Kültürlü ve Gut metabolik Aktif Bakterilerin Tanımlanması Spodoptera littoralis DNA Kararlı İzotop yoluyla kullanma Probing ¹³ C = Glukoz

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir böceğin bağırsağındaki metabolik olarak aktif bakterileri genetik olarak karakterize etmek için kullanılan etkili bir metodolojiyi detaylandırmaktır. Bu, bağırsaklarındaki metabolik olarak aktif bakterilerin DNA'sını izotopik olarak zenginleştirmek için önce C13 etiketli glikozun böceğe beslenmesiyle elde edilir. Bir sonraki adım, bağırsakta bulunan bakteri topluluğunun DNA'sını çıkarmaktır.

Üçüncü adım, C 13'ü içeren metabolik olarak aktif türlerin DNA'sını ayırmaktır. DNA daha sonra filogenetik olarak tanımlanır ve piro dizileme ile mevcut türler için niceliklendirilir. Böylece, böcek bağırsağında bulunan topluluğu içeren metabolik olarak aktif bakteri türlerinin tanımlanması.

Bu nedenle, çok hücreli organizmanın bağırsağı, mikroorganizmaların karmaşık organik maddeleri çözmek veya çözündürmek için metabolik kapasitelerinden yararlanmak için ustaca bir buluştur, böylece sonunda böcek konakçısı için besin görevi görebilir. Sistemi anlamak için, önce orada kimin olduğunu ve ikinci olarak kimin hangi metabolik aktiviteye sahip olduğunu analiz etmeliyiz. Bu verilere sahipsek, bozunan mikroorganizmalar ile böcek konakçısı arasındaki metabolitlerin ve bozunma ürünlerinin akışını yeniden yapılandırabiliriz.

Bu yöntem, mikrobiyal ekoloji alanındaki, özellikle de bu mikropların konakçılarıyla etkileşime girme biçimlerindeki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu anlamda, daha fazla bilgi sahibi olabilir ve bu organizmaların konakçıları için hizmet ettikleri işlevlerin neler olduğunu açıklığa kavuşturabilir ve tanımlayabiliriz. Bu yöntem genel aktif bağırsak bakterileri hakkında bilgi sağlayabilir.

Ucle glikozunu izleyerek, ocrant besin maddesinin sindirim sürecinde yer alan aktif bakterileri tanımlamak için cellozu etiketlemek gibi diğer karbon kaynaklarına da uygulanabilir. Op litre, yumurta ve Petri kaplarını koruyun, yumurtadan çıkana kadar oda sıcaklığında ekleyin. Daha sonra yumurtadan yeni çıkmış larvaları temiz bir plastik kutuya aktarın ve 16 saat aydınlatma ve sekiz saat karanlık ile uzun bir gün rejiminde 23 ila 25 santigrat derecede yapay bir diyetle besleyin, birkaç gün sonra dokuz ila 15 sağlıklı ikinci larvayı yetiştirme kutusundan taze C 13 glikoz içeren bireysel Petri kaplarına aktarın.

Çivili yapay diyet, tedavi başına her biri üç larvadan oluşan en az üç kopyaya ihtiyaç vardır. Kontrol grubunu beslemek için pamuk gibi doğal bir besin kaynağı ile aynı miktarda doğal glikoz sağlayan yapay bir diyet kullanın. Önümüzdeki 24 saat içinde.

Yapay diyetleri sık sık yenileyin. Büyük döküntüleri gidermek için larvaları yumuşak forseps ile damıtılmış su havuzuna aktararak başlayın. Daha sonra böcekleri uyuşturmak ve öldürmek için yeni ve temiz bir kaba aktarın.

Onları buzun üzerine yerleştirin ve ardından sıcaklığı bir soğutucuda eksi beş santigrat dereceye düşürün. Daha sonra ölü böcekleri% 70 etanol ile dezenfekte edin ve diseksiyon için PBS'ye daldırın. Aletler ayrıca %70 etanol ile temizlenmelidir.

Sağ ve sol taraflar boyunca kütiküldeki kesilerle başlayın. Baştan başlayın ve anüs üzerinde bitirin. Tüm dış iskeleti, mali tübüllerini ve yağ gövdesini çıkarın.

Daha sonra bağırsağı açmadan önce tamponu diğer dokulardan izole edilen bağırsakla değiştirin. Bağırsak, orta bağırsak veya arka bağırsak için tüm bağırsağı veya bölümleri işleyin. Bilimsel soruya bağlı olarak.

PBS içermeyen bağırsak dokularını küçük bir steril tüpe aktarın ve dondurucuda saklayın. DNA ekstraksiyonundan önce, numuneleri dokunun boyutuna bağlı olarak 30 ila 90 dakika boyunca bir vakum yoğunlaştırıcı cihazda 45 santigrat derecede kurutun. Daha sonra, toprak DNA ekstraksiyonu için bir kit kullanarak genomik DNA'yı çıkarmak için steril bir plastik Pele kullanarak kurutulmuş dokuyu ezin.

Daha sonra bir spektrofotometre kullanarak son kaçan DNA'nın konsantrasyonunu belirleyin. Bakteriyel genel primerler 27 F ve 1, 492 R kullanarak bir tanısal PCR testi hazırlayarak mikrobiyal metagenomik DNA'nın böcek bağırsağından başarılı bir şekilde ekstraksiyonunu doğrulayın. Her bir PCR ürününden beş mikrolitreyi 300 volt ve 115 miliamperde %1'lik bir agros jel üzerinde yaklaşık 20 dakika çalıştırın.

Amplikonların doğru boyutu 1,5 kilobazdır. Her deneysel kopyaya karşılık gelen ekstrakte edilmiş DNA'yı birlikte çekin. C 13 glukozu olan ve olmayanları ayrı tutmak.

Her numunenin havuzuna eşit şekilde katkıda bulunduğundan emin olmak için DNA konsantrasyonlarını normalleştirin. Ultrasantrifüjleme işlemi için 500 ila 5.000 nanogram DNA'lık bir nihai konsantrasyon uygundur. Steril 15 mililitrelik vidalı kapaklı tüpte spektrofotometre ile beklenen konsantrasyonu iki kez kontrol edin.

Degrade ortamı ayarlayın. Niceliksel DNA'yı 4.8 mililitre sezyum klorür çözeltisi ile birleştirin. Ardından hacmi altı mililitre gradyan arabelleği ile tamamlayın.

Karışımları dikkatlice 5.1 mililitrelik ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Bir şırınga ve iğne kullanarak tüpleri boynunun tabanına kadar doldurun ve herhangi bir hava kabarcığı pompalamaktan veya oluşturmaktan kaçının. Her çalıştırmada DNA içermeyen en az bir boş gradyan ekleyin.

Referans gradyanı olarak hareket etmek için, tüp çiftlerini seçin ve bunları 10 miligram içinde dengeleyin. Her tüpe bir tüp kabı uygulayın ve tüpü ters çevirerek ve elle orta derecede basınç uygulayarak sızıntı yapmadıklarından emin olun. Sekiz kuyulu dikey bir rotor kullanın.

Rotor yuvalarını dikkatlice kapatın ve rotoru üreticinin talimatlarına göre ultrasantrifüje yükleyin. DNA'yı 40 saat boyunca bir vakum altında 20 santigrat derecede 50.000 RPM'de döndürün. Frenleme yapmadan maksimum hızlanmayı ve yavaşlamayı seçin.

İki gün sonra, forseps kullanarak tüpleri santrifüj rotorundan dikkatlice çıkarın. Oluşan gradyanları bozmadan bir rafa yerleştirin ve tüpleri hemen işleyin. İlk olarak, dakikada 850 mikrolitrelik bir akış hızı kullanarak bir HPLC'yi dengeleyin.

Daha sonra ultrasantrifüj tüpünü bir kelepçe standına takın ve tüpün altını bir şırıngaya bağlı 23 gauge bir inçlik bir iğne ile delin. Bu nedenle, başarılı bir PSA hareketi sağlamak için formu, gradyanı ve uygulamayı önceden bozmamak için tüpün üst kısmını bir kontrol madencisi ile dikkatlice delin. Daha sonra, pompa borusuna bağlı iğneyi, sıvı olmayan tüpün üst kısmına yerleştirin ve alttan damlaları doğrudan steril 1.5 mililitreye toplayın Mikro füj tüpleri, fraksiyon başına 425 mikrolitre için her 30 saniyede bir fraksiyon toplar.

Bu örnekte, her gradyandan 12 kesir toplanmıştır. Ardından, ayrılan her bir fraksiyonun yoğunluğunu analitik bir terazide ölçün. 24 saat boyunca metin protokolüne danışarak DNA kurtarma ve pyro dizileme ile devam edin.

SSOP litre diyetinde 10 milimolar C 13 glikoz takviyesi yapıldı. Larva. Kontrol böceklerinin yiyeceklerine aynı miktarda normal glikoz eklendi. Daha sonra DNA, böcek bağırsağının bakteri topluluğundan ekstrakte edildi.

Bir elektroforez jeli üzerinde, üstteki güçlü bir genomik DNA bandı, tanısal bir PCR olan başarılı bir DNA ekstraksiyonunu doğruladı. Bakteriyel evrensel primerlerin varlığının gösterilmesi, bakteri DNA'sının varlığını göstermek, türün soyunu ve nispi bolluklarını ortaya çıkarmak için doğrudan temsili SIP gradyanları üzerinde kantitatif pyro dizilemesi yapıldı. Ortalama 404 OT uzunluğunda toplam 120.045 yüksek kaliteli okuma üretildi.

Piro dizileme profili, kontrol grubundakine kıyasla etiketli numunede enterococcus ve panto dahil olmak üzere belirli türlerin bolluğunun arttığını gösterdi. Bu nedenle, bu bakterilerin metabolik olarak aktif olduğu ve daha fazla çalışmayı hak ettiği düşünülmektedir. Bu nedenle, bu prosedürü denerken, CYP analizine uygun bir kontrolü dahil etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu nedenle, arka planın etkisini çıkaracak, saç flaşındaki kirlenme ve bakteri çeşitliliğinin ve bolluğunun ortaya çıkması veya kaybolması kütlenin kendisinin eseri değildir. Bu prosedürü takiben veya floresan in situ hibridizasyon gibi metodolojiler, ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir ve gerçekleştirilebilir. Bu durumda, böceğin bağırsağındaki bakterilerin lokalizasyonu ve düzenlenmesi ile ilgilenecektir.