Name: Kültürlü ve Gut metabolik Aktif Bakterilerin Tanımlanması Spodoptera littoralis DNA Kararlı İzotop yoluyla kullanma Probing 13 C = Glukoz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T20:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Keşfedin, kararlı izotop problama yöntemiyle Spodoptera littoralis bağırsağındaki metabolik olarak aktif bakterileri nasıl tanımlayacağınızı öğrenin. Bu protokol, bakteri kimliğini metabolik aktiviteyle ilişkilendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz laboratuvar yardım için Angelika Berg teşekkür ederim. Bu çalışma Max Planck Derneği ve Mikrobiyal İletişim (JSMC) için Jena Okulu tarafından desteklenen ve finanse edilmiştir.

1.. Böcek Yetiştirme <ol><li> Satın alma veya spodoptera yumurta clutches elde kendi Yetiştiricilikten littoralis&#39;e. Kuluçka kadar oda sıcaklığında (RT) steril Petri tabaklarında bunları muhafaza edin. </li><li> Aşağıdaki gibi yetiştirme böcekler için yapay bir diyet hazırlayın: <ol><li> 100 ml su gecede 500 g öğütülmüş beyaz fasulye bekletin. </li><li> H 2 O damıtılmış 1.000 ml 9.0 g askorbik asit ve 75 g agar ekleyin ve daha sonra kaynatın. </li><li> Karışım soğumaya olsun ve (beyaz mumsu bir katı madde kanşımına) katılaştığı zaman, kullanılana kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Aydınlatma 16 saat ve 8 saat karanlık ile uzun gün rejimde temiz plastik bir kutu ve 23-25 ​​° C de, suni diyet üzerinde arka bunları için yeni çıkmış larva aktarın. Larvalar altı larva instars geçmesi kadar her gün yiyecek değiştirin. </li></ol> Metabolik olarak aktif Gut Bakterilerde DNA 2.. 13 C-etiketleme <ol><li> Damıtılmış ve iyonu giderilmiş su (GKD 2 O) ile tamamen 13C-etiketli glikoz 186,1 mg çözülür ve SIP deney için suni diyetin 100 g ile iyice karıştırın. Yapay diyet içinde 10 mM&#39;lik bir son 13 C-glikoz konsantrasyonunu sağlamak. Bu S. bağırsakta in situ glikoz konsantrasyonunu taklit Shao et al pamuk bitkileri üzerine littoralis larvası besleme. (teslim). </li><li> Transferi 9-15 taze 13 C-glikoz içeren steril plastik Petri (Petri kabı başına bir larva) için yetiştirme kutusundan sağlıklı ikinci dönem larva yapay diyet çivili. Tarif edildiği gibi, kontrol grubuna beslemek için, doğal glükoz (12 C-glukoz), aynı miktarda ihtiva eden yapay bir diyet kullanın. </li><li> Kuluçka dönemi (1 gün) sırasında sık sık yapay diyet yenileyin. Adım 1.3 &#39;de olduğu gibi yetiştirme koşulları kullanın. </li><li> Daha sonra işleme (DNA ekstraksiyon) için her tedavi dokuz larvaları toplayın. Herüç kişi tarafından teşkil edilir çoğaltmak, muamele başına en az üç suret olun. </li></ol> 3. Böcek Diseksiyon <ol><li> Temiz ve etanol% 70 (Araçlar = Vannas makas, forseps ve ince tek bıçaklı bisturi) ile işin başında kesme aletleri dezenfekte. </li><li> Yumuşak bir forseps ile böcekler al ve damıtılmış su ile yüzeysel olarak kendi yıkayın. Onları uyutmak için en az 30 dakika süreyle buz koyun. </li><li> Hala onları öldürmek için 1 saat boyunca 0 ° C&#39;de yer onları anestezi iken. Birkaç dakika için etanol (% 70) onları daldırarak yüzeysel ölü böcekler dezenfekte edin. </li><li> PH&#39;ı 7.4 &#39;e ayarlayın, yaklaşık 15 ml 1 x PBS, steril bir Petri kabı (1XPBS = 137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4 üzerinde biriken bir hacim içine böcek diseksiyon , otoklav). Tam solut dalmış bütün böcek vücuda sahip emin olunbütün kesme süresi boyunca iyon. </li><li> Kafasına başlar ve anüs bitirmek, sağ ve böceğin sol tarafı boyunca deride bir kesi yaparak diseksiyonu başlayın. Tüm cilt, Malpighi tübüllerini ve vücut yağ çıkarın. Bağırsakları açık kesmeden önce taze tampon değiştirin. Bölüm öne-, orta-, ve hindgut de bağırsak gerekli. Dondurucuda saklayın doku (-80 -20 ° C) kadar DNA ekstraksiyon </li></ol> 4. Ekstraksiyon ve DNA amplifikasyon <ol><li> 1.5 ml steril santrifüj tüpü içerisinde böcek doku koyun ve bir vakum konsantratör cihazında 45 ° C&#39;de tüm örnekleri kurutun. Steril plastik bir havan tokmağı ile kurutuldu, doku ezmek. </li><li> Toprak DNA ekstraksiyonu için uygun bir kit kullanılarak genomik DNA ekstrakte edin. Kitin reaksiyon tüpüne kuru doku aktarın ve üretici tarafından belirtildiği gibi talimatları takip edin. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, son Yıkanarak ayrılan DNA ilk konsantrasyonunu belirleyin. </li><li> Verifve 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3) - eubacterial genel primerler 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3 5) kullanılarak, bir PCR teşhis tahlili hazırlayarak böcek bağırsaktan mikrobiyal metagenomic DNA ya başarılı bir şekilde uzaklaştırılması. Aşağıdaki gibi PCR reaksiyonu ayarlayın: <ol><li> 1x tamponu, 1.5 mM MgCI2, 10 mM, dört deoksinükleosit trifosfat (dNTP), 2.5 U Taq DNA Polymerase, her bir primerden 0.5 mM ve şablon olarak ekstre DNA 60 ng ihtiva eden bir 50 ul reaksiyon karışımı ayarlayın. </li><li> 30 saniye boyunca 55 ° C &#39;de 45 saniye, tavlama için 94 ° C ve 1 dakika boyunca 72 ° C&#39;de uzatma:; 35 devir ile takip olunan, ilk 3 dakika boyunca 94 ° C&#39; de denatürasyon aşağıdaki gibidir: bir PCR kullanılarak PCR reaksiyonları . 10 dakika boyunca 72 ° C&#39;de son uzatma adımı kullanın. </li><li> Bir% 1 agaroz başarılı PCR amplifikasyon etidyum bromid (EB) ile boyanmış jel (100 1x TAE tampon ml ve 1 ul EB ile leke agaroz 1 g çözülür) elektroforez edin. Th mevduat 5 uljel cebine 6x yükleme boyası + 1ul e PCR ürünü. (1x TAE pH 8&#39;e ayarlamak, 40 mM Tris-Base, 20 mM buzlu asetik asit, 1 mM EDTA =). </li><li> Ca için 300 V, 115 mA 1xTAE tamponu kullanılarak jel çalıştırın. Bir elektroforez odası içinde 20 dakika. Bir jel dokümantasyon odasını (bir dijital kamera ve bilgisayara bağlı UV transilluminator&#39;de) kullanarak jel gözlemlemek ve aynı zamanda yüklenen gen işaretleyici ile nihai ürünün boyutunu karşılaştırmak, amplikonlarının doğru boyutu yaklaşık 1.5 kb olmalıdır. </li></ol></li><li> Tercihen, derin dondurucu koşullarda PCR ürünlerini saklamak -80 ° C, kullanıma kadar. </li></ol> 5. DNA Ayırma-CsCl Gradient Ultrasantrifüj <ol><li> Aşağıdaki gibi ultra-santrifüj için geçişlerini için reaktifler hazırlayın: <ol><li> Yavaş yavaş GKD 2 O CsCl 603,0 g çözülmesiyle bir 7.163 M sezyum klorür (CsCl) çözeltisi hazırlayın ve 500 ml&#39;lik bir nihai hacme kadar doldurun. </li><li> Doğru deüç kere ile üç basamaklı bir bakiye üzerinde 1.0 ml&#39;lik bir şişe tartılarak hazırlanan CsCl çözeltinin yoğunluğunu termine. Bu genellikle 1,88 ve 1,89 g / ml &#39;den, oda sıcaklığında değişmektedir. </li><li> 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M EDTA, 1 ml (pH 8) ve son olarak 3.75 g KCl, 50 ml birleştirerek, gradyan tamponu (100 mM Tris, 100 mM KCI, 1 mM EDTA) hazırlanması GKD 2 O. kullanarak 500 ml hacmi (0.22 mikron) filtre bu çözüm ve sterilize otoklav. </li></ol></li><li> DNA Ayırma <ol><li> Noktası 4.3 &#39;de olduğu gibi muamele edilmiş böceklerin ölçülen bireysel DNA konsantrasyonu, tespit edildikten sonra, birlikte bir tekrarında tekabül eden ve her biri, eşit olarak toplanmış numuneye katkı sağlamak için kendi DNA konsantrasyonu normalize bu böcekler havuz. DNA 500-5,000 ng (yine nihai konsantrasyonunun ölçülmesi) içindeki bir nihai konsantrasyonu, ultra santrifüjleme işlemi 21 için uygundur. </li><li> Degrade ortamı kurmak için, sayısal DNA, degrade tampon AN birleştirmekd 4,8, steril bir 15 mL vida kapaklı bir tüp (gradyan orta DNA karışımının üretimi) içinde 6.0 ml &#39;lik bir hacme kadar karışık birlikte 7,163 M CsCl çözeltisi ilave edildi. </li><li> Dikkatli bir şırınga ve iğne kullanılarak (tüp boyun tabanına kadar doldurun) 5.1 ml ultrasantrifüjdeki tüpüne hazırlanmış degrade orta-DNA karışımı yerleştirin. Herhangi bir hava kabarcıkları pompalama veya oluşturmaktan kaçının. Bir referans gradyan olarak her santrifüj vadede (yerine DNA GKD 2 O kullanarak) en az bir boş degrade içerir. </li><li> Gerekli her gradient orta sonra ağırlık 10 mg olan Bakiye tüp çiftleri ilgili bir ultra santrifüj tüpüne dolduruldu. Bir &quot;tüp Topper&quot; ile tüp Seal ve conta sızıntısız tüp ters çevrilerek ve elle orta derecede bir basınç uygulayarak olduğundan emin olun. </li><li> Ultra-santrifüj 5.1 ml tüpler ultrasantrifügasyon tutmak için sekiz kuyucuklu bir dike yakın rotor kullanın. Dikkatle rotor kuyuları mühür ve ma göre ultrasantrifüjdeki içine rotor yüknufacturer talimatları. Ultrasantrifügasyon koşulları ayarlayın: falso vakum ile 40 saat çalışma süresi 50.000 (177.000 xg civarında) rpm, sıcaklık 20 ° C, ve Ultrasantrifügasyon de. Frensiz maksimum hızlanma ve yavaşlama seçin. </li><li> Tamamlandığında, dikkatlice forseps kullanarak santrifüj rotor tüpleri kaldırmak. Boruların içinde oluşturulan geçişlerini bozmadan bir rafa koyun. Kısa sürede herhangi bir difüzyon en aza indirmek için degrade fraksiyon örnekleri işleyin. </li></ol></li><li> Fraksiyonu tarafından İzopiknik Ayrılmış Gradyanların DNA Alma <ol><li> Eşit ultrasantrifüjdeki tüp üst deplasman yöntemi oluşturulan geçişlerini ayıran degrade ayırmasına, yürütmek için doğru bir HPLC pompası sistemi kullanın. GKD 2 O 1 L deplasman ile dolu şişe HPLC pompasını (% 100 akış gradyan) bağlayın ve sıkı şırınga iğnesi bir 23 G 1 açık pompa boru takmak. Yeterli b ekleo koyu mavi renk vermek için GKD 2 O mavi boya romophenol. Bu degrade orta ve GKD 2 O. yerinden arasındaki arayüz görüntülenmesini kolaylaştırır </li><li> 850 | il / dk &#39;lık bir akış hızı için pompayı ayarlayın ve mavi renkli GKD 2 O şırınga iğnesi dışarı çıkan tek bir damla kadar sistem dengeye getirin. </li><li> Dikkatli bir kıskacı için, bir ultra santrifüj tüpüne düzeltmek ve uzun bir iğne bir şırınga 23 G 1, tüpün alt kısmını delmek. Tüpün üst kısmına pompa boru bağlı iğne sokarak ultra santrifüj tüpüne pompası bağlayın ve doğrudan steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine alttan damlaları toplamak. Yaklaşık 425 fraksiyon başına ul ve degrade başına 12 fraksiyonların toplam tutarında, bir fraksiyon her 30 sn toplayın. Son fraksiyon (fraksiyon 12), genellikle değiştirmesini GKD 2 O içerir ve atılmalıdır unutmayın. </li><li> Ayrışımdan sonra banaAdım 5.1.2 &#39;de belirtildiği gibi bir analitik terazi kullanılarak ayrılan tüm kısımların yoğunluğunu ölçünüz. </li><li> Birinci DNA düşük miktarda çökeltilmesi için bir taşıyıcı olarak (otoklav GKD 2 O 20 ug / ml) 1 ul glikojen ilave edilerek (425 ul civarında) her fraksiyondan DNA&#39;nın çökeltilmesi. Inversiyon iyice karıştırın. </li><li> , Polietilen glikol (PEG) çözeltisi (500 ml toplam hacim polietilen glikol 6000 150 g ve 2 GKD NaCl O 46,8 g çözülür, iki hacim (850 ul) ilave edin. Filtre, sterilize ve otoklav. PEG çözeltisi 30&#39;dur % PEG 6000 ve 1.6 M NaCl) ve on kez ters yüz edilerek tekrar karıştırılır. </li><li> (Gerekirse gece boyunca) DNA çökelmesi için en az iki saat boyunca oda sıcaklığında tüpler bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 13,000 x g&#39;de santrifüjleyin çökeltilerin. Bir görünür pelet oluşturmalıdır. </li><li> Dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve% 70 etanol 500 ul pelet yıkayın. Aynı altında santrifüjTekrar 10 dakika boyunca koşulları. </li><li> Süpernatantı dikkatlice atmak ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında pelet hava-kurutun. </li><li> GKD 2 O 30 ul kurumuş DNA pelet içinde yeniden çözülür ve tüp hafifçe vurarak karıştırın. Adım 4.3 mağazası -20 ya da -80 ° C altında örnekler, uzun süreli depolama gerekli olduğu takdirde de her degrade fraksiyonunda DNA ölçmek. </li></ol></li></ol> 6. Piro sıralamadır DNA Karakterizasyon <ol><li> 13C-etiketli DNA yaklaşık 1,720-1,735 g / ml &#39;lik bir yoğunluğa sahip iken, etiketlenmemiş doğal (12 C) DNA, 1,705 g / ml&#39; den 1,720 g / ml yoğunluk aralığı kaplar emin olun. Yerli ve çevresel numunelerden ekstre 13C-etiketli DNA hem de çeşitli gradyan fraksiyonları yayılabilir unutmayın. Işık DNA fraksiyonları ve 9-11 fraksiyonları 4-6 ile ilişkili olduğu için, ağır DNA ile ilişkili bekliyoruz. </li><li> Tek bir &quot;derlenmiş&quot; temsili kesir ac yaratmak için kilit kesirler birleştirinyoğunluk çözümlü DNA&#39;nın spesifik piklerin tahsise Cording. Alternatif olarak, bu gradyan jel elektroforez (DGGE) gibi denatüre 23, izotop oranı kütle spektrometrisi (IRMS) 22 ya da bir parmak izi yöntemi kullanarak ayrılan fraksiyonların incelemek için diğer vasıtalar, sıralamadan önce uygun fraksiyonlar seçmek için yardımcı olabilir. </li><li> Her bir gradyan derlenmiş, ağır, orta ve hafif fraksiyonlardan PCR amplifiye bakteriyel 16S rRNA gen, piro sıralamadır yapın. SIP, bu yöntem, soy tanımlanmasını ve metabolik olarak aktif bakteri türlerinin nispi bolluk kullanılması mümkündür örnekleri inkübe edildi. Aşağıdaki gibi piro gerçekleştirin: <ol><li> Titanyum reaktifleri ile bir Roche 454 FLX enstrüman kullanarak Amplikon piro gerçekleştirin. </li><li> Th ile genişletilmiş 24,25 - (- GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3 5) ve Gray519r (GTNTTACNGCGGCKGCTG -3 5) Gray28F belirlenen füzyon primer kullanılarak birleştirilmek üzere barkodlu amplikonları hazırlayıne ilgili astar Adaptörü A / B ve örnek özgü multipleks tanımlayıcıları (MID). </li><li> Dizileme kütüphanesi oluşturmak için, bir sıcak başlangıç ​​Taq polimeraz kullanılarak, 30 çevrim ile tek aşamalı bir PCR uygulanır. </li><li> Satıcılar protokolüne dayalı amplikonları sekansı, ve tarif edildiği gibi, ileri yönde (Gray28F) okur uzanır <a href="http://www.researchandtesting.com/">http://www.researchandtesting.com/</a> . </li></ol></li></ol> 7. Piro sıralamadır Veri Analizi <ol><li> Ham dizisi &quot;mikrobiyal ekoloji içine nicel anlayışlar&quot;, QIIME yazılım boru hattı 26 ile 454 piro tarafından oluşturulan okur analiz. Aşağıdaki gibi işleme uygulayın: <ol><li> Başlangıçta, process_sff.py komut ile FAŞTA, qual ve Flowgram dosyaları 454-makine-oluşturulan sff dosyasını dönüştürmek. </li><li> (Check_id_map.py göre) eşleme dosyasını doğrulamak ve çoğaltılmış biyolojik sam okur atamakples split_libraries.py komut ile. Düşük kaliteli 50 sürgülü pencere boyutu ve 25 ortalama bir kalite kesim parametresi ile biter Trim, veri kümesi kısa belirsiz dizileri (uzunluk &lt;200 bp) de ortadan kaldırır. </li><li> Denoise_wrapper.py kullanarak 454 veri denoise. </li><li> Sonra, birden OTU toplama yöntemi (pick_otus.py% 97 sekans benzerliği cut-off ile) kullanılarak yüksek kaliteli işletme taksonomik birimler (otus) içine okur küme. </li><li> Pick_rep_set.py kullanarak her OTU bir temsilci dizisini seçin. </li><li> Assign_taxonomy.py dayalı temsili dizi setine taksonomisini atamak. 0.80 ayarlamak rekor atama için en az güven ile Ribosomal Veritabanı Projesi (RDP) sınıflandırıcı kullanın. </li><li> Algoritması PyNast (align_seqs.py kullanarak Önceden hizalanmış greengenes çekirdek 16S dizilere karşı set temsilcisi dizisini hizalayın75 için minimum sekans özdeşliği yüzde dizi). </li><li> Ayrıca, identify_chimeric_seqs.py çalıştırarak fazla analiz kuruntulardan tüketmek. </li><li> Önce bir filogenetik ağaç (make_phylogeny.py) bina lanemask şablonu (filter_alignment.py) ile (filogenetik çıkarım için yararlı değil) bütün boşluk pozisyonları çıkarın. </li><li> Son olarak, her bir numune içinde bakteri Şlotip oluşumunu anlatan, make_otu_table.py ile OTU tabloları oluşturmak. Bakteriyel bolluk ve aktivitesini karşılaştırmak için ısı haritası oluşturmak için OTU tabloyu kullanın. </li><li> Gerekirse, sırasıyla örnekler içinde ve arasında alfa ve beta çeşitliliği hesaplamak. Aynı şekilde, seyrelme eğrileri (dizileme derinliği karşı çeşitliliğin grafikleri) ve mikrobiyal topluluklar arasında ilişkileri temsil Principal Koordinat Analizi (PCoA) araziler de hazırlanabilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+obligate+mutualist+Wigglesworthia+glossinidia+influences+reproduction%2C+digestion%2C+and+immunity+processes+of+its+host%2C+the+tsetse+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).</li>
<li>Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary-dependent+trans-generational+immune+priming+in+an+insect+herbivore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore.</a> Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).</li>
<li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Note%3A+Gut+bacteria+produce+components+of+a+locust+cohesion+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone.</a> J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+interactions+in+insect-microbial+symbioses%3A+Aphids+and+their+symbiotic+bacteria+Buchnera%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera.</a> Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).</li>
<li>Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+stable+isotopes+to+measure+the+metabolic+activity+of+the+human+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).</li>
<li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li>
<li>Gil, R., Latorre, A., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endosymbionts+of+insects%3A+insights+from+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics.</a> Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).</li>
<li>Brune, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrune%2C+A+%22Encyclopedia+of+Insects%22">Encyclopedia of Insects</a>. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132(2005).</li>
<li>Breznak, J. A., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microorganisms+in+the+digestion+of+lignocellulose+by+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites.</a> Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).</li>
<li>Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Census+of+the+bacterial+community+of+the+gypsy+moth+larval+midgut+by+using+culturing+and+culture-independent+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).</li>
<li>Funke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hydrolysis+of+quorum-sensing+molecules+in+the+gut+of+lepidopteran+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae.</a> Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).</li>
<li>Tang, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+and+variability+of+gut+commensal+microbiota+in+polyphagous+lepidopteran+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+identification+and+in-situ+detection+of+individual+microbial-cells+without+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation.</a> Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).</li>
<li>Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+ecology+and+evolution+-+a+ribosomal-rna+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach.</a> Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).</li>
<li>Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+acceptor-dependent+identification+of+key+anaerobic+toluene+degraders+at+a+tar-oil-contaminated+aquifer+by+Pyro-SIP%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).</li>
<li>Lu, Y. H., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+stable+isotope+probing+of+methanogenic+archaea+in+the+rice+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere.</a> Science. 309, 1088-1090 (2005).</li>
<li>Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+probing+as+a+tool+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.</a> Nature. 403, 646-649 (2000).</li>
<li>Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+probing+of+microorganisms+thriving+at+thermodynamic+limits%3A+Syntrophic+propionate+oxidation+in+flooded+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).</li>
<li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li>
<li>Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+identification+and+quantification+of+glucose+metabolism+in+seven+bacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species.</a> J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).</li>
<li>Dunford, E. A., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Stable-Isotope+Probing+%28DNA-SIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP).</a> J. Vis. Exp. (42), (2010).</li>
<li>Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation-independent+identification+of+candidate+dehalorespiring+bacteria+in+tetrachloroethylene+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).</li>
<li>Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+DNA-+and+rRNA-based+stable+isotope+probing+by+fractionation+and+quantitative+analysis+of+isopycnic+centrifugation+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients.</a> Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).</li>
<li>Ishak, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diversity+in+Solenopsis+invicta+and+Solenopsis+geminata+ant+colonies+characterized+by+16S+amplicon+454+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing.</a> Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).</li>
<li>Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li>
<li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5(2012).</li>
<li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+bacteria+of+insects%3A+nonpathogenic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li>
<li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Çoğu böceklerin bağırsak zengin ve karmaşık bir mikrobiyal topluluğu barındırır; genellikle 10 7 -10 9 prokaryotik hücrelerin çoğu durumda konağın kendi hücrelerini outnumbering, orada Köşkü. Böylece, böcek bağırsak karşılıkçılığını 27 yükümlülük altına patogenezden mikrobiyal ilişkilerin birden yönlerini temsil eden çeşitli mikrobiyal faaliyetler için bir &quot;sıcak nokta&quot;, olduğunu. Birçok çalışma böcek bağırsak mikrobiyal toplulukların şaşırtıcı bir çeşitlilik, tarif olmasına ra...

Böcek-bakteriyel sembiyotik dernekler böcek türlerine 7 çok sayıda için bilinir. Bu simbiyotik dernek, mikroorganizmalar böceklerin büyüme ve gelişmesinde önemli rol oynar. Mikroplar konakçıya böcek temel amino asitler 4 sentezi de dahil olmak üzere üretimi 1, feromon biyosentezi 3, beslenme ve sindirim ulaşılmaz gıda katkı gösterilmiştir. Gut-bakteriyel dernekleri çok çeşitli olmasına rağmen, çok az onlar böcek lehine oynamak işlevsel rolü hakkında bilinmektedir. Sadece termitlerin durumunda, lignoselüloz simbiyotik sindirim prokaryotlar, protozoa ve mantarlar tarafından yürütülen yaygın olarak 8,9 incelenmiştir. Buna zıt olarak, az kültürlü böceklerin bağırsağında pamuk yaprak kurdu yani içinde mevcut olan simbiyotik ilişkisi hakkında bilinen, Spodoptera genel nedeniyle bitki konak sıkça kayması, Ayrıca. Littoralisist böcekler ve bağırsak ilişkili bakteri toplulukları kalıcı olarak beslenme alışkanlıkları fitokimyasallar bir bolluk ile bitkileri tüketen bağlantılı yeni sorunlara maruz kalırlar. Bunun yanında lepidopteranlara olarak bağırsak ortamında, per se çünkü yüksek bağırsak pH 10 Bakterilerin büyümesi için bir sert çevre temsil eder. Özellikle S. durumunda littoralis, bu aralıkları foregut de 10.5 &#39;den, midgut ca. 9. neredeyse 7 hindgut 11&#39;inde, pH. Diğer yandan, bakteri toplum S. gut ile ilişkili littoralis basittir. Tang, Freitak, et al. 12, bu böcek ilişkili bakteri eden tek üyesi olarak 7 farklı bakteri türlerinin toplam ait 36 Şlotip en fazla rapor etmiştir. Bunun yanı sıra, herhangi bir karmaşık bir yetiştirme prosedürü laboratuarda böcek büyümesi için gereklidir. Ayrıca, bu ve böceğin kısa yaşam döngüsü çok g kolaylaştırmakenerational çalışmalar, bağırsak mikrop etkileşimleri çalışmak için ideal bir model sistem içine bu tür dönüm. PCR-tabanlı dizileme teknolojileri ile birlikte, çeşitli organizmaların (yani insan, böcek veya deniz canlıları) gut biota ile ilgili çalışmaların sayısı artmıştır. Ayrıca, sonuçlar, geçmişte olduğu gibi izolasyon ve gut barındıran bakteri yetiştirme bağımsızdır. Bakterilerin% 99&#39;u ekilebilir değildir ve bağırsaktaki hakim çevre koşullarının simülasyonu 12. zordur. PCR kullanarak, 16S rRNA gen fragmanları (bakteriler arasında yaygın olarak kullanılan bir filogenetik geninin markör) seçici olarak dizilenmiştir bağırsak bakteri topluluklarının, karışık bir DNA şablonu amplifiye ve klonlanabilir. Bu bilgi ile, kullanıcı kamu veritabanları 13,14 sekans bilgileri aldıktan sonra bakteri türlerini tespit etmek mümkün değildir. Bununla birlikte, dizileme, bakteri tanımlamak için yaklaşımlartopluluklar nedeniyle toplum içinde bireysel türlerin içsel metabolik katkısı hakkında bilgi eksikliği yetersiz kalır. Kararlı izotop (SIP) sondalama gelecek vaat eden bir kültür-free tekniktir. Bu genellikle belirli metabolik faaliyetlerle bağlantılı mikrobiyal filogenezlerini analiz çevre mikrobiyolojisi kullanılır. Bu, fosfolipid türetilen yağlı asitler, DNA ve RNA gibi mikrobik biyolojik 5, alt-tabakalar olarak istikrarlı, izotop işaretli atomuna takip ederek elde edilir. Nükleik asitler göz önüne alındığında, bu yöntemin yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü ile 6 etiketlenmemiş DNA&#39;dan 13 C-etiketli DNA ya da RNA&#39;nın ayrılması üzerine dayanır. Nedeniyle DNA etiket ve metabolik aktivite arasındaki doğrudan bağlantı için, nükleik asitlerin bir alt analiz moleküler türlerin tanımlar ve metabolik faaliyetleri ile ilgili bilgi sağlar. Ayrıca, DNA-ve SIP, piro sıralamadır kombinasyonu tarafından uygulananPilloni, von Netzer, et al. 15 ağır 13C-etiketli DNA fraksiyonunda mevcut olan bakteri türlerinin özellikle basit ve hassas bir şekilde tanımlanmalarına olanak sağlar. Şimdiye kadar, bu teknik, 16,17 aerobik ve anaerobik koşullar altında 18,19 toprakta biyokimyasal süreçlerde bakteriyel toplulukları tarif etmek için uygulanmıştır. Sindirilmeyen karbonhidrat tepki olarak insan intestinal mikrobiyota farklı filogenetik gruplar metabolik faaliyetleri tarif Reichardt, et al. 5 tarafından bildirilen gibi çevresel biliminde kullanım yanı sıra, teknik tıp bilimlerinde uygulanmıştır. Burada bağırsakta metabolik olarak aktif bakteri türlerinin DNA &#39;etiket&#39; için 13 C-glikoz kullanımı. Glukoz durumlar 20 bilinmesine rağmen, yaygın Entner-Doudoroff (ED) yolu boyunca pek çok bakteri türleri tarafından kullanılan bir şekerdir. Builgi metabolitleri ve kurulan yollar boyunca karbon kaynağı arasındaki bir bağlantı sağlayan güvenilir metabolik prob olarak 13 C-glikoz kullanımını haklı. Bilimsel Söz, başka alt-tabakalar, örneğin, 13 C-metan, 13 CO2, ya da bir 13 CO2 atmosferi altında yükseltilmiş bitki bağlı olarak, metabolik faaliyetleri gidermek için kullanılabilir. Bu noktada, bir genel böcek, yani S. bağırsak bakteri topluluğunun metabolik karakterizasyonunda uygulanan protokol mevcut littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Ayrıca, bu metod da yüksek çözünürlük ve hassasiyet ile böcek bağırsağı bakteri topluluğunun belirlenmesini sağlar, piro sıralamadır, bağlanmıştır. Ana tabaka olarak, 13 C-etiketli glikoz deneylerde kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Ayna Kaplama Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vannas Bahar Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15000-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hızlı Vakum Konsantratörü 5301</td><td>Eppendorf Almanya</td><td>5305 000.304</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Plastik havaneli</td><td>Carl Roth GmbH Co. Almanya</td><td>P986.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NanoVue spektrofotometre</td><td>GE HealthCare, İngiltere</td><td>28-9569-58&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Mastercycler pro/thermocycler</td><td>Eppendorf Almanya</td><td>6321 000.515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agagel Standart Yatay Jel Elektroforez Odası</td><td>Biometra</td><td>Durduruldu</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj (Optima L-90K)</td><td>Beckman</td><td>A20684</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj rotoru (NVT 90)</td><td>Beckman</td><td>362752</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC pompası</td><td>Agilent</td><td>1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hızlı Sızdırmazlık, Poliallomer tüp</td><td>Beckman</td><td>342412</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Transilluminatör UVstar 15&nbsp;</td><td>Biyometra</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kültürlü ve gut metabolik aktif bakterilerin tanımlanması<em&gt; spodoptera littoralis</em&gt; dna kararlı İzotop yoluyla kullanma probing<sup&gt; 13</sup&gt; c = glukoz

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Çoğu böceklerin bağırsaklar simbiyotik patojenik bakterilerin karmaşık topluluklar tarafından iskan. Bu tür mikrobiyal topluluklar içinde bu ortakçı veya mutualistik bakteri türleri tanımlamak mümkündür. İkincisi olanlar, örneğin, diğerlerinin yanı sıra, temel amino asitler 4 sentezi de dahil olmak üzere, immün yanıtı 2, feromon üretim 3, hem de beslenme artırılması, böcek üreme 1 &#39;de yardımcı böcek birden fazla fonksiyona hizmet ettiği gözlenmiştir. Nedeniyle bu derneklerin önemine, birçok çabaların bireysel üyeleri aşağı toplulukları karakterize etmek için yapılmıştır. Ancak, bu çabaların çoğu ya ekimi yöntemlerine dayalı veya nihai tanımlama için dizilmiştir 16S rRNA gen parçalarının üretimi dayanıyordu edildi. Ne yazık ki, bu yaklaşım, sadece, bağırsakta mevcut olan bakteri türleri belirlenmiştir ve hiçbir informat ResimMikroorganizmaların metabolik aktivitesi üzerinde iyon. Bir böceğin bağırsağında metabolik olarak aktif bakteri türünü karakterize etmek için, evrensel bir alt-tabaka olarak 13 C-glukoz kullanılarak in vivo (SIP) tarama ve sabit izotop kullanılır. Bu kendi özel metabolik aktivite mikrobiyal filogenilerin bağlantısını sağlayan ümit verici bir kültür-free tekniktir. Bu, DNA ve RNA 5 gibi mikrobiyal belirteçler, içine yüzeylerde istikrarlı, izotop işaretli atomları takip mümkündür. DNA, etiketlenmemiş (12 ° C) ile karşılaştırıldığında etiketlenmiş DNA yoğunluğunu arttırır içine 13 ° C arasında birleşme izotopları. Sonunda, 13C-etiketli DNA ya da RNA, 12 C-etiketli olmayan benzer bir 6 ila yoğunluk gradyanlı ultra-santrifüj ile ayrılır. Ayrılmış olan bir nükleik asit isotopomers daha sonraki moleküler analizi türlerin metabolizma aktivitesi ve kimlik arasındaki bağlantıyı sağlar. Burada, bir kültürlü bir böcek (bizim model sistem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae) bağırsağında metabolik olarak aktif bakterileri tanımlamak için kullanılan bir protokol mevcut. DNA filogenetik analizi, böcek bağırsağı bakteri eden tanımlanmasında yüksek çözünürlük ve hassasiyet izin piro sıralamadır, kullanılarak yapıldı. Ana substrat olarak, 13 C-etiketli glikoz deneylerde kullanılmıştır. Substrat yapay bir diyet kullanılarak böcekler beslenmiştir.

Böcek bağırsağında bulunan metabolik olarak aktif bakteri, yeterli etiketleme elde etmek için, bir böcek, bir etiketlenmemiş hafif kolayca etiketli ağır fraksiyonunun ayrılmasını sağlamak için yeterli bir süre için, daha önce optimize 13 C açısından zengin bir alt tabakaya açık olmalıdır. Bizim durumumuzda, 13C-glükoz 1 gün (Şekil 1A) boyunca 10 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda suni diyet takviye edilmiştir. Normal glikoz (Şekil 1 B) aynı miktarda kontrol böcekle...

Spodoptera littoralis gut ile ilişkili aktif bakteriyel topluluk, piro sıralamadır bağlanmış kararlı-izotop-tarama (SIP) ile belirlenmiştir. Bu yöntemi kullanarak, toplum içinde aktif metabolik bakteri türlerinin belirlenmesi, yüksek çözünürlük ve hassasiyet ile yapıldı.

Kültürlü ve Gut metabolik Aktif Bakterilerin Tanımlanması<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; DNA Kararlı İzotop yoluyla kullanma Probing<sup&gt; 13</sup&gt; C = Glukoz

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir böceğin bağırsağındaki metabolik olarak aktif bakterileri filogenetik olarak karakterize etmek için kullanılan verimli bir metodolojiyi detaylandırmaktır. Bu, öncelikle böceğe C 13 işaretli glukoz verilerek bağırsaklarındaki metabolik olarak aktif bakterilerin DNA'sının izotopik olarak zenginleştirilmesiyle sağlanır. Bir sonraki adım, bağırsakta bulunan bakteri topluluğunun DNA'sını ekstrakte etmektir.Üçüncü adım, C 13 içeren metabolik olarak aktif türlerin DNA'sını ayırmaktır. Ardından DNA, pyro sequencing ile filogenetik olarak tanımlanır ve mevcut türler için miktarları belirlenir. Böylece, böcek bağırsağında bulunan topluluğu oluşturan metabolik olarak aktif bakteriyel türler tanımlanmış olur.Çok hücreli organizmaların bağırsağı, karmaşık organik maddelerin çözünmesini veya çözünür hale gelmesini sağlayarak, mikroorganizmaların metabolik kapasitelerinden yararlanan ve bu maddelerin nihayetinde konakçısı olan böcek için besin olarak hizmet etmesini sağlayan dahiyane bir buluştur. Sistemi anlamak için öncelikle orada kimlerin olduğunu ve ikinci olarak kimin hangi metabolik aktivitelere sahip olduğunu analiz etmemiz gerekir. Bu verilere sahip olduğumuzda, parçalayıcı mikroorganizmalar ile konakçı böcek arasındaki metabolitlerin ve bozunma ürünlerinin akışını yeniden oluşturabiliriz.Bu yöntem, mikrobiyal ekoloji alanındaki temel soruların, özellikle de bu mikropların konakçılarıyla etkileşim kurma biçimlerinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu bağlamda, bu organizmaların konakçıları için yerine getirdiği işlevlerin neler olduğu hakkında daha fazla bilgi edinebilir, bunları netleştirebilir ve tanımlayabiliriz. Ayrıca bu yöntem, genel aktif bağırsak bakterileri hakkında bilgi sağlayabilir.Glikoz takibi yapıldığı gibi, bu işlem, besin maddesinin sindirim sürecinde görev alan aktif bakterileri tanımlamak için selülozun etiketlenmesi gibi diğer karbon kaynaklarına da uygulanabilir. Yumurtaları ve Petri kaplarını, yumurtadan çıkana kadar oda sıcaklığında muhafaza edin. Ardından, yeni çıkan larvaları temiz bir plastik kutuya aktarın ve 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık olan uzun gün rejimi altında, 23 ile 25 °C sıcaklıktaki yapay diyetle yetiştirin. Birkaç gün sonra, yetiştirme kutusundaki sağlıklı 9 ila 15 adet ikinci instarda larvayı, taze C 13 glikoz içeren bireysel Petri kaplarına aktarın.Katkılı yapay diyet için, her işlem başına üçer larva içeren en az üç tekrarlı grup gereklidir. Kontrol grubunu beslemek için, pamuk gibi doğal bir besin kaynağıyla aynı miktarda doğal glikoz sağlayan bir yapay diyet kullanın. Sonraki 24 saat boyunca.Yapay diyetleri sık sık yenileyin. Büyük kalıntıları uzaklaştırmak için larvaları yumuşak pensle bir distile su havuzuna aktararak başlayın. Ardından, böcekleri anestezi altına almak ve öldürmek için yeni, temiz bir kaba aktarın.Bunları buz üzerine yerleştirin ve ardından bir soğutucuda sıcaklığı negatif beş derece Celsius'a düşürün. Daha sonra ölü böcekleri %70 etanol ile dezenfekte edin ve diseksiyon için PBS içine daldırın. Aletler de %70 etanol ile temizlenmelidir.Kütikülün sağ ve sol yanları boyunca insizyonlar yaparak başlayın. İşleme baştan başlayıp anüste bitirin. Ekzoskeletin tamamını, Malpighi tübüllerini ve yağ cismini çıkarın.Ardından, bağırsak açılmadan önce tampon çözeltiyi, diğer dokulardan ayrıştırılmış bağırsak ile değiştirin. Bilimsel soruya bağlı olarak, tüm bağırsağı veya orta bağırsak ya da arka bağırsak kesimlerini işleyin.Bağırsak dokularını PBS olmadan küçük steril bir tüpe aktarın ve dondurucuda saklayın. DNA ekstraksiyonundan önce, dokunun boyutuna bağlı olarak numuneleri bir vakum konsantratör cihazında 45 °C'de 30 ila 90 dakika boyunca kurutun. Ardından, genomik DNA'yı toprak DNA ekstraksiyon kiti kullanarak elde etmek için kurutulmuş dokuyu steril plastik bir pestle ile ezin.Ardından, elüye edilen final DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak belirleyin. Bakteriyel genel primerler 27 F ve 1, 492 R kullanılarak bir diyagnostik PCR analizi hazırlayarak, böcek bağırsağından mikrobiyal metagenomik DNA'nın başarılı bir şekilde ekstraksiyonunu doğrulayın. Teşhis için, her bir PCR ürününün beş mikrolitresini %1'lik agroz jelde, 300 volt ve 115 miliamperde yaklaşık 20 dakika boyunca yürütün.Amplikonların doğru boyutu 1.5 kilobazdır. Her bir deneysel tekrara karşılık gelen ekstrakte DNA'ları bir araya getirin. C 13 glikoz içerenleri ve içermeyenleri ayrı tutun.Her örneğin havuzuna eşit katkıda bulunmasını sağlamak için DNA konsantrasyonlarını normalize edin. Ultrasantrifüj işlemi için 500 ila 5.000 nanogram DNA'lık bir nihai konsantrasyon uygundur. Beklenen konsantrasyonu, steril 15 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüp içinde spektrofotometre ile tekrar kontrol edin.Gradyan ortamını hazırlayın. Miktarı belirlenmiş DNA'yı 4,8 mililitre sezyum klorür çözeltisi ile birleştirin. Ardından, hacmi altı mililitre gradyan tamponu ile tamamlayın.Karışımları dikkatlice 5,1 mililitrelik ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Bir şırınga ve iğne kullanarak tüpleri boyun kısımlarının tabanına kadar doldurun; pompalama yapmaktan veya hava kabarcığı oluşturmaktan kaçının. Her çalıştırmada DNA içermeyen en az bir boş gradyan bulundurun.Referans gradyanı olarak kullanmak üzere, tüp çiftleri seçin ve bunları 10 miligram toleransla dengeleyin. Her tüpe bir tüp kapama aparatı takın; tüpü ters çevirip elle orta derecede basınç uygulayarak sızdırmaz olduklarından emin olun. Sekiz kuyucuklu, dikey konuma yakın bir rotor kullanın.Rotor kuyucuklarını dikkatlice kapatın ve üretici talimatlarına göre rotoru ultrasantrifüje yerleştirin. DNA'yı vakum altında, 20 °C'de, 50.000 RPM hızında 40 saat boyunca çöktürün. Maksimum hızlanmayı ve frenlemesiz yavaşlamayı seçin.İki gün sonra, tüpleri pens yardımıyla santrifüj rotorundan dikkatlice çıkarın. Oluşan gradyanları bozmadan tüpleri bir rafa yerleştirin ve hemen işleme alın. Öncelikle, HPLC cihazını dakikada 850 µL akış hızıyla dengeleyin.Ardından ultrasantrifüj tüpünü bir klempli standa sabitleyin ve tüpün alt kısmını, bir şırıngaya bağlı 23 gauge bir inçlik iğne ile delin. Formu ve gradyanı bozmamak için tüpün üst kısmını dikkatlice bir kontrol minerali ile delin ve başarılı bir PSA hareketi sağlamak için önceden pratik yapın. Daha sonra, pompa borusuna bağlı iğneyi tüpün sıvı bulunmayan üst kısmından içeri yerleştirin ve alt kısımdan damlaları doğrudan steril 1,5 mililitrelik Micro fuge tüplerine toplayın; her fraksiyon için 425 microliter olacak şekilde her 30 saniyede bir fraksiyon toplayın.Bu örnekte, her gradyandan 12 fraksiyon toplanır. Ardından, ayrılan her fraksiyonun yoğunluğu analitik bir terazide ölçülür. 24 saat boyunca metin protokolüne başvurarak DNA geri kazanımı ve pirosekanslama işlemlerine devam edin.Ssop larvalarının diyetine 10 millimolar C 13 glukoz eklenmiştir. Kontrol grubundaki böceklerin besinlerine ise aynı miktarda normal glukoz eklenmiştir. Ardından, böcek bağırsaklarındaki bakteriyel topluluğundan DNA ekstraksiyonu gerçekleştirilmiştir.Elektroforez jelinde, üst kısımda görülen güçlü bir genomik DNA bandı, DNA ekstraksiyonunun ve tanısal PCR'ın başarılı olduğunu doğrulamıştır. Bakteriyel üniversal primerlerin kullanımı, bakteriyel DNA varlığını göstermiş olup; tür soyunu ve göreceli bolluklarını ortaya çıkarmak için temsili SIP gradyanları üzerinde doğrudan kantitatif pirosekanslama gerçekleştirilmiştir. Ortalama uzunluğu 404 OT olan toplam 120.045 yüksek kaliteli okuma elde edilmiştir.Pirosekanslama profili, işaretli örnekte kontrol grubuna kıyasla enterococcus ve panto dahil olmak üzere belirli türlerin bolluğunda bir artış olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, söz konusu bakterilerin metabolik olarak aktif olduğu düşünülmektedir ve daha detaylı incelemeyi hak etmektedirler. Dolayısıyla, bu prosedür uygulanırken, CYP analizine uygun bir kontrol grubunun dahil edilmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır.Böylece arka planın etkisi ve saç flaşındaki kontaminasyon çıkarılmış olacak; böylece ortaya çıkan veya kaybolan bakteri çeşitliliği ve bolluğunun kütlenin kendisinden kaynaklanan bir artefakt olmadığına dair güvence sağlanacaktır. Ek soruları yanıtlamak için bu prosedür veya floresan yerinde hibridizasyon gibi metodolojiler kullanılabilir ve uygulanabilir. Bu durumda, bakterilerin böceğin bağırsağı içindeki lokalizasyonu ve düzenlemesi incelenecektir.

identification-metabolically-active-bacteria-gut-generalist

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

DNA kararlı izotop problama özel substratlar kullanma yeteneğine sahip olan mikroorganizmaların aktif toplulukları tanımlamak ve karakterize etmek için bir kültür bağımsız bir yöntemdir. Ağır izotop zenginleştirilmiş substrat Asimilasyon etiketli atomların mikrobiyal biyokütle içine dahil yol açar. Yoğunluk degrade Ultrasantrifügasyon downstream moleküler analizler için işaretli DNA alır.

DNA Kararlı-İzotop (DNA-SIP) Probing

Kararlı izotop profil aracı metabolik akı gaz kromatografisi kütle spektrometrik analizi, nematod...

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

En yaygın bağırsak içeriği macroinvertebrates, görsel analizlerdir. Av organizmaların morfolojik çeşitlilik hakkında yoğun bilgi gerektiren, onlar yumuşak gövdeli yırtıcı özledim ve, nedeniyle güçlü ezme yırtıcı solungaçlarınızı de dahil olmak üzere bazı organizmalar için neredeyse imkansız. Biz macroinvertebrate için detaylı, yeni genetik yaklaşımlar diyet tanımlaması solungaçlarınızı av sağlar.

Su Macroinvertebrates kullanma gruba özel rDNA astar genetik Gut içerik analizleri için laboratuvar iletişim kuralı

Yani, yağ asitleri asimilasyon tüm molekül ve transfer tüketici doku içine yağ asidi trofik marker yaklaşım değişiklik, engel olmayan ya da küçük küçük toprak omurgasızlar yağ asidi metabolizması bilgi boşlukları tarafından. Isotopologue profil oluşturma trofik etkileşimleri disentangle için değerli bir araç olarak sağlanır.

Yağ asidi 13C profil oluşturma Isotopologue trofik karbon Transfer ve Lipid metabolizması, omurgasız tüketicilerin sağlar

Bu kağıt için döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (lamba) teknolojisini temel alan Bemisia tabaci hızlı kimlik tahlil için protokol bildirir. En az laboratuvar eğitim gerektirir ve bu nedenle, Tesis içi giriş bitki ithalat liman ve Havaalanı gibi noktalarda uygulanabilir iletişim kuralı.

Bir döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (lamba) tahlil hızlı teşhis edilmesi için kullanılan Bemisia tabaci

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Hidrokarbon bozunan bakterileri sucul habitatlardan izole etme, çoğaltma ve karakterize etme sürecini sunuyoruz. Protokol, bakteri izolasyonunu, 16S rRNA yöntemiyle tanımlamayı ve hidrokarbon bozunma potansiyellerinin test edilmesini ana hatlarıyla belirtir. Bu makale, araştırmacıların çevresel örneklerde mikrobiyal biyoçeşitliliği karakterize etmelerine ve özellikle biyoremediasyon potansiyeli olan mikropları taramalarına yardımcı olacaktır.

Sucul Habitatlardan Hidrokarbon Metabolize Edici Özelliğe Sahip Bakteri Türlerinin İzolasyonu, Çoğaltılması ve Tanımlanması

Aksenik bir böcek elde etmek için, yumurta yüzeyi sterilize edilir ve yumurtadan çıkan larva daha sonra aksenik yapraklar kullanılarak yetiştirilir. Bu yöntem, antibiyotik uygulamadan veya diğer yaprak yiyen böceklere de uygulanabilen yapay bir diyet geliştirmeden aksenik böcek preparatı için etkili bir yol sağlar.

Yaprak Böceğinin Host-Gut Mikrobiyota Etkileşim Çalışmaları için Doku Kültürlü Fidanlarla Aksenik Böceklerin Hazırlanması ve Yetiştirilmesi

Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrobiyom etkileşimlerini yönlendiren moleküler belirleyicileri incelemek için güçlü bir modeldir. C. elegans fizyolojisinin temel yönleriyle birlikte bağırsak mikrobiyom kolonizasyonunun tek hayvan seviyelerinin profilini çıkaran yüksek verimli bir boru hattı sunuyoruz.

Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması

Burada, tek tek hücreleri tanımlamak ve metabolizmalarını anlamak için orta kızılötesi fototermal-FISH (MIP-FISH) olarak da bilinen optik fototermal kızılötesi floresan yerinde hibridizasyon (OPTIR-FISH) kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, tek hücre çözünürlüğü ile hücresel metabolizmanın haritalanması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş çapta uygulanabilir.

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Keşfedin, kararlı izotop problama yöntemiyle Spodoptera littoralis bağırsağındaki metabolik olarak aktif bakterileri nasıl tanımlayacağınızı öğrenin. Bu protokol, bakteri kimliğini metabolik aktiviteyle ilişkilendirir.

Kültürlü ve Gut metabolik Aktif Bakterilerin Tanımlanması Spodoptera littoralis DNA Kararlı İzotop yoluyla kullanma Probing 13 C = Glukoz (Video) | JoVE Journal

Kültürlü ve Gut metabolik Aktif Bakterilerin Tanımlanması

Daha fazla video keşfet