Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, rabbit opsis'te endospermin çeşitli çevresel koşullara yanıt olarak tohum çimlenmesini genetik ve in vitro düzeylerde nasıl kontrol ettiğini araştırmak için bir tohum kabuğu yatak deneyi kurmaktır. Bu işlem, öncelikle bir şırınga iğnesi ve küt uçlu pens kullanılarak Arab Opsis tohumundan tohum kabuğu ve embriyosunun dikkatlice diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, diseke edilen tohum kabukları nazikçe çimlenme ortamına aktarılır.

Ardından, tohum kabukları tek bir dairesel katman halinde bir araya getirilir. Son adımda, embriyolar birleştirilen tohum kabuğu yatağının merkezine yerleştirilir. Bu işlem de tek bir dairesel katman şeklinde gerçekleştirilir.

Endosperm, Arabidopsis tohumlarında tohum çimlenmesini kontrol etmede temel bir rol oynar. Tohum kabuğu bükülme deneyi, tohum çimlenmesinin kontrolü için endospermde işleyen sinyal yolaklarının moleküler genetik bileşenlerini belirlemeye yönelik in vitro bir genetik sistem prosedürüdür. Genel olarak, embriyoyu hızlıca ve onlara zarar vermeden ayırmanın zor olması nedeniyle, bu yönteme yeni başlayanlar başlangıçta güçlük çekmektedir.

Materyalin yaşı da dikkate alınması gereken önemli bir faktördür, çünkü yaşlandıkça hücre kaderini kontrol etme kapasitelerini kaybedebilirler. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 50 ila 60 µL olgun kuru Arab opsis tohumu dökerek başlayın. Ardından tüpe 1 mL %70 etanol ekleyin ve tohumları oda sıcaklığında bir vorteks karıştırıcıda 1200 RPM hızında sallayın. 10 dakika sonra, tohumları tüpün dibinde toplamak için tüpü 4.000 G kuvvetinde üç saniye boyunca santrifüjleyin.

Ardından, tohumlar tüpün dibinde kalacak şekilde etanolü dikkatlice aspire etmek için bir vakum emme ucu kullanın. Şimdi tohumlara bir mililitre steril distile su ekleyin ve tohumları 10 dakika daha çalkalayın. Tohumlar tekrar santrifüjlendikten sonra, süpernatanı aspire edin ve su akışının tohumları tüp boyunca homojen bir şekilde süspanse ettiğinden emin olarak tüpe bir mililitre daha steril distile su ekleyin.

Ardından, tohumların tüpün dibine çökmesi için tüpü bir rafa yerleştirin. Yaklaşık 30 saniye sonra, tohumları ekmek için suyu dikkatlice aspire edin. İlk olarak, taze hazırlanmış 50 °C çimlendirme ortamından 30 mL'yi 100 mm'lik bir Petri kabına dökün. Tohumları 200 µL steril distile su içinde yeniden süspande edin ve ardından onları çimlendirme ortamının yüzeyine aktarmak için bir 1 mL mikropipet ucu kullanın.

Tohumların etrafındaki suyu aspire edin ve ardından petri kabını ve tohumları daha fazla kurumaları için laminar akış kabininde ağzı açık şekilde bırakın. İki saat sonra, tohumları başka 90 dakika boyunca kabin içerisinde bırakarak Petri kabının kapağını kapatın. Şimdi, kabinin içine bir stereo mikroskop yerleştirin.

Başka bir 100 milimetrelik Petri kabına 30 mililitre çimlendirme ortamı dökün ve ardından ortamın yüzeyine yan yana getirilmiş iki adet dikdörtgen otoklavlanmış watman üç milimetrelik kağıt yerleştirin. Bu prosedürün en zor adımı disseksiyondur; çünkü tohum çok ince olduğundan, steril küt uçlu dumont No. 5 pens ile tutulan tohum kesilirken embriyoya zarar vermemek için çok dikkatli olmak gerekir.

Tohumları kağıtların üzerine aktarın, ardından pensi kapalı tutun. Tek bir tohumu kağıda hafifçe bastırın. Şimdi, 29 gauge insülin şırıngası iğne ucunu kullanarak, tohum kabuğunu en uzun yarı ana eksen boyunca, koledeklerin radikule birleştiği yere mümkün olduğunca yakın olacak şekilde kesin.

Ardından, tohumu kağıda doğru itmek için pens kullanın. Bir tohum kabuğu yatak deneyi düzeneği kurmak için, embriyoyu tohum kabuğundan ayırmak amacıyla tekrar radikula en yakın olan Cains ucuna basınç uygulayın. İlk olarak, steril naylon ağın 3,5'e 5 santimetrelik bir parçasını, yeni dökülmüş 100 milimetrelik başka bir çimlenme besiyeri kabına yerleştirin.

Ardından, embriyoları ve tohum kabuklarını pensetin metal kenarlarına nazikçe itmek için şırıngayı kullanın ve bitki dokularını naylon ağ üzerine aktarın. Tohum kabuklarının mümkün olduğunca birbirine yakın olduğundan ve kabuklardaki açıklıkların yukarı baktığından emin olarak, penset ve şırıngayı kullanarak tohum kabuklarından tek bir dairesel katman oluşturun. Daha sonra, embriyoların da mümkün olduğunca birbirine yakın olduğundan emin olarak, embriyoları tohum kabuğu yatağının merkezine tek bir dairesel katman halinde yerleştirin.

Son olarak, önceki sonuçlarla tutarlı olacak şekilde, tohum yatağı deneylerini 20 ila 21 °C'de sürekli ışık altında inkübe edin. Gierillin sentezleyemeyen rabbit opsys mutant tohumları veya GA eksik mutantları, tohum inhibasyonundan 80 saat sonra çimlenemez. Buna karşılık ve önceki sonuçlarla daha fazla tutarlılık göstererek, ortamda OB CIC asit veya bir BA bulunmadığı sürece, tohum kabuğunun çıkarılması GA eksik mutant embriyosunun büyümesini tetikler; bu durum, GA eksik mutantların endosperminden, çimlenmeyi engellemek için embriyoya doğru bir BA salındığını göstermektedir.

Bu görüntüde, tohum inhibasyonundan 80 saat sonra, 80 GA eksik mutant tohum kabuğu yatağında gerçekleştirilen GA eksik mutant embriyolarla bir tohum kabuğu yatak testi gösterilmiştir. Hipotezimizle uyumlu olarak, GA eksik mutant tohum kabukları, GA eksik mutant embriyoların büyümesini engellemektedir. Burada, tohum inhibasyonundan 80 saat sonra, A BA sentezleme kapasitesinden de yoksun GA eksik mutant tohum kabuklarından oluşan bir yatakta kültüre edilen GA eksik mutant embriyolarla yapılan bir tohum kabuğu yatak testi gösterilmiştir; beklendiği üzere, mutant tohum kabukları GA eksik mutant embriyoların büyümesini engellemede yetersiz kalmıştır.

Benzer şekilde, RGL2 faktöründen yoksun GA eksik mutant tohum kabukları üzerinde kültüre edilen GA eksik mutant embriyolar da bu prosedürün ardından GA eksik mutant embriyoların büyümesini engellememiştir. Tohum kabuğu banyosu kullanılarak yapılan genetik etkileşimi incelemek amacıyla, tohum kabuğundan ve tohumdan ayrıştırılan embriyodan gen ekspresyon analizi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu nedenle, teknik ustalığa erişildiğinde, tohum çimlenmesi alanındaki araştırmacıların, tohum kabuğunun çevresel ipuçlarına yanıt olarak embriyonik büyümeyi nasıl kontrol ettiğini incelemesine olanak tanımalıdır.