Name: Ustilago maydisin Mısır ve Teosinte Hatlarında Patojenitesini Değerlendirmek İçin Hızlı ve Verimli Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-03T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Öğrenin, Ustilago maydis ile mısır ve teosinte hatlarında iğne enjeksiyonu yöntemiyle hastalık direnci taraması yapmayı. Bu teknik, bitki-patojen etkileşimlerini anlamak ve dirençli çeşitleri belirlemek için verimli bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Emir İslamoviç'e laboratuvar ve sera yardımı için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Sherry Flint-Garcia'ya mısır x teosinte giriş hatlarını sağladığı için teşekkür ederiz.

1. Bitki Materyalinin Büyümesi
<ol><li>Aşılama ve eleme için tesis hatlarını seçin. Bu çalışma için U. maydis'e karşı karakteristik olmayan direnci olan iki mısır çizgisi, beş teosinte hattı ve kırk mısır x teosinte hattı kullanılmıştır (Tablo 1).</li>
	<li>Deneysel(U. maydis enjeksiyonu) ve kontrol (su enjeksiyonu) iğne enjeksiyonu aşı deneyleri için bitki tohumları. Bunu her bitki hattı için yapın.</li>
	<li>Tohumları parmakla toprağa yaklaşık 1/2 inç iterek ve toprakla hafifçe kaplayarak küçük düzlüklerde her bitki hattı için dört tohum (çoğalır) ekin (Şekil 1A ve 1B). Toprağı tohumun üzerine paketlemeyin. Tohumu daha derine dikmek veya toprağı tohumun üzerine paketlemek fidenin ortaya çıkmasıyla ilgili sorunlara neden olabilir.</li>
	<li>Tohumları toprağa sulayın. Toprağın ıslatılmasından ve tohumların sulamadan sonra toprağın altında kaldığından emin olun.</li>
	<li>Sulamadan sonra, bitkileri sırasıyla 28/20 °C sıcaklık ve 14/10 saat fotoperiyod ve gölgeliklerin üst kısmında yaklaşık 500 μmol/ m2   sn fotosetik olarak aktif radyasyon içeren bir büyüme odasına yerleştirin. Gündüz ve gece bağıl nemi sırasıyla yaklaşık% 70 ve% 90'da koruyun.</li>
	<li>Deney boyunca uyumlu bir büyüme ortamını korumak için tüm bitkileri aynı büyüme odasında tutun.</li>
	<li>10 gün sonra, bitkileri büyüme odasından çıkarın ve iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi kullanarak bitkileri U. maydis hücre süspansiyon kültürü ile aşılayın. Not: Mısır bitkileri ekimden 7 gün sonra8-10aşılanabilir. Bununla birlikte, teosinte bitkileri 7 gün sonra çok küçüktür. Bu nedenle, deney içinde tutarlılık için ekimden 10 gün sonra hem mısır hem de teosinte bitkilerini aşılayın (bkz. adım 2.12).</li>
</ol>2. İğne Enjeksiyonu Aşısı
<ol><li>Tüm işleri laminer akış başlığında yapın. U. maydis gliserol stoklarını dondurucu deposundan çıkarın. Patates dekstroz agar (PDA) plakalarına U. maydis vahşi tip suşları 1/2 (çiftleşme tipi a1b1) ve 2/9 (çiftleşme tipi a2b2, izojenik ila 1/2) arasında steril bir döngü ve çizgi gliserol stokları kullanın. Suşları ayrı ayrı koruyun.</li>
	<li>PDA plakalarını iki gün boyunca 30 °C inkübatörde U. maydis ile çizgili yerleştirin. Farklı bir biyotrofik patojen kullanıyorsanız uygun suş, ortam ve büyüme koşullarını kullanın. U. maydis suşunun iyi büyüdüğünden emin olmak için patojenin iki günlük dönemde büyümesini izleyin.</li>
	<li>PDA plakalarını iki gün sonra inkübatörden çıkarın. Plakalar iyi patojen büyümesine sahip olmalı ve tek koloniler içermelidir (Şekil 2A). Tek koloniler elde etmek önemlidir. Tek koloniler mevcut değilse, plakaları daha düşük bir konsantrasyonda dinlendirin.</li>
	<li>Tüm işi laminer akış başlığında yapın. PDA plakalarından her suş için tek bir koloni seçmek için steril bir kürdan kullanın. Tek bir koloni içeren kürdanı 3 ml patates dekstroz suyuna (PDB) yerleştirin. 2-3 kültüre sahip olması önerilir.</li>
	<li>3 ml PDB kültürlerini 200 rpm'de iki gün boyunca 30 °C inkübatöre/çalkalayıcıya yerleştirin. Kültürün büyümesini sağlamak için iki günlük dönemde kültürün büyümesini izleyin. Kültür çok bulutlu görünmelidir.</li>
	<li>Sıvı kültürlerini inkübatörden/çalkalayıcıdan çıkarın ve hücrelerin1,0 (~1 x 10 7 hücre/ml)17OD'ye yetiştirilmesini sağlamak için OD 600'deki konsantrasyonu ölçün.</li>
	<li>U. maydis hücre süspansiyon kültürlerini, son 30 ml kültür hacminde su kullanarak 1 x10 6 hücre/ ml'lik son konsantrasyona getirin. Bu konsantrasyon sürekli olarak patojen hücre süspansiyon kültürü ile bitkilerin iyi enfeksiyonu ile sonuçlanır. 17
</li>
</ol>Not: Aşılama için gerekli uygun hücre titresini belirlemek için farklı patojen suşları kullanırken çeşitli hücre süspansiyon konsantrasyonları test edilmelidir18,19. Hücre süspansiyon kültürü için verilen son konsantrasyon, titterleme için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Patojen hücre süspansiyon kültürünün uygun konsantrasyonu, iyi enfeksiyonlu bitki fenotipleri görselleştirilerek doğrulanmalıdır (Şekil 3A-E).
<ol start="8"><li>Aşılamadan önce iki U. maydis suşunun eşit hacimlerini karıştırın. Bir patojen suşu kullanıyorsanız, 2.9 adımına geçin. Her aşılama deneyi için taze U. maydis hücre süspansiyon kültürleri hazırlayın ve iki gün sonra hücre süspansiyon kültürlerini atın.</li>
	<li>Deneysel iğne enjeksiyonu aşısı için, hücre süspansiyon kültürünü şırıngaya çekerek 3 ml'lik bir şırıngayı U. maydis hücre süspansiyon kültürü ile doldurun.</li>
	<li>Kontrol iğne enjeksiyonu aşısı için, 3 ml'lik bir şırıngayı su ile doldurun17. Deneysel iğne enjeksiyonu aşısı için de aynı prosedürü kullanın.</li>
	<li>Her 3 ml şırınganın ucuna 0,457 mm x 1,3 cm hipodermik iğne takın. Seçilen iğne boyutu, bitki yaprakları arasındaki hücre süspansiyon kültürünü bitki dokusuna en az hasarla ulaştıracaktır.</li>
	<li>Deney ve kontrol tesislerini iğne enjeksiyonu aşılarına hazırlık için ekimden 10 gün sonra büyüme odasından çıkarın (Şekil 2B) (bkz. adım 1.7).</li>
	<li>U. maydis hücre süspansiyon kültürünü içeren hipodermik iğneyi, toprak çizgisinin hemen üzerinde 90° açıyla deneysel bir bitkinin gövdesine dikkatlice yerleştirin. İğneyi sapın ortasına gelene kadar yerleştirin. İğneyi gövdeden itmeyin (Şekil 2C).</li>
	<li>Deneysel bitkiye yaklaşık 100 μl U. maydis hücre süspansiyon kültürü18,19enjekte edin. Bu, fidenin yüksekliğine bağlı olarak biraz değişecektir. Hücre süspansiyon kültürü gövdeden geçecek ve bitkinin girdabına doğru hareket edecektir. Hücre süspansiyon kültürü bitkinin girdabında görülebilecektir. 3 ml şırınna boşalana kadar her bir bitkiye 100 μl hücre süspansiyon kültürü enjekte etmeyi sürdürün.</li>
	<li>Enjeksiyondan sonra, iğneyi bitki sapından dikkatlice çıkarın. İğneyi şimdi boş olan 3 ml şırıngadan çıkarın ve suyla doldurun. İğneyi şırıngaya geri takın ve iğne ucuna takılabilecek bitki dokusunu çıkarmak için suyu iğneden geçirin.</li>
	<li>Her deneysel bitki için 2.9-2.15 adımlarını tekrarlayın. Su enjekte ederek kontrol tesisleri için aynı protokolü izleyin.</li>
	<li>Aşılanmış deneysel ve kontrol tesislerini tekrar büyüme odasına yerleştirin. Bitki dokusunu değil toprağı ıslatarak bitkileri günlük olarak sulayın.</li>
	<li>Patojen gelişimi ve bitki direnci reaksiyonlarını tespit etmek için bitkileri günlük olarak kontrol edin.</li>
</ol>3. Direnç Reaksiyonu Taraması
<ol><li>1 ila 5 direnç reaksiyonu derecelendirme ölçeği kullanarak her bitki 7, 10, 14 ve 21 gün sonrası aşılama (dpi) için direnç reaksiyonlarını puanlayın ve kaydedin. Derecelendirme ölçeğindeki sayısal değerler arttıkça hastalık şiddeti artar (Tablo 2). 1C (Yaprak kloroz), 1A (Yaprak antosiyanin üretimi) veya 2 (küçük yaprak safra) direnç reaksiyonu direnci gösterir. A 3 (kök safra), 4 (bazal safra) veya 5 (bitki ölümü) direnç reaksiyonu duyarlılığı gösterir (Şekil 3A-E ve Tablo 2)18,19.</li>
	<li>Hem deneysel hem de kontrol tesislerini puanlayın ve direnç reaksiyonu derecelendirmelerini kaydedin.</li>
	<li>Deneysel ve kontrol tesislerinin direnç reaksiyonlarını karşılaştırın. 1C, 1A veya 2 direnç reaksiyon derecesine sahip deneysel bitkileri seçin. Bu bitkilerin U. maydis18,19'adayanıklı olduğu düşünülmektedir.</li>
	<li>Bitki fenotiplerini doğrulamak için tüm deneyi tekrarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crop+fungal+resistance+developed+using+genetic+engineering+and+antifungal+proteins+from+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses.</a> , ISB News. report 
 
 <a target="_blank" href="http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf">http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sher, A. F., MacNab, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSher%2C+AF+%22Vegetable+diseases+and+their+control%22">Vegetable diseases and their control</a>. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).</li>
<li>Crepet, W. L., Feldman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+earliest+remains+of+grasses+in+the+fossil+record%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Bot%22%5BJournal%5D)">The earliest remains of grasses in the fossil record.</a> Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).</li>
<li>Iltis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+evolution+and+agricultural+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Grass+systematic+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Maize evolution and agricultural origins.</a> Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).</li>
<li>Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+corn.+III.+Modern+races%2C+the+product+of+tesonite%5BTitle%5D)+AND+%22Bot.+Mus.+Leafl.%22%5BJournal%5D)">The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite.</a> Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).</li>
<li>Agrios, G. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+GN+%22Plant+Pathology%22">Plant Pathology</a>. , Academic Press. New York. (1997).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).</li>
<li>Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+beteen+Fusarium+verticillioides%2C+Ustilago+maydis%2C+and+Zea+mays%3A+An+endophyte%2C+a+pathogen%2C+and+their+shared+plant+host%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host.</a> Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).</li>
<li>Freeman, S., Rodriguez, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+assessing+pathogenicity+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp+niveum+and+F.+o.+melonis+on+cucrbits%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits.</a> Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).</li>
<li>Gottwald, T. R., Graham, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+for+precise+and+nondisruptive+stomatal+inoculation+of+leaf+tissue+with+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathol%22%5BJournal%5D)">A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens.</a> Phytopathol. 82, 930-935 (1992).</li>
<li>Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+of+coffee+plants+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Asomycota%3A+Hypocreales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mycolog.+Res%22%5BJournal%5D)">Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales).</a> Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).</li>
<li>Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+pathogenicity+genes+in+Ustilago+maydis+by+restriction+enzyme-mediated+intergratior+%28REMI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI).</a> Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).</li>
<li>Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+in+the+bW%2FbE+regulatory+cascade+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).</li>
<li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corn+smut+caused+by+Ustilago+maydis.+Monograph+number+2%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2.</a> , The American Phytopathological Society. (1963).</li>
<li>Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+tumors+caused+by+Ustilago+maydis+require+organ-specific+genes+in+host+and+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.%22%5BJournal%5D)">Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen.</a> Sci.. 328, 89-92 (2010).</li>
<li>Kamper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+maize+plants+expressing+the+Totivirus+antifungal+protein%2C+KP4%2C+are+highly+resistant+to+corn+smut%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut.</a> Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).</li>
<li>Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilago+maydis+regulatory+subunit+of+a+cAMP-Dependent+protein+kinase+is+required+for+gall+formation+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize.</a> , (1997).</li>
<li>Gold, S. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+two+chitin+syn-+thase+genes+in+the+phytopathogenic+fungus+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).</li>
<li>Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ustilago+maydis+as+a+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Ustilago maydis as a Pathogen.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).</li>
<li>Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems.</a> J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).</li>
<li>Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole-3-acetic+acid+%28IAA%29+biosynthesis+in+the+smut+fungus+Ustilago+maydis+and+its+relevance+for+increased+IAA+levels+in+infected+tissue+and+host+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation.</a> Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).</li>
<li>Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilaginales+as+Plant+Pests+and+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems.</a> Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).</li>
<li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Ustilago+maydis%2C+a+fungal+pathogen+that+induces+tumors+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize.</a> Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).</li>
<li>Keen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+plant+pathology%3A+a+retrospective+view+on+understanding+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışmada 700 mısır ve teozinte bitkisinin gövdesine U. maydis suşunu ulaştırmak için kullanılan iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi başarılı oldu. Ayrıca, bitkileri taramak ve patojen gelişimini tespit etmek için revize edilmiş bir hastalık direnci derecelendirme ölçeği kullanılmıştır. Her iki yöntemin de kullanılması sonucunda, U. maydis'e dirençli bitki hatları, artık hastalık direncinin iyileştirilmesi için ıslah programlarında birleştirilebilen ve test edilebilen 700 mısır ve teozinit bitkisi arası...

Bitkilerin mantar hastalıkları tarım için en önemli tehditlerden birini temsil eder. Artan dünya nüfusunun gıda ihtiyacı nedeniyle hastalık direnci gelişmiş ürünler geliştirme ihtiyacı artmaktadır. Bitki patojenleri doğal olarak tarladaki mahsul bitkilerini enfekte eder ve mahsul verimini olumsuz etkileyen hastalıklara neden olur6. Dirençli bitkilerin belirlenmesi ve kullanılmasının direnci artırabileceği ve verim kaybını azaltabileceği gösterilmiştir. Mısır, buğday, pirinç ve sorgum dahil olmak üzere birçok bitki türünde bitkilerin bir bitki patojeni ile aşılanması ve dirençli çizgilerin seçilmesi ile dirençli kültivatörler tanımlanmıştır7. Bu nedenle, verimli bir aşılama yönteminin geliştirilmesi ve kullanılması, birçok bitkinin aşılanmasına ve direnç taramasına izin verecektir. Daldırma aşılama, patojen hücre süspansiyon kültürünü bitkinin girdarına pipetleme ve iğne enjeksiyonu aşılama8-11dahil olmak üzere çeşitli aşılama yöntemleri kullanılmıştır. Her yöntemde, patojen gelişimini ve bitki enfeksiyonunu sağlamak için patojenin ekresoria oluşumu yoluyla bitkiye girdiği bitki yaprakları arasında güvenilir bir şekilde patojen tanıtılmalıdır12,13.
Daldırma aşılama yöntemi, bir bitki fidesinin patojen hücre süspansiyon kültürüne batırıltırken, pipetleme yöntemi patojen hücre süspansiyon kültürünün bitki fidesinin girdılmasına yerleştirilmesini gerektirir. Ancak, her iki yöntemle ilgili sorunlar vardır. İlk olarak, her iki yöntem de patojenin yaprak yüzeyinden son derece değişken olan bitki dokusuna doğal hareketine bağlıdır. Patojenlerin çoğu doğal olarak bitki yaprağı yüzeyindeki stomatal açıklıklar veya yaralardan bitkiye girer. Bununla birlikte, patojenlerin bitki yaprağı yüzeyine stomata ve/ veya yaprak yüzeyindeki yaralardan nüfuz etme yeteneğinde önemli bir değişkenlik vardır. Bu nedenle, patojen penetrasyonu, potansiyel olarak tutarsız verilerle sonuçlanan aşılama yöntemi ile kontrol edilemez. İkincisi, çok sayıda bitkiyi tadırken, fideleri patojen hücre süspansiyon kültürüne batırılması zaman alabilir ve taranabilecek bitki sayısını sınırlayabilir. Tersine, burada açıklanan iğne enjeksiyonu aşılama protokolü, bitki yaprakları arasında appressoria oluşumunu kolaylaştıran patojen hücre süspansiyon kültürünü sağlar14. Patojen daha sonra patojen penetrasyon sorununu ortadan kaldırarak bitkiye girmek için yeni geliştirilen appressoriayı kullanır. Ek olarak, iğne enjeksiyonu aşılama protokolü, U. maydis ile aşılanmış ve iyi enfeksiyon gösteren mısır ve teozinit bitkileri için bir dizi fenotip sağlar. Fenotipler, patojen hücre süspansiyon kültürü için en iyi konsantrasyonu belirlemek için bir işaretleyici olarak kullanılabilir ve bu da farklı deneyler içinde ve arasında tutarlı bitki fenotipleri ile sonuçlanır.
Patojen hücre süspansiyon kültürüne sahip bitki aşılamasını takiben, bitkiler tipik olarak dirençli veya hassas bir fenotip8-11,15tespit etmek için taranır. Hastalık derecelendirme ölçekleri bitki fenotiplerini taramak ve sınıflandırmak için yoğun olarak kullanılırken, derecelendirme ölçekleri analiz edilen patojene bağlı olarak farklılık gösterir. Bu nedenle, benzer mantar patojenleri için U. maydis ve mısır etkileşimleri için bir hastalık derecelendirme ölçeği protokolü kurulması16.
Mevcut protokoller serisi, U. maydis hücre süspansiyon kültürü ile iğne enjeksiyonu aşısını ve mısır, teozinte ve mısır x teosinte introgression çizgilerinin hastalık direnci reaksiyonu taramasını detaylandırır. Mevcut protokoller U. maydis'in mısır bitkilerine iğne enjeksiyonu aşısı ile sınırlı değildir, ancak nispeten herhangi bir mantar patojeni ve bitki türü için kullanılabilir. Bu nedenle, her iki yöntemin ayrıntılarının aynı protokole dahil edilmesini sağlamak, araştırmacıların aşı ve tarama protokollerini doğrudan kullanmalarını veya orijinal protokolleri ilgi çekici patojen ve bitki türlerine daha iyi uyacak şekilde manipüle etmelerini sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Bitkiler</td><td></td><td></td> için tohum <td>Orijinal haçlardan toplanmıştır</td></tr><tr><td>Büyüme odası</td><td>Conviron</td><td>PGR14 REACH-IN</td><td></td></tr><tr><td>Daire dikimi</td><td>Hummert International</td><td>14-3385-2</td><td></td></tr><tr><td>Toprak (3 kısım çam kabuğu; 1 kısım perlitli turba yosunu)</td><td>Hummert International</td><td>10-1059-2</td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış başlığı</td><td>Lab Conoco</td><td>70875372</td><td></td></tr><tr><td>İlgilenilen patojenin gliserol stoğu (U. maydis) veya ilgilenilen</td><td></td><td></td> mantar patojeni <td>Stoklar orijinal kültürden yetiştirildi</td></tr><tr><td>Steril döngü</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17356A</td><td></td></tr><tr><td>Patates dekstroz agar (PDA) plakaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>R454311</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatörü 30 dereceye ayarlandı; C</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-650F</td><td></td></tr><tr><td>Steril kürdan</td><td>Walmart</td><td></td><td>Walmart'tan satın alındı ve otoklavla sterilize edildi</td></tr><tr><td>Patates dekstroz suyu (PDB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1008617</td><td></td></tr><tr><td>Kuluçka makinesi-çalkalayıcı 30 °C'ye ayarlandı; C</td><td>New Brunswick</td><td>14-278-179</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>4001000</td><td></td></tr><tr><td>U. maydis&nbsp; hücre süspansiyon kültürü (1 x 106 hücreler / ml)</td><td></td><td></td><td>Yöntemlerde tarif edildiği gibi gliserol stokundan büyütülür</td></tr><tr><td>3 ml Şırıngalar</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> 309606.457 <td></td></tr><tr><td>mm x 1.3 cm Hipodermik iğneler</td><td>Kendall Brands</td><td>8881250321</td><td></td></tr></tbody></table>

ustilago maydis'in mısır ve teosinte hatlarında patojenitesini değerlendirmek İçin hızlı ve verimli bir yöntem

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

Mısır dünya çapında önemli bir tahıl mahsulüdür. Bununla birlikte, biyotrofik patojenlere duyarlılık, verimliliği artırmanın birincil kısıtlamasıdır. U. maydis biyotrofik bir mantar patojenidir ve mısırdaki mısır smutunun nedensel ajanıdır. Bu hastalık, ABD'de yılda yaklaşık 1,0 milyar dolarlık önemli verim kayıplarından sorumludur1 Şu anda mısır pisliğini kontrol etmek için mahsul rotasyonu, mantar ilacı uygulaması ve tohum tedavileri dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerkullanılmaktadır 2. Bununla birlikte, konak direnci mısır pisliğini yönetmek için tek pratik yöntemdir. Çeşitli biyotrofik patojenlere dirençli mısır, buğday ve pirinç gibi mahsul bitkilerinin tanımlanması yıllık verim kayıplarını önemli ölçüde azaltmıştır3-5. Bu nedenle, patojeni bitki yaprakları arasında verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde ulaştıran bir patojen aşılama yönteminin kullanılması, U. maydis'edirençli mısır hatlarının hızlı bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştıracaktır. U. maydis'e dirençli mısır çizgilerinin girintilenmesine yönelik ilk adım olarak, U. maydis suşu ile mısır, teozinte ve mısır x teosinte içe giriş hatlarını aşılamak ve dirençli bitkileri seçmek için bir iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi ve bir direnç reaksiyonu tarama yöntemi kullanılmıştır.
Yaklaşık 700 bitkiden oluşan mısır, teosinte ve mısır x teosinte içe giriş hatları ekildi, U. maydissuşu ile aşılandı ve direnç taraması yapıldı. Aşılama ve tarama yöntemleri, U. maydis'edirençli üç teozinit hattını başarıyla tanımladı. Burada mısır, teozinte ve mısır x teozinte introgression çizgileri için ayrıntılı bir iğne enjeksiyonu aşılama ve direnç reaksiyonu tarama protokolü sunulmuştur. Bu çalışma, iğne enjeksiyonu aşısının tarımda bitki yaprakları arasında U. maydis'i verimli bir şekilde ulaştırabilen paha biçilmez bir araç olduğunu ve artık gelişmiş hastalık direnci için ıslah programlarında birleştirilebilen ve test edilebilen U. maydislere dayanıklı bitki hatları sağladığını göstermektedir.

Başarılı bir iğne enjeksiyonu inokülasyonu, U. maydis (deneysel) ile aşılanmış bitkilerin fenotipinin görselleştirilmesiyle belirlenebilir. Deneysel bitkilerin çoğu U. maydis enfeksiyonuna karşı hassastı. Duyarlı bitkiler siyah teliospores ile kök ve bazal safra oluşumu ile gösterilen çok şiddetli hastalık gelişimi göstermiştir (Şekil 3D ve 3E, Tablo 2). Hastalığın şiddeti nedeniyle aşılamadan sonra birkaç bitki öldü. U. maydis'e dirençli üç mı...

Biyotrofik patojen Ustilago maydis ile mısır ve teozinte bitkileri aşılamak için iğne enjeksiyon yönteminin kullanımı açıklanmıştır. İğne enjeksiyonu aşılama yöntemi, mantar patojeninin, patojenin eksrezi oluşumu yoluyla bitkiye girdiği bitki yaprakları arasında kontrollü bir şekilde teslimini kolaylaştırır. Bu yöntem son derece verimlidir, U. maydisile tekrarlanabilir aşılar sağlar.

Ustilago maydis'in Mısır ve Teosinte Hatlarında Patojenitesini Değerlendirmek İçin Hızlı ve Verimli Bir Yöntem

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

Bu prosedürün genel amacı, iğne enjeksiyonu yoluyla bir USTA Lago fare hücre süspansiyon kültürünü inoküle etmek ve mısır başı ile mısır teosinte çapraz melez hatlarının hastalık direnç reaksiyonu taramasını gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle inokülasyon ve tarama için bitki hatlarının seçilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, deneysel ve kontrol iğne enjeksiyonu inokülasyon deneyleri için tohumlar ekilir.10 gün sonra, hazırlanan hücre süspansiyonu her bir bitkinin gövdesine enjekte edilir. Son olarak, deney ve kontrol bitkilerinin direnç reaksiyonları karşılaştırılır. Nihayetinde, U. Mais ile inoküle edilen bitkinin fenotipinin gözlemlenmesi yoluyla iğne enjeksiyonu inokülasyonunun başarılı olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin temel avantajı, patojeni doğrudan yapraklar arasına iletmesidir. Bu durum, patojen penetrasyonu sorununu ortadan kaldırır. Başlamak için, burada gösterildiği gibi inokülasyon ve tarama için bitki hatlarını seçin; bu çalışmada, deneysel ve kontrol iğne enjeksiyonu inokülasyon deneyleri için iki mısır hattı, beş teosinte hattı ve U Mais'e karşı karakterize edilmemiş dirence sahip 40 mısır-Teosinte melez hattı kullanılmıştır.Her bitki hattından dört adet tohumu, tohumları bir parmakla toprak altına yaklaşık yarım inç olacak şekilde itip üzerlerini hafifçe toprakla kapatarak küçük düz kaplara ekin. Ardından bitkileri bir büyüme odasına yerleştirin ve sulama sonrası toprak altında kaldıklarından emin olarak, tohumlar iyice ıslanana kadar sulayın. Bitkileri sırasıyla 28 ve 20 °C gündüz ve gece ortamlarında, 14 ve 10 saatlik ışık ve karanlık döngülerinde yetiştirin.Kanopi tepesinde saniyede metrekare başına yaklaşık 500 mikromol fotosentetik aktif radyasyon sağlayın. Göreceli nemi gündüz yaklaşık %70 ve gece yaklaşık %90 seviyelerinde tutun ve deney boyunca tutarlı bir büyüme ortamı sağlamak için tüm bitkileri aynı büyüme odasında muhafaza edin. Tohumların ekiminden sekiz gün sonra, steril bir öze yardımıyla dondurulmuş gliserol stokundan PDA (patates dekstroz agar) plaklarına ekim yapın; plakları 30 °C'de iki gün boyunca inkübe edin ve laminer akışlı kabin altında düzgün bir şekilde büyüdüğünden emin olmak için düzenli olarak takip edin.Her suş için tek bir koloni seçmek amacıyla steril bir kürdan kullanın ve kolonileri üç mililitrelik PD besiyeri tüplerine yerleştirin. Kültürleri 30 °C'de ve 200 RPM'de iki gün boyunca inkübe edin ve periyodik olarak büyümeyi kontrol edin. Ardından, kültürlerin 1.0 OD değerine ulaştığından emin olmak için OD 600 ölçümlerini yapın.Su kullanarak, kültürleri 30 mL'lik bir son hacimde, mililitrede 1 milyon hücrelik bir son konsantrasyona getirin. Patojenik hücre süspansiyonunun bu konsantrasyonu, bitkilerin tutarlı bir şekilde iyi enfekte olmasını sağlar. Ardından, inokülasyondan önce, suş olarak hazırladığınız iki karışımdan eşit hacimlerde karıştırın.Üç mililitrelik şırıngayı hücre süspansiyonu ile doldurmadan önce, bitkiye minimum zarar verecek şekilde enjeksiyon yapmak için kontrol şırıngasını suyla doldurun. Her şırınganın ucuna 0,457 mm x 1,3 cm boyutunda hipodermik iğne takın. Bitkileri büyüme odasından çıkarın ve toprak hattının hemen üzerinden 90 derecelik bir açıyla enjekte edin.U maus iğnesini, gövdenin ortasına gelene kadar deneysel bir bitkinin gövdesine dikkatlice yerleştirin. Yaklaşık 100 µL hücre süspansiyonu enjekte edin. Süspansiyon gövde boyunca ilerleyecek ve bitkinin girdabına doğru hareket ederken görünür olacaktır.Şırıngalar boşalana kadar ek deneysel bitkilerin enjeksiyonuna devam edin. Ardından, iğneyi bitki dokularından arındırmak için şırıngayı suyla doldurun ve tüm bitkiler enjekte edilene kadar şırıngayı yeniden doldurun. Kontrol bitkilerini de benzer şekilde enjekte etmek için su şırıngasını kullanın.Enjeksiyonlar tamamlandığında, bitkileri günlük olarak büyüme odasına geri yerleştirin. Sadece toprağı sulayın ve patojen gelişimini ve bitki direnç reaksiyonlarını kontrol edin.Bir ila beş arası direnç reaksiyonu derecelendirmesini kullanarak, inokülasyondan sonraki (DPI) 7, 10, 14 ve 21. günlerde her bir bitki için direnç reaksiyonlarını ölçeklendirin, puanlayın ve kaydedin. Derecelendirme ölçeğindeki sayısal değerler, hastalık şiddeti arttıkça artmaktadır. Örneğin, A1C bir veya iki direnç reaksiyonu, direnç olduğunu gösterir.Üç, dört veya beş direnç reaksiyonu duyarlılığı gösterir. Deneme ve kontrol bitkilerinin direnç reaksiyonlarını karşılaştırın ve A1C için bir veya iki direnç reaksiyonu derecelendirmesine sahip deneme bitkilerini seçin. Bu bitkiler matis'e karşı dirençli kabul edilir.Bu deneyde, humus inoküle edilen bitkilerin çoğunluğu enfeksiyona karşı duyarlıydı. Bitkiler, siyah teliosporların eşlik ettiği gövde ve taban ur oluşumları ile kendini gösteren şiddetli hastalık gelişimi sergilemiştir. Hastalığın şiddeti nedeniyle, inokülasyon sonrası bazı bitkiler ölmüştür.Buna karşılık, kontrol bitkileri oldukça temiz görünmekteydi ve bitkinin hiçbir kısmında patojen gelişimi göstermedi; bu durum, deney bitkilerindeki patojen gelişiminin U Mais ile yapılan iğne enjeksiyonu inokülasyonundan kaynaklandığını göstermiştir. U Mais'e dirençli üç Mais Teosinte çapraz agresyon hattı belirlenmiş ve başarılı inokülasyon, hafif skleroz, siyan üretimi veya hafif yaprak galı oluşumu ile doğrulanmıştır. Bu teknik, tekrarlanabilirlik ile oldukça verimli bir şekilde uygulanabilir. Bu durum, çok sayıda bitkinin inokülasyonuna ve fenotiplemesine yardımcı olur.

a-rapid-efficient-method-for-assessing-pathogenicity-ustilago-maydis

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Burada, bitki virülans bitki patojeni ile test etmek için bir iletişim kuralı mevcut Magnaporthe grisea. Bu rapor mantarlar yalıtır pathotypes büyük ölçekli tarama için katkıda bulunmak ve moleküler ıslahı sırasında bitkilerin dirençli mekanizmaları anlamak için mükemmel bir başlangıç noktası olarak hizmet.

Bitki enfeksiyon Test: Sprey ve bitki patojeni Magnaporthe Grisea ile aşı yara-aracılı

Bu eser için üç farklı Mısır dokuların içine salgılanan Mısır proteinlerin teslim yerinde bir Ustilago maydis Truva atı zor klonlama açıklar.

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Aspergillus flavus büyüme ve aflatoksin üretim mısır çekirdekleri antifungal bir protein ifade içinde analiz etmek için bir iletişim kuralı mevcut burada.  A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak biz izlenen enfeksiyon ve gerçek zamanlı olarak olgun çekirdekleri içinde mantar yayılmasını. Tahlil hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Bitki morfojenik genler inatçı genotiplerin genetik dönüşümlerini iyileştirmek için kullanılabilir. Burada açıklanan bir Agrobacteriumaracılı genetik dönüşüm (QuickCorn) üç önemli kamu mısır inbred hatları için protokoldür.

Agrobacterium-Rekalsitrant Mısır Inbred Hatları Morfojenik Genler Kullanarak Aracılı Olgunlaşmamış Embriyo Dönüşümü

Bu, minimum reaktifler ve ortak laboratuvar ekipmanı (temel bir akıllı telefon dahil) kullanan bir arpa yaprağı kılıfı testinin basit bir protokolüdür. Amaç, gelişmiş mikroskopi ekipmanlarına erişimi olmayan laboratuvarlarda patlama hastalığının erken enfeksiyon sürecini görselleştirmektir.

Pirinç Patlaması Hastalığının (Magnaporthe oryzae) Erken Enfeksiyon Bölgelerinin Arpa (Hordeum vulgare) Üzerinde Temel Bir Mikroskop ve Akıllı Telefon Kullanarak Görselleştirilmesi

Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.

Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları

Bentik makro omurgasızları kullanan hızlı biyolojik değerlendirme protokolleri genellikle su kalitesini izlemek ve değerlendirmek için kullanılır. Etkili bir protokol, Chironomidae yüzeyde yüzen pupa exuviae (SFPE) koleksiyonlarını içerir. Burada, saha toplama, laboratuvar işleme, slayt montajı ve Chironomidae SFPE'nin tanımlanması için teknikler açıklanmaktadır.

Chironomidae (Diptera) kullanılması Yüzey Yüzer Su Organları bir Rapid Bioassessment Protokolü Pupa Exuviae

Ruminant hayvanlardan kaynaklanan metan emisyonlarını ölçmek için kullanılan tekniklerin doğruluğu ve kesinliği, sera gazı azaltma çabalarının başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu el yazması, geviş getiren hayvanların nefesinden metan ve karbondioksit kütle akışlarını izlemek için otomatik bir sistemin ilkelerini ve işleyişini açıklamaktadır.

Bir Otomatik Sistem (GreenFeed) Kullanımı Ruminant Animals Enterik Metan ve Karbon Dioksit Emisyonları izlemek için

Öğrenin, Ustilago maydis ile mısır ve teosinte hatlarında iğne enjeksiyonu yöntemiyle hastalık direnci taraması yapmayı. Bu teknik, bitki-patojen etkileşimlerini anlamak ve dirençli çeşitleri belirlemek için verimli bir yaklaşım sunar.

Ustilago maydis'in Mısır ve Teosinte Hatlarında Patojenitesini Değerlendirmek İçin Hızlı ve Verimli Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet