Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, bir bakteriyel proteomun iki boyutlu haritasını çıkarmaktır. Bu işlem, öncelikle bir bakteri kültürü büyütülüp proteinlerin hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hasat edilen proteinler pH değerlerine göre tek boyutta ayrıştırılır.

İlk boyut ayrımından sonra izoelektrik odaklama ile proteinler, ikinci boyutta moleküler ağırlıklarına göre daha fazla ayrıştırılır. Son olarak, ikinci boyut jeli boyanır ve proteinler görselleştirilir. Nihayetinde, iki boyutlu elektroforez yoluyla protein ekspresyonundaki farklılıkları gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, belirli koşullar altında hangi proteinlerin üretildiği ve farklı bakteriyel izolatların protein üretimi açısından nasıl farklılaştığı gibi, bakteriyel patogenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu bilgiler, virülansta rol oynayabilecek aday proteinlerin belirlenmesine katkı sağlayabilir. 100 mililitre bur cold süt kültürü stasyoner faza kadar büyütüldükten sonra, 35 mililitresi bir santrifüj tüpüne aktarılır ve 4.500 Gs ve dört °C'de 20 dakika boyunca santrifüj edilir.

Pelleti 35 mililitre soğuk PBS içinde resüspande edin ve santrifüj işlemini tekrarlayın. Pelleti bir mililitre soğuk PBS içinde resüspande ettikten sonra çözeltiyi steril iki mililitrelik bir mikrotüpe aktarın ve tekrar santrifüjleyin. Dört °C'de ve 14,000 G'de bir dakika boyunca santrifüjlemeden önce yıkama işlemini bir mililitre soğuk PBS ile tekrarlayın, süpernatantı atın ve bir mililitre P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F çözeltisi ekleyin; çözünen pelleti yaklaşık 0,5 mililitre ön sterilize cam boncuk içeren iki mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın.

Ardından, hücreleri parçalamak için soğuk odada mini boncuklu parçalayıcıyı (bead beader) her biri bir dakika sürecek şekilde üç kez kullanın ve her turdan sonra örneği buza yerleştirin; süpernatantı steril beş mililitrelik polistiren tüpe aktarmadan önce bir dakika boyunca santrifüjleyin. Verimi artırmak için, ek bir P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F alikotu ile boncukla parçalama işlemini iki kez tekrarlayın. Örnekleri çekin.

Ardından protein miktarı tayini yapıldıktan sonra, birinci boyutu gerçekleştirmek için kullanıma hazır olana kadar 200 µg'lık alikotları -80 °C'de saklayın. İzoelektrik odaklama veya IEF, şerit tutucuları temizlemek için şerit temizleme solüsyonu kullanılarak başlatılır. Ardından şeritler milli Q su ile durulanır.

Ardından kurumaları için ters şekilde bırakın ve kurutma işleminden sonra her örneğe bir jel şerit tutucu numarası atayın. Daha önceden hazırlanmış 200 microgram protein örneğini şerit tutucunun yan kuyucuğuna yükleyin ve temiz bir pens yardımıyla örneği tutucu boyunca dağıtmak için pipet kullanın. Jel şeritlerini ambalajından çıkarın.

Ardından, jel şeritleri negatif uçtan pozitif uca doğru ıslanmalarını sağlamak için yavaş bir kaydırma hareketiyle pürüzlü yüzeyleri aşağı gelecek şekilde yerleştirmeden önce üzerlerindeki koruyucu tabakayı çıkarın. Yanmayı önlemek için, sterilize edilmiş su ile nemlendirilmiş blot kağıtlarını elektrodun üzerine ve jel şeritlerin altına yerleştirin. Hava kabarcıklarını giderin ve kurumayı önlemek için üzerini ince bir mineral yağ tabakasıyla kaplayın.

IEF cihazındaki jel şeridi tutucuları hizalayın. Burada listelenen programı kullanarak numuneleri çalıştırın. Jeller, son adım sırasında herhangi bir zamanda çıkarılabilir.

Program tamamlandığında, şeritleri şerit tutuculardan çıkarın ve hemen kullanılmayacaksa, ikinci boyut SDS-PAGE işlemini gerçekleştirene kadar streç filmle kapatıp -80 °C'de saklayın. SDS-PAGE için jel döküm düzeneğini kurduktan sonra, vakum ucu ve manyetik karıştırıcı bulunan bir erlenmayer içerisinde 1,5 M Tris tamponu ve Milli-Q su karışımı ekleyerek jel çözeltisini hazırlayın ve çözeltiyi vakum altında orta hızda 20 dakika boyunca degaze edin. Vakum işlemi bittiğinde, %10 SDS'yi erlenmayerin kenarından pipetleyerek jel çözeltisine ekleyin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için, ardından taze hazırlanmış amonyum persülfat ve TEMED ekleyip karıştırın.

Jeli dökün ve donmaya bırakın, ardından DTT'yi daha önce hazırlanmış dengeleme çözeltisi içinde çözün. Şeritleri -80 °C depolama alanından çıkarın, ambalajlarını açın ve IPG şeritlerini jel tarafı aşağı gelecek şekilde tampon çözeltiye yerleştirip 30 dakika inkübe edin. Sonrasında, yürütme tankına 4,5 litre elektroforez tamponu ekleyin.

Ardından cımbız kullanarak şeritleri dengeleme çözeltisinden çıkarın ve fazla tamponu süzmek için kağıt havlu kullanın. Jel döküm düzeneğini sökün ve cam plakaları ılık suyla yıkayın. Jelin üzerindeki suyu çalıştırma tamponu ile değiştirdikten sonra, temiz bir cımbız kullanarak bir şeridi, jel tarafı size bakacak şekilde uzun plakanın üzerine yerleştirin.

Şeridi 1x tampon ile yağlayın ve IPG şeridini jel boyunca daha aşağı kaydırarak şerit ile jel arasındaki tüm hava kabarcıklarını gidermek için plastik bir şerit kullanın. Şeridi yerine sabitlemek için üst kısmına agaroz sızdırmazlık çözeltisi ekleyin. Ardından, işlemi tüm şeritler için tekrarladıktan sonra, düzeneği jel tankına indirin.

Dış bölmedeki 1x tampon çözelti seviyesinin belirlenen düzeyde olduğundan emin olduktan sonra üst bölmeyi takın. Üst tampon bölmesi çerçevesini cam plakaların üzerine yerleştirin ve bastırın. Üst bölmeye orta çizgiye kadar 2x çalışma tamponu ekleyin.

Ardından, üst çizgiye ulaşana kadar dış hazneye 1x çalışma tamponu ekleyin. Kapağı üzerine yerleştirin ve elektroforez ünitesi ile güç kaynağını açın. Örnekleri gece boyunca 52 volt, 96 miliamper ve beş watt değerlerinde çalıştırın.

Öncü hatlar tabandan bir santimetre uzaklığa gelene kadar jelleri çalıştırın. Çalışma süresi sonunda, plakaları döküm aparatından çıkarın. Jeller cam plakalardan ayrıldıktan sonra, onları en az bir saat boyunca veya gece boyunca dört degrees Celsius'ta birinci çözeltide sabitleyin.

Ardından jelleri iki numaralı tespit çözeltisine aktarın ve bir saat boyunca sallayın. Jelleri Milli Q suyu ile dört kez, her seferinde 15 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra jelleri boyamak için gümüş nitrat çözeltisini 30 dakika veya 48 saate kadar kullanın.

Jelleri bir dakika boyunca Milli Q su ile yıkadıktan sonra, jel boyanana kadar geliştirme çözeltisine aktarın. Yaklaşık beş ila 30 dakika sonra reaksiyonu durdurmak için jelleri 10 dakika boyunca durdurma çözeltisine aktarın. Burada, ol dia multivorans'tan elde edilen tüm hücre protein ekstraksiyonlarının Kumasi Blues boyalı jeli gösterilmektedir.

LB veya maya mannitol besiyerinde büyütülen ve stasyoner fazda hasat edilen klinik izolatlar. Aynı bakteri kültürlerinden iki farklı seferde ekstrakte edilen protein profillerinin karşılaştırmalı analizi, başarılı protein ekstraksiyonlarını gösteren benzer bant paternleri ortaya koymuştur. Bu şekilde, Bural dio, pseudo'dan elde edilen 200 micrograms toplam proteinin 2D jel elektroforez analizi, kütle spektrometrisi ile ayrı ayrı tanımlanabilen 500'den fazla spotun bolluğunu göstermektedir.

Bu prosedürün ardından, birbirine yakın bakteri izolatları arasındaki kalitatif ve kantitatif farkları belirlemek amacıyla sitometri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Ayrıca, boyama yönteminde yapılacak bir modifikasyonla araştırmacılar, spot eksizyonu ve kütle spektrometrisi yoluyla protein spotlarının kimliğini belirleyebilirler.