Ustilago maydis'in Mısır ve Teosinte Hatlarında Patojenitesini Değerlendirmek İçin Hızlı ve Verimli Bir Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, bir USTA Lago maus hücre süspansiyon kültürü olan iğne enjeksiyonu yoluyla aşılamak ve labirent tete ve labirent teosinte çapraz giriş çizgilerinin hastalık direnci reaksiyon taramasını gerçekleştirmektir. Bu, önce aşılama ve tarama için bitki hatlarının seçilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, deneysel ve kontrol iğnesi enjeksiyon aşılama deneyleri için tohumlar ekilir.

10 gün sonra, U yapımı hücre süspansiyonu her bitkinin gövdesine enjekte edilir. Son olarak, deney ve kontrol bitkilerinin direnç reaksiyonları karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak, sizinle birlikte aşılanan bitkinin fenotipini görselleştirerek başarılı bir iğne enjeksiyonu aşılaması gösteren sonuçlar elde edilebilir. Öğr.

Bu tekniğin temel avantajı, patojeni doğrudan yapraklar arasına iletmesidir. Bu, patojen penetrasyon sorununu ortadan kaldırır. Burada gösterildiği gibi aşılama ve tarama için bitki hatlarını seçmeye başlamak için, deneysel ve kontrol iğnesi enjeksiyon aşılama deneyleri için bu çalışma için iki labirent hattı, beş teosinte hattı ve U Mais'e karşı karakterize edilmemiş dirençli 40 labirent Teosinte çapraz hattı kullanıldı.

Tohumları bir parmağınızla toprağa yaklaşık yarım inç iterek ve üzerlerini hafifçe toprakla kaplayarak her bitki hattının dört tohumunu küçük daireler halinde ekin. Daha sonra bitkileri bir büyüme odasına koyun ve tohumları ıslanana kadar sulayın, sulamadan sonra toprak altında kalmalarını sağlayın. Bitkileri sırasıyla 28 ve 20 santigrat derece gündüz ve gece ortamlarında ve 14 ve 10 saatlik aydınlık ve karanlık döngülerde büyütün.

Ve kanopinin tepesinde saniyede metrekare başına yaklaşık 500 mikromolar fotosentetik olarak aktif radyasyon. Gündüz ve gece boyunca bağıl nemi sırasıyla yaklaşık% 70 ve% 90'da tutun ve deney boyunca uyumlu bir büyüme ortamı sağlamak için tüm bitkileri aynı büyüme odasında tutun. Tohumları ektikten sekiz gün sonra, donmuş bir gliserol stoğundan huileri patates dekstroz agar veya PDA plakalarına çekmek için steril bir halka kullanın, iki gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve laminer bir akış başlığı altında iyi büyüdüğünden emin olmak için düzenli olarak izleyin.

Her suş için tek bir koloni seçmek için steril bir kürdan kullanın ve bunları üç mililitrelik PD suyu tüplerine yerleştirin. Kültürleri iki gün boyunca 30 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin ve büyümeyi periyodik olarak kontrol edin. Ardından, 1.0'lık bir OD'ye kadar büyüdüklerinden emin olmak için kültürlerin OD 600'ünü ölçün.

Su kullanarak, kültürleri 30 mililitrelik bir son hacimde mililitre başına 1 milyon hücrelik bir nihai konsantrasyona getirin. Bu patojenik hücre süspansiyonu konsantrasyonu sürekli olarak bitkilerin iyi bir şekilde enfeksiyon kapmasına neden olur. Daha sonra aşılamadan önce, suş olarak yaptığınız ikisinden eşit hacimlerde karıştırın.

Üç mililitrelik bir şırıngayı hücre süspansiyonu ile doldurmadan önce, bitkiye en az zararı vermek için kontrol şırıngasını suyla doldurun. Doku, her şırınganın ucuna sıfır noktası 457 milimetre x 1.3 santimetre hipodermik iğne bağlar. Bitkileri büyüme odasından çıkarın ve toprak çizgisinin hemen üzerine 90 derecelik bir açıyla enjekte edin.

U maus'un iğnesini, sapın ortasına gelene kadar deneysel bir bitkinin gövdesine dikkatlice sokun. Yaklaşık 100 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin. Gövdeyi itecek ve bitkinin girdabına girerken görünür olacaktır.

Şırıngalar boşalana kadar ek deney bitkileri enjekte etmeye devam edin. Daha sonra herhangi bir bitki dokusunun iğnesini temizlemek için suyla doldurun ve tüm bitkiler enjekte edilene kadar şırıngayı tekrar doldurun. Kontrol tesislerine benzer şekilde enjekte etmek için su şırıngasını kullanın.

Enjeksiyonlar tamamlandığında. Bitkileri günlük olarak tekrar büyüme odasına yerleştirin. Sadece toprağı sulayın ve patojen gelişimini ve bitki direnci reaksiyonlarını kontrol edin.

Bir ila beş direnç reaksiyonu derecesi kullanarak, aşılamadan veya DPI'dan 7, 10, 14 ve 21 gün sonra her bitki için direnç reaksiyonlarını ölçeklendirin, puanlayın ve kaydedin. Derecelendirme ölçeğindeki sayısal değerler, hastalık şiddeti arttıkça artar. Örneğin, A1C bir A veya iki direnç reaksiyonu direnci gösterir.

Üç, dört veya beş direnç reaksiyonu duyarlılığı gösterir. Deney ve kontrol tesislerinin direnç reaksiyonlarını karşılaştırın ve A1C bir veya iki direnç reaksiyon derecesine sahip deney bitkilerini seçin. Bu bitkilerin matis'e karşı dirençli olduğu düşünülmektedir.

Bu deneyde, humus aşılanan bitkilerin çoğu enfeksiyona duyarlıydı. Bitkiler, siyah telio sporları ile gövde ve bazal safra oluşumu ile gösterilen ciddi hastalık gelişimi göstermiştir. Hastalığın ciddiyeti nedeniyle aşılamadan sonra birkaç bitki öldü.

Buna karşılık, kontrol bitkileri çok temizdi ve bitkinin herhangi bir yerinde patojen gelişimi göstermedi, bu da deney bitkilerinde patojen gelişiminin U Mais'e dirençli üç Mais Teosinte çapraz agresyon hattı olan U Mais ile iğne enjeksiyonu inokülasyonuna bağlı olduğunu gösterdi ve başarılı bir aşılama minör skleroz ile doğrulandı, üretimde camgöbeği veya küçük yaprak safra oluşumu. Bu teknik, tekrarlanabilirlik ile oldukça verimli bir şekilde yapılabilir. Bu, çok sayıda bitkinin aşılanmasına ve fenotiplenmesine yardımcı olur.