Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöro progenitörlerin göç potansiyelini ölçmektir. Bu, ilk olarak floresan nöro kabuk hücreleri tarafından doldurulan fare embriyonik, ince bağırsaklarının diseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, 200 mikron kalınlığında bağırsak dilimleri yapmak için titreşimli bir mikrotom kullanmaktır.

Daha sonra, bu dilimler büyüme faktörleri içeren bir kollajen jelinin üzerine inkübe edilir. Son adım, altındaki göç eden hücreleri ortaya çıkarmak için dilimleri soymaktır. Sonuç olarak, kollajen jeli içindeki göç eden hücrelerin modelini göstermek için floresan mikroskobu kullanılır.

Bu yöntem, periferik sinir sisteminin oluşumunun altında yatan çeşitli sinyal yolları arasındaki etkileşimin daha iyi anlaşılmasını sağlamak gibi gelişimsel biyolojideki önemli bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Vajinal tıkaç bulunduktan 12 gün sonra, dişi fareye ötenazi yapın ve uterusu çıkarın, uterusu buzla dolu bir cam petri kabına yerleştirin. Soğuk PBS, her bir embriyo implantasyon bölgesini diseksiyon mikroskobu altında izole etmek için uterusu bireysel deum şişlikleri arasında enine kesti, uterusun kas tabakasını çıkarmak için ince forseps kullandı.

Embriyoyu ortaya çıkarmak için viseral yumurta sarısı torbasını ve amniyonunu açın. Kan damarlarını keserken, gelişmekte olan bağırsaklarla iç içe oldukları için embriyoyu yumurta sarısı torbasına birleştirirken dikkatli olun. Daha sonra, kapalı forsepsleri koyu kırmızı renkli karaciğerin hemen üzerindeki karın boşluğuna yerleştirin ve açılmalarına izin verin.

Bu, karın boşluğunda enine bir açıklık oluşturur. Karnı tamamen açmak için açılan forsepsleri embriyonun arka ucuna doğru aşağı doğru çekin. Açıldıktan sonra, karaciğerin arkasındaki bağ dokusunu tutun ve bağırsakları dışarı çekin.

Bağırsakları kırmamaya özen göstermek. Bağırsakları embriyonun geri kalanından kurtarmak için kolonu herhangi bir yerde kesin. Kuyruk kısmını daha sonraya saklayın.

Bağ dokusunu çekumdan çıkarın ve ardından bağırsakları, ince bağırsağın rostral ucuna sarmamak için dikkatlice çalışın. Karaciğer ve midenin yanı sıra mezo, nefros ve varsa genital çıkıntıları kesin. Son olarak, çekum ve kolonun yanı sıra kalan bağ dokusunu keserek ince bağırsağı izole edin.

Daha önce olduğu gibi, bağırsağa çentik atmamaya dikkat edin. Gömmeden önce ince bağırsağı mümkün olduğunca kısa bir süre oda sıcaklığında PBS'de bırakın. Embriyoyu boynundan kestikten sonra, embriyonik gelişim aşamasını doğru bir şekilde belirlemek için kuyruk somitlerinin sayısını kaydedin.

Embriyo diseksiyonlarına devam etmeden önce, 100 mililitre PBS'de 1.5 gram agros eritin ve 50 santigrat derecede tutun. Tüp duvarının yaklaşık dörtte birini çıkarmak için iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünü uzunlamasına keserek gömme kalıbını hazırlayın. Erimiş agroları kalıba dökün ve dokunulduğunda çok az ısınana kadar soğumaya bırakın.

Hazır olduğunuzda, bağırsağı katlanmış rostral ucundan forseps ile tutun ve kalıbın uzunluğu boyunca agros boyunca çok yavaş bir şekilde çekin. Bu, bağırsağın düz kalmasına yardımcı olurken, agro setleri hareket ettirilmeye direnmeye başlar başlamaz dokuyu serbest bırakır ve bağırsağın rostral coddle oryantasyonunu takip eder. Ardından, kalıbı tamamen kuruması için iki ila üç dakika buzdolabına koyun.

Ayarlandıktan sonra, agroları kalıptan çıkarın ve fazla agrosları her iki ucundan kesin, bağırsağa dik kesimler yapın. Agros bloğunun rostral ucunu bir mikrotomun metal aşamasına yapıştırın ve fazla arosları her taraftan kesin. Ardından, metal tablayı titreşimli mikrotom odasına monte edin.

Gerekirse, sahnenin açısını, bağırsak mümkün olduğunca dikey olacak şekilde ayarlayın. Mikroton bıçağını tampon yüzeyinin birkaç milimetre altına indirmeden önce numuneyi buz gibi soğuk PBS ile örtün. Hazır olduğunda, en ince bağırsağın 200 mikronluk enine kesimlerini yapın.

Her agro diliminin tam bir bağırsak bölümü içerdiğinden emin olun. Taze kesilmiş dilimleri önceden hazırlanmış bir kollajen jeli üzerine nazikçe bırakın. Nöro tepe hücrelerinin patlıcanlardan dışarı çıkmasına izin vermek için her kuyucuğun ortasına doğru bir dilim yerleştirerek dilimleri üç gün kuluçkaya yatırın.

Bu süreden sonra kollajen jelin üzerindeki dilimleri forseps ile nazikçe çıkarın ve alttaki jele zarar vermemeye dikkat edin. Hücre göç modelinin bozulmamasını sağlamak için, sonraki inkübasyon ve yıkama adımları sırasında kollajen jeline doğrudan dokunmaktan kaçınmak önemlidir. İlk olarak, hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca kuyu başına 500 mikrolitre% 4 PFA ile sabitleyin.

Daha sonra, fiksatifi oyuk başına 500 mikrolitre DPI çözeltisi ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, DPI çözeltisini dikkatlice çıkarın ve her bir kuyuyu beş dakika boyunca 500 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Son olarak, her bir oyuktaki kollajen jele gömülü floresan hücrelerin fotoğrafını çekin.

Bu örnekte, GFP'yi eksprese eden enterik nöro kabuk hücrelerinin göçünü uyarmak için büyüme faktörleri kullanıldı. Noktalı çizgi, açıklamanın yaklaşık boyutunu ve konumunu temsil eder. Jelden çıkarılmadan önce, bağırsak ekplansından göç eden GFP eksprese eden hücrelerin sayısı ve yayılmasının, tedavi edilmeyen koşullara kıyasla tedavi edilen koşullarda önemli ölçüde daha yüksek olduğu bulunmuştur.

Bu videoyu izledikten sonra, büyüme faktörleri içeren bir kollajen jeli üzerinde bağırsak dilimlerini inkübe ederek enterik nöral progenitörlerin göç potansiyelini nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.