilerek sterilize edin. Steril 100x penisilin / streptomisin ve steril ısıyla etkisiz hale getirilen fetal sığır serumu, 25 ml 2.5 ml ekle. 4 ° C&#39;de saklayın </li><li> Buz, 800 ul mix, tam 5x 600 ul DMEM ve 1 N NaOH 17 ul Kollajen I çözeltisi (0.02 N, asetik asit, filtre ile sterilize edilmiş olarak 3,77 mg / ml). 3 ml&#39;lik bir son hacme kadar steril su ile seyreltilir. Karışımı ilgili büyüme faktörlerini içerir. Genellikle bağırsak hareketini uyarıcı etki gösterir NCC için 10 ng / ml &#39;de GDNF kullanın. </li><li> , 24 oyuklu bir plaka içerisinde tek bir sıra her çukuruna Deposit yaklaşık 480 ul. Kabarcıkları kaçının. Geri kalan satırlar hücre göçü ile ilgili diğer büyüme faktörlerinin etkisini test etmek için de kullanılabilir. </li><li> Kollajen 37 ° C&#39;de steril bir kuluçka makinesi içinde en az 1 saat süreyle polimerize olsun </li></ol> 2. Hayvanlar 16 diseksiyonu <ol><li> Çiftleşmesi kurmak ve ertesi sabah vajinal fişleri kontrol edin. Gün E0.5, vajinal fiş bulunan gününde öğlen olmak kadın yalıtmak ve E12.5 kadar 12 gün bekleyin. </li><li> Izofluran ile hamile fareler anestezi ve CO 2 inhalasyon yoluyla euthanize. </li><li> % 70 etanol ile fare püskürtün. Karın s kaldırınkin ve diseksiyon makas ile karın boşluğu açmak. </li><li> Buz soğukluğunda PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) ile doldurulmuş, cam bir Petri kabı içine rahim çıkarın. Her bir embriyo implantasyonu sitesi izole etmek için tek tek enine biçimde deciduum şişlikler arasındaki rahim kesin. </li><li> Buz gibi soğuk PBS ile dolu bir cam petri ayrı ayrı her bir implantasyon sitede çalışın. Bir mikroskop altında, rahim kas tabakası kaldırmak için ince forseps kullanır. </li><li> Embriyo ortaya çıkarmak için visseral sarısı kesesi ve amniyon açın. Onlar gelişen bağırsak ile iç içe olarak, plasenta / visseral yumurta sarısının için embriyo katılarak kan damarlarını severing dikkatli olun. </li><li> Boyunda embriyonun başını Sever. </li><li> Sadece koyu kırmızı renkli karaciğer üzerinde, bir embriyonun karın boşluğunda kapalı forseps yerleştirin ve karın boşluğunda bir çapraz açılış yapmak için (basınç uygulayarak durdurmak) kendisi forseps açalım. Doğru açılan forseps aşağı çekintamamen karın açmak için embriyonun arka ucu. </li><li> Karaciğer arkasında bağ dokusu tut ve (kolon anüs bağlı) bağırsakları kırmak için dikkatli olmak, karın dışarı cesareti çekin. </li><li> Embriyonun geri kalanından bağırsaklar serbest bırakmak için kolon kesin. Kesilen kolon boyunca herhangi bir yerde yapılabilir. Sonrası için kuyruk kısmını rezerv. </li><li> Çekum bağ dokusu, bağırsakların daha sonra kalanını didiklemek. Bunu yaparken bağırsakları yara için dikkatli olun. </li><li> Bazı mevcut ise karaciğer ve mide (ince bağırsağın rostral ucunda), hem de mesonephros ve genital sırtlar kesip. </li><li> Ince bağırsak izole. Yine, bağırsak nip için dikkatli olun. Şu andan itibaren, bağırsak dokusunun rosrrocaudal oryantasyon rostral ucunda bulunan keskin eğrilik kullanılarak izlenebilir. EM önce mümkün olduğu kadar kısa bir süre boyunca, oda sıcaklığında PBS içinde küçük bağırsak bırakyatak (adım 3.3). </li><li> Son olarak, doğru embriyonik gelişim evresini belirlemek için her bir embriyo için kuyruk Somitlerin sayısını kaydedin. </li></ol> 3. Embriyonik Bağırsaklar Kesit <ol><li> Embriyo diseksiyonlar ile devam etmeden önce, 100 ml PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) içinde 1.5 g agarozun eritilmesi ve 50 ° C&#39;de tutmak </li><li> Akma bir gömme kalıba eritilmiş agaroz (örneğin, yaklaşık 1/4 boru duvarının çıkarılması için uzunlamasına kesilmiş olan 2 ml mikrosantrifüj tüpü kapalı). Agaroz yaklaşık 42-45 ° C&#39;ye kadar soğumasını bekleyin, o dokunmak için sadece biraz ılık olmalıdır. </li><li> Sadece agaroz katılaşır önce embriyonik bağırsak Embed (bu forseps ipuçları ile değerlendirilebilir ve çevresinde 36-38 ° C meydana gelecektir). Katlanmış rostral sonunda forseps ile bağırsak tutarak, kalıbın uzunluğu boyunca agaroz boyunca çok yavaş çekin. Bu, düz agaroz setleri ise gut tutmaya yardımcı olur. T bırakınkısa sürede taşınıyor karşı başlar yayınlayacak. Bağırsak rostral-kaudal yönde takip edin. </li><li> Agaroz tamamen belirledi sağlamak için, buzdolabı 2-3 dakika içinde kalıp koyun. </li><li> (Açılan Eppendorf tüp dışarı kaydırarak) kalıptan agaroz dışarı atın. Bir bıçak ile, bağırsak dik kesim yapma, her iki uçta aşırı agaroz çıkar. </li><li> Titreşen bir bıçak ile bir mikrotom metal aşamasında aşağı bloke agaroz bağırsak / rostral ucunu Tutkal. Bağırsak / agaroz blok tarafında aşırı agaroz Trim. </li><li> Titreşimli mikrotom odasının metal sahne monte edin. Gerekirse, bu nedenle bağırsak (bu nedenle bıçak dik) mümkün olduğu kadar dik olan sahne açısını ayarlamak. Buz soğukluğunda PBS ile örnek örtün. Tampon yüzeyine altında birkaç milimetre aşağı mikrotom bıçak getir. </li><li> Bu e sağlanması, kuyruk-en ince bağırsağın 200 mikron vibratome enine kesim yapmakach agaroz dilim tam bağırsak bölüm içerir. </li></ol> 4. Bağırsak eksplant kültürü <ol><li> Yavaşça de her ortalarına doğru bir dilim yerleştirerek, forseps ile kollajen jeller üzerine taze kesilmiş bağırsak / agaroz dilimleri düz yatırmak. </li><li> Eksplant üzerinden KKK göçünü sağlamak için, nemli bir% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de 3 gün inkübe edilir. </li><li> Forseps ile çok nazikçe kollajen jel kapalı bağırsak / agaroz dilimleri alın. Aşağıdaki jel zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> Hücre göçü, model rahatsız emin olmak amacıyla daha sonra inkübasyon ve yıkama adımları sırasında doğrudan kolajen jel dokunmaktan kaçının. Oda sıcaklığında da 1 saat başına (PBS)% 4 PFA (paraformaldehid) 500 ul ile düzeltildi. </li><li> Çukur başına 500 ul DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisi (PBS içerisinde 5 ug / ml) ile fiksatif yerine ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> Iyi 3x her yıkayın5 dakika boyunca 500 ul PBS ile. </li><li> Her bir içindeki kolajen jel içine gömülü floresan hücreleri (GFP ve DAPI kanalı) Fotoğraf. </li></ol> 5. Görüntü Analizi Biz eksplant kültürü sonra oluşturulan görüntüleri işlemek ve ölçmek için ImageJ 17 geniş kullanımı yaptı. <ol><li> Floresan hücre fotoğraf gibi aynı büyütmede bir mikrometre slayt görüntüleme başlayın. (Düz Çizgi aracını kullanarak) piksel bir mikron uzunluğunu ölçün. </li><li> (/ Set Ölçeği Analiz; piksel / mikron giriş numarası) ölçeği ayarlayın. </li><li> Her GFP floresan fotoğraf için, 8-bit gri tonlama (Image/Type/8-bit) için görüntü formatını değiştirin. </li><li> Sinyal (Görüntü / Ayarı / Parlaklık / Kontrast) yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> Gerekli (Process / Arka Plan çıkarma; yuvarlanan topu yarıçapını ayarlamak) ise arka plan gürültü çıkarın. </li><li> Hücreleri ve hücre kümeleri (Görüntü / / Eşik ayarlama), vurgulamak için bir eşik ayarlayınn kümeleri (Process / Binary / Havza) bölmek için bir dönüm geçerlidir. </li><li> Ilgi (ROI) bölgeleri belirlemek ve hücre sayısı istatistikleri oluşturmak için parçacıklar Analiz (Parçacıklar Analiz / Analiz; set boyut minimum kalan piksel hariç). </li><li> Feret çapı (/ Set Ölçümleri Analiz) dahil ölçüm seçenekleri ayarlayın. </li><li> Grup ROI&#39;ler ve Feret çapını belirlemek için bir bütün olarak ölçmek, hücre yayılması bir göstergesidir (/ Araçlar / ROI Manager / Diğer / VEYA, ardından ROI Müdürü Ekle / ve ROI Manager / Tedbir Analiz). </li></ol>

<ol><li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+neural+crest%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li>
<li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+developmental+disorders+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development and developmental disorders of the enteric nervous system.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).</li>
<li>Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).</li>
<li>Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li>
<li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li>
<li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li>
<li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li>
<li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li>
<li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li>
<li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li>
<li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li>
<li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease%2C+associated+syndromes+and+genetics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li>
<li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li>
<li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZD5438%2C+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1%2C+2%2C+and+9%2C+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz ex vivo eksplant kültürü tekniği tam GDNF mevcudiyetinde enterik NCC göç potansiyeli ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tür kesin miktar büyük ölçüde daha önce tarif edildiği gibi 11,12,15, 200 mikron kalınlığında bir vibratome bağırsak bölümleri kullanılarak yerine yaklaşık boyutu büyük parça tarafından kolaylaştırılır. Gerçekten de, bu bizi son derece tekrarlanabilir bir ortamda hücrelerin makul bir sayı ile çalışmak için izin verir. Not, eksplant dilimleri kesildiği ince ...

Nöral tepe hücreleri (NCC) embriyo gelişim boyunca bir çok omurgalı türevler meydana özgü bir geçici hücre türüdür. Bu hücre popülasyonu nöral olmayan ektoderm 1 bitişik sinirsel levha, sınırında ortaya çıkar. Nörülasyon sırasında oluşturan nöral tüpün dorsal kenarı boyunca nöral plak yerlerden KKK arasında eğilme. KKK sonra ayrılması ve uzak nöral tüp göç, epitel-mezenkimal geçiş tabi. KKK onlar tüm enterik sinir sistemi (ENS) oluşturmak sindirim sistemi, bağırsak duvarında gömülü nöral ganglionlarda birbirine bağlı bir ağ dahil olmak üzere çeşitli embriyonik yapılar, kolonize. Geçenlerde 2,3 gözden gibi, birçok genin bu karmaşık yapının geliştirilmesi dahil edilmiştir. ENS çoğu (yani müstakbel Beyin / omurilik sınırındaki civarında) vagal nöral tüp KKK menşeli küçük bir havuz türetilmiştir 4.Bunlar sinir atalarıdır farelerde embriyonik gün (E) 9.0 etrafında foregut ulaşmak ve yaklaşık e15.0 tüm embriyonik bağırsakları kolonize kadar sonra bağırsak mezenşimin içinde caudally göç. Kolon sinir progenitörlerinin Küçük bir alt kümesi, aynı zamanda yukarı çekum 4 ters yönde arka bağırsak işgal sakral NCC, tarafından sağlanır. Vagal ve sakral Hem NCC gerektiren birden fazla göç-çoğalma-, ENS tam oluşmasını sağlamak için hayatta kalma ve farklılaşma-teşvik ipuçları. Bu bağlamda, hayvan modelleri, - özellikle de genetik olarak modifiye edilmiş farenin - birkaç temel hücre dışı ligandların belirlenmesi vesile olmuştur: GDNF (gliyal hücre-türevi nörotropik faktör), endotelin-3, nörotrofin-3, BMP (kemik morfojenik proteinler), netrin , hem de sonik ve Hint Hedgehog (Shh ve Ihh) 5-10. Bunlardan, (transfeksiyon sırasında Rearranged) transmembran reseptör tirozin kinaz yoluyla sinyal RET GDNF inci olarak kabul edilmektedirembriyonik gut ve içinde cazibe ve KKK rehberlik e en kritik yolu. GDNF bağırsak mezenşimin tarafından salgılanan ve RET 11,12 ifade enterik KKK, doğrudan kemoatraktif bir spatiotemporally kontrollü rosrrocaudal degrade oluşturur. Diğer fonksiyonlar arasında, ENS bağırsak duvarında düz kas ile etkileşim yoluyla sindirim sistemi içinde hareketini düzenler. Hirschsprung hastalığında bağırsak sonuçların terminal bölgesinde nöral ganglia olmaması: etkilenen segmentin tonik kasılma tıkanması, sindirilmiş madde birikimi ve üst bağırsak ve karın büyük bir şişkinlik yol açar. Hirschsprung hastalığı yaklaşık 5,000 canlı doğumda oluşur. Enterik KKK rostro-kaudal göç desen Hirschsprung hastalığının etiyolojisinde ana bir faktör olduğuna inanılmaktadır. KKK ve b son bölümünü göç kaynağından kolon, uzakkolonize edilmesi Owel, ENS oluşumunda hatalarına karşı en hassas olduğunu. Enterik NCC göç onun önemli rol ile uygun olarak, GDNF / RET sinyal bozulması Hirschsprung hastalığı 13&#39;ün ana bilinen genetik bir nedenidir. [5kb]-GFP 14 Gata4p adında - - Göçmen KKK Yeşil Floresan Protein (GFP) ile etiketli olduğu daha iyi KKK ve ENS gelişimini incelemek için, biz bir transgenik fare hattı oluşturulur. Gelecek artık, GDNF gibi çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik NCC göç potansiyeli hassas miktar tayinine izin veren diğer gruplara 11,12,15 tarafından yayınlanmış çalışmadan adapte edilen bir ex vivo hücre göçü deneyi, mükemmel.

<table><tbody><tr><td>DMEM tozu</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td>Biyoteknoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Steriflip vakum filtrasyon sistemi (0.22 mikron)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomisin çözeltisi, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td>Yüksek kaliteli</td></tr><tr><td>dereceli Kollajen I</td><td>BD biosciences</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>10 N stoktan seyreltilmiş, daha sonra steril filtrelenmiş</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24 kuyulu Plaka</td><td>BD biyolojik bilimler</td><td>353047</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diseksiyon makası</td><td>Fisher Scientific</td><td>089515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam Petri kabı</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Hücre kültürü sınıfı</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Biyoteknoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Cerrahi bıçak</td><td>Tüy</td><td>21</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Çok Amaçlı Anında Krazy Tutkal Kalem</td><td>Krazy Tutkal</td><td>KG824</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V Titreşimli Bıçaklı Mikrotom</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Belirli reaktifler ve ekipman tablosu.</td></tr></tbody></table>

kemirgen enterik sinir progenitörlerin için kantitatif hücre göç tahlili

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Nöral krest hücreleri (KKK) dorsal nöral tüp kaynaklanan ve gelişmekte olan omurgalı embriyo boyunca yoğun göç geçici ve multipotent hücre popülasyonu vardır. Çevresel glia ve nöronlar sağlamanın yanı sıra, NCC melanositler gibi kranyo-yüz iskeletinin en üretir. NCC göç ve farklılaşma nöral tüp ve bölgesel olarak farklı hücre dışı uyaranlara maruz kaldıkları boyunca eksenel kökenli bir kombinasyonu ile kontrol edilmektedir. Hücre dışı ligandlar Bu katkı enterik sinir sistemi (ENS), karmaşık bağlantılı (diğer şeyler arasında) lokal olarak kontrol nöral ganglia ağı bağırsak, kas hareketi ve intestinal motilite oluşumu sırasında, özellikle belirgindir. Kaudal moda bir rostral - - müstakbel bağırsak tüm uzunluğu ENS çoğu kolonize etmek için uzun bir yolculuğa üstlenmek KKK başlangıçtaki küçük bir havuz türetilmiştir. Bilinen çeşitli sinyal yolları arasında,enterik KKK kolonizasyonu etkileyen, GDNF / RET sinyal en önemli olarak kabul edilmektedir. Nitekim, bağırsak mezenşimin tarafından RET ligand GDNF&#39;nin spatiotemporally kontrollü salgılanması embriyonik gut ve içinde cazibe ve RET-ifade enterik KKK rehberlik için başlıca sorumludur. Burada, GDNF gibi çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik NCC göç potansiyeli hassas miktar tayinine izin veren, floresanla işaretlenmiş NCC, sahip olan bir transgenik fare hattı yararlanarak, bir ex vivo hücre göçü deneyi tarif eder.

Aşağıdaki sonuçlar (Şekil 1) burada tarif edilen teknik ile elde edilebilir ne temsil etmektedir. Büyüme faktörleri (örneğin GDNF) kullanılması GFP-ifade eden intestinal eksplant dışarı ve kolajen jel içine enterik NCC (Şekil 2) göçünü teşvik eder. Bazı hücreler, büyüme faktörlerinin yokluğunda eksplant çıkması rağmen, bu çoğunlukla GFP-etiketli değildir ve pasif girişi temsil eder. Bu doku hala yoğun floresan hücreler tarafından doldurulur ve aksi altındaki kollajen yatan hücr...

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöroprogenitörlerin migrasyon potansiyelini nicel olarak belirlemektir. Bu işlem, öncelikle floresan işaretli nöro krist hücreleri içeren fare embriyonik ince bağırsaklarının diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, bağırsaklardan 200 micron kalınlığında kesitler almak için titreşimli bir mikrotom kullanılır.Ardından, bu dilimler büyüme faktörleri içeren bir kolajen jel üzerinde inkübe edilir. Son adım, altındaki göç eden hücreleri ortaya çıkarmak için dilimlerin soyulmasıdır. Nihayetinde, kolajen jel içindeki göç eden hücrelerin modelini göstermek için floresan mikroskobu kullanılır.Bu yöntem, periferik sinir sisteminin oluşumunun temelini oluşturan çeşitli sinyal yollarının etkileşimine dair daha iyi bir anlayış sağlamak gibi, gelişimsel biyolojideki temel bir soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Vajinal tıkaç tespit edildikten 12 gün sonra, dişi fareyi ötanize edin ve rahmi çıkarıp buzla doldurulmuş cam bir petri kabına yerleştirin. Soğuk PBS kullanarak rahmi, her bir embriyo implantasyon bölgesini bir diseksiyon mikroskobu altında izole etmek için bireysel uterus şişkinlikleri arasından transvers olarak kesin; rahmin kas tabakasını kaldırmak için ince pensler kullanın.Embriyoyu ortaya çıkarmak için viseral vitellüs kesesini ve amniyonu açın. Embriyoyu vitellüs kesesine bağlayan kan damarlarını keserken dikkatli olun, çünkü bu damarlar gelişmekte olan bağırsaklarla iç içe geçmiştir. Ardından, kapalı pensleri koyu kırmızı renkli karaciğerin hemen üzerindeki abdominal kaviteye yerleştirin ve penslerin açılmasına izin verin.Bu işlem, karın boşluğunda transvers bir açıklık oluşturur. Karın bölgesini tamamen açmak için açılmış forsepsi embriyonun posterior ucuna doğru çekin. Açıldıktan sonra, karaciğerin arkasındaki bağ dokusunu tutun ve bağırsakları dışarı çekin.Bağırsaklara zarar vermemeye dikkat ederek, bağırsakları embriyonun geri kalanından ayırmak için kolonu herhangi bir yerden kesin. Kuyruk kısmını daha sonra kullanmak üzere ayırın.İnce bağırsağın rostral ucunda dokulara zarar vermemeye dikkat ederek, önce sekumdan ardından da bağırsaklardan bağ dokuyu dikkatlice ayırın. Karaciğeri ve mideyi, ayrıca mevcutsa mezo, nefro ve genital sırtları kesin. Son olarak, sekumu, kolonu ve geri kalan bağ dokuyu keserek ince bağırsağı izole edin.Daha önce olduğu gibi, bağırsağı çentiklememeye dikkat edin. Gömme işleminden önce ince bağırsağı oda sıcaklığında PBS içinde mümkün olan en kısa süre boyunca bekletin. Embriyoyu boyun kısmından kestikten sonra, embriyonik gelişim evresini doğru şekilde belirlemek için kuyruk somitlerinin sayısını kaydedin.Embriyo diseksiyonlarına geçmeden önce, 100 mililitre PBS içerisinde 1,5 gram agros eritip 50 derece sıcaklıkta tutun. İki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü, tüp duvarının yaklaşık dörtte birini çıkaracak şekilde boyuna keserek gömme kalıbını hazırlayın. Eritilmiş agros'u kalıba dökün ve dokunulduğunda sadece hafifçe sıcak hissedilene kadar soğumasını bekleyin.Hazır olduğunda, bağırsağı katlanmış rostral ucundan pensle tutun ve kalıp boyunca, agarın içinden çok yavaşça çekin. Bu işlem, agar donarken bağırsağın düz kalmasına yardımcı olur; doku hareket etmeye karşı direnç göstermeye başladığı anda onu serbest bırakın ve bağırsağın rostral uç yönelimini takip edin. Ardından, kalıbın tamamen donması için iki ila üç dakika boyunca buzdolabına yerleştirin.Sertleştikten sonra, agrosları kalıptan çıkarın ve bağırsakla dik açı oluşturacak şekilde kesikler yaparak her iki uçtaki fazla agrosları kesin. Agros bloğunun rostral ucunu bir mikrotomun metal tablasına yapıştırın ve tüm kenarlardaki fazla agrosları budayın. Ardından, metal tablayı titreşimli mikrotom haznesine monte edin.Gerekirse, bağırsağın mümkün olduğunca dikey durması için sahnenin açısını ayarlayın. Mikrotom bıçağını tampon yüzeyinin birkaç milimetre altına indirmeden önce örneği buz gibi soğuk PBS ile kaplayın. Hazır olduğunuzda, ince bağırsağın kodle kısmından 200 mikron kalınlığında transvers kesitler alın.Her bir agro diliminin tam bir bağırsak kesiti içerdiğinden emin olun. Taze kesilmiş dilimleri önceden hazırlanmış kolajen jel üzerine nazikçe yerleştirin. Nöral krest hücrelerinin bağırsaklardan dışarı göç etmesine izin vermek için her kuyucuğun ortasına doğru bir dilim yerleştirerek, dilimleri üç gün boyunca inkübe edin.Bu sürenin ardından, alttaki jele zarar vermemeye dikkat ederek dilimleri penset yardımıyla nazikçe kolajen jelden çıkarın. Hücre göçü paterninin bozulmaması için, sonraki inkübasyon ve yıkama basamakları sırasında kolajen jele doğrudan dokunmaktan kaçınmak önemlidir. İlk olarak, hücreleri kuyuk başına 500 µL %4 PFA ile oda sıcaklığında bir saat boyunca fikse edin.Ardından, fiksatif yerine her kuyucuğa 500 µL DPI çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, DPI çözeltisini dikkatlice uzaklaştırın ve her kuyucuğu 500 µL PBS ile üç kez beşer dakika boyunca yıkayın. Son olarak, her kuyucuktaki kolajen jel içerisine gömülmüş floresan hücrelerin fotoğrafını çekin.Bu örnekte, GFP eksprese eden enterik nöral krest hücrelerinin migrasyonunu uyarmak için büyüme faktörleri kullanılmıştır. Kesikli çizgi, eksplanın yaklaşık boyutunu ve konumunu temsil etmektedir. Jelden çıkarılmadan önce, bağırsak eksplanından dışarı migre olan GFP eksprese eden hücrelerin sayısının ve yayılımının, tedavi edilen koşullarda tedavi edilmeyenlere kıyasla anlamlı derecede daha fazla olduğu saptanmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, büyüme faktörleri içeren bir kolajen jel üzerinde intestinal kesitleri inkübe ederek enterik nöral progenitörlerin migrasyon potansiyelinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-quantitative-cell-migration-assay-for-murine-enteric-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz yeni bir agaroz jel tabanlı mikroakışkan cihaz kullanarak nöral kök hücreler (NSC'lerde) motilite epidermal büyüme faktörü reseptörleri (EGFR) aşırı ifade artırdığını göstermektedir. Bu teknoloji, insan sinir kök hücreleri gibi hücre kaynakları kıt olan diğer memeli hücre sistemleri, kolayca adapte olabilir ve zaman etrafında dönüş kritik öneme sahiptir.

Nöral Kök Hücre Motilite değerlendirilmesi Agaroz Jel tabanlı mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Bu protokolü biz galvanotaksis sırasında nöral prekürsör hücre translokasyon edilen erişkin beyninin time-lapse görüntüleme sağlamak için bir doğru akım elektrik alanın uygulanmasına izin özel odaları oluşturmak nasıl gösterilmektedir.

Dıştan Uygulanan Doğru Akım Elektrik Alanında Nöral Prekürsör Hücre Göç Kinetik Analizi için galvanotaksis Assay

Bu video, mikroskobik analiz yoluyla nöral öncü hücre nörosfer göç testini (nörosferden nöral öncü hücrelerin göç tepkisini incelemek için bir in vitro test) göstermektedir.

NPC Nörosfer Testi: Nörosferden Nöral Öncü Hücrelerin Göç Tepkisini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Test

Burada SC'ler uzanan aksonlar boyunca geliştirmek için mümkün olduğu bir Schwann hücresi (SC) göç tahlil tarif.

Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki çok önemli bir adımdır. Protokol Burada açıklanan DNA / küçük firkete RNA (ShRNA) nucleofection ve kemirgen doğum sonrası rostral göçmen akımından izole nöroblast ile 3D göç deneyi kullanılarak neuroblast göç aday düzenleyicilerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir.

Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için<em&gt; In vitro</em

Nöral kök / progenitör hücreler (NPC) nakli rejeneratif nöroloji büyük vaatlerde tutar. NPC sistemik teslimi, beyin ve merkezi sinir sistemi hasarı deney kronik enflamatuar etkilenen kemirgen ve insan olmayan primatların omurilikteki kök hücrelerini sunmak için etkili invazif düşük, ve terapötik açıdan etkili, çok protokol dönüşmüştür.

Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve neurite çıkıntı kez nöropsikiyatrik hastalık tedirgin gibi nörogelişimsel işler. Böylece, biz hızla ve tekrarlanarak insan IPSC kaynaklı NPCs bu nörogelişimsel işlemlerde değerlendirmek için protokolleri mevcut. Bu iletişim kuralları da ilgili büyüme faktörleri ve tedavi etkileri NPC gelişimi üzerine bir değerlendirme sağlar.

Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

Biz üç basit in vitro tahliller-uzun mesafe göç tahlil, co-kültür göç tahlil ve kemo-attraction tahlil-topluca insan kök hücre perisiyitli endotel hücreleri ve bunların işlevlerini değerlendirmek GABAerjik internöronlar ile etkileşim.

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin, fare embriyonik ince bağırsaklarından elde edilen enterik sinir progenitörlerinin kantitatif hücre göç analizini. Bu yöntem, gelişimsel biyolojide çeşitli büyüme faktörlerinin etkisini incelemek için kullanılır.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Daha fazla video keşfet