İskemik Hücre Ölümü Pathways Eğitim için seks Katmanlı Nöronal Kültürleri

Bu prosedürün genel amacı, cinsiyet tabakalı hipokampal, primer ayrışmış nöron kültürleri hazırlamaktır. Prosedürün ilk adımı, cinsiyet tabakalı primer nöronal kültürler elde etmek için embriyonik 18. günde embriyoları cinsiyetlendirmek ve incelemektir. Bir sonraki adım, nöronal dokudan ilişkili nöronları hazırlamaktır.

Son adım, nöronları uygun yoğunlukta kaplamak ve deney için büyütmektir. Sonuç olarak, bu yöntem diğer protokollerle birlikte, cinsiyetin sonucun önemli bir belirleyicisi olduğu düşünülen herhangi bir çalışma için kullanılabilir. Bu yöntem, erkek ve dişi kemirgenlerin nöronal iskemiye farklı tepki verip vermediği gibi cinsiyet araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Gerekli birkaç preparat arasında, doku kültürü plakaları gibi gözden geçirilmeye değer birkaç tane vardı.

Hazırlık: Poli de lisin mililitre başına 0.1 miligrama seyreltin. Daha sonra, laminer akışlı bir doku kültürü başlığı altında, çok kuyulu kültürle muamele edilmiş steril doku kültürü plakasının her bir oyuğunun dibini cömertçe örtün, bu plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İkinci olarak, diseksiyon alanını, sayacı ve dürbünü% 70 etanol ile sildiğinizden emin olun.

Üçüncüsü, büyük bir düz tabağı buz etiketi ile doldurun ve erkek ve dişi kafalarını, beyinlerini ve su aygırı kampını ayrı tutmak için 60 milimetrelik tabakları soğuk diseksiyon solüsyonu ile doldurun. Ayrıca, iki büyük 100 milimetre kültür kabını soğuk diseksiyon tamponu ile doldurun. Dördüncüsü, iki adet 15 mililitrelik steril tüp hazırlayın.

Bu tüplerin her birine bir erkek ve diğer dişi etiketleyin, uygun hacimde diseksiyon tamponu ekleyin. E 18 embriyolarını toplarken, her yavruyu rahim boynuzlarından ve embriyonik torbadan dikkatlice çıkarmak önemlidir. Yavrular kırılgan olduğundan, embriyonik torbayı ortaya çıkarmak için her embriyo arasındaki rahim dokusunu dikkatlice kesin.

Daha sonra çuvalı küçük dar bir makasın kenarı ile yüzeyde çok dikkatli bir şekilde dilimleyin. Embriyonik sıvı ve embriyolar daha sonra embriyolara zarar vermeden açıklıktan nazikçe itilebilir. Yavruları parçalara ayırırken, bağırsakları ve karaciğer çatlağını çok nazikçe itmek için tekrarlanan süpürme hareketleriyle kavisli forseps kullanın.

Bu yavaş yavaş böbreğin mesanesini ve en önemlisi iç cinsel organları ortaya çıkarır. Fetüsün cinsiyetini belirlerken, çok kırılgan iç cinsel organları rahatsız etmemek için nazikçe incelemeniz çok önemlidir. Erkek yavrular, böbreklerin hemen altında bulunan çizgili testislerin varlığı ile tanımlanır.

Testisler böbreklerin yaklaşık üçte biri ila yarısı kadardır ve bazen mesanenin hemen üzerine oturmak için düşmüş olacaktır. Dişiler en kolay testis eksikliği ile tanımlanır. Ayrıca mesanenin üzerinde bulunan küçük rahim ve böbreklere doğru uzanan fallop tüpleri ile de tanımlanabilirler.

Daha yüksek büyütme altında, yumurtalıklar, beyinleri toplamak için fallop tüplerinin hemen altında ve bazen böbreklerin altında küçük koyu renkli organlar olarak tanımlanabilir. Kafatasını ayırdıktan sonra, cildi ve kafatasını nazikçe bir kenara itin. Daha sonra beyni, mikrocerrahi makasın tabanıyla veya kapalı açılı bir forseps ile ön beyinden beyin sapına doğru dikkatlice kepçeleyerek çok nazikçe çıkarın.

Çıkarılan beyni soğuk diseksiyon ile doldurulmuş temiz etiketli bir tabağa aktarmak için forsepsleri dikkatlice kullanın. Arabellek. Çanağı buz üzerinde tutun. Tüm beyinler hasat edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.

Bu adım, diseksiyon tamponunda biri erkek diğeri kadın dokusu için olmak üzere iki plaka tam beyin vermelidir. Hipokampusu incelemeden önce, meninksleri her yarım küreden çok dikkatli bir şekilde çıkarın. Kan damarları bakımından zengin pembemsi zardır.

Nazikçe sıkıştırın, kaldırın ve çekin. Zarın altındaki beyin dokusunu delmemeye dikkat etmesi. Sonra meninksleri beyinden uzaklaştırın.

Beyin forsepsin biraz altında yuvarlanabilir, ancak yerinde kalmalıdır. Fare beyni daha sonra beynin hangi bölgesinin kültürlendiğine ve çalışıldığına göre incelenebilir. Disseke edilmiş beyin parçalarını, diseksiyon, tampon ile doldurulmuş doğru etiketlenmiş kaba yerleştirin ve buz üzerinde tutun.

Son beyni inceledikten sonra, bunları uygun şekilde etiketlenmiş 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Sonra, dokuyu nazikçe yıkayın. Soğuk diseksiyon tamponu ile dokular bir vakumda kaybolabilir, bu nedenle dokunun tüpün dibine çökmesine izin verin ve tüpten mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın.

Bir pipetle, çıkarılan çözeltiyi taze temiz diseksiyon tamponu ile değiştirin. Daha sonra, su aygırı campi'yi pappa ile tedavi ettikten ve nöro bazal ortama geçtikten sonra yıkama adımını tekrarlayın, en düşük hızda ayarlanmış beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak dokuyu nazikçe ayırın. Her zaman tüpün yan tarafına çıkararak kabarcık oluşturmaktan kaçının.

Sekizinci triden sonra dokunun oturmasına izin verin. Daha sonra ilişkisiz dokuya iki mililitre nöro bazal ortam ekleyin ve üç işlemi tekrarlayın. Bu işlemi 10 mililitreye kadar ekleyerek tekrarlayın.

Bazı ilişkisiz dokular kalacaktır, ancak daha fazla tasyon zayıf nöronal sağlığa neden olur. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve bunları hazırlanan plakaların üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu yavaşça döndürün ve istenen hacimde asılı hücre pipetleyin.

Bu örnekte, santimetre kare başına 150 ila 200.000 hücre kaplanmıştır. Her plakayı yüklemeden önce, hücre süspansiyonunu her zaman döndürdüğünüzden emin olun. Bir plaka doldurulduktan sonra, hücreleri dağıtmak için hafifçe döndürün ve ardından hemen inkübatöre aktarın.

Hücreleri en az 24 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Ertesi gün, ılık, tam nöro bazal besleme ortamı 37 santigrat dereceye kadar. 24 saatlik büyümeden sonra, kaplama ortamını her bir oyuktan birer birer aspire edin ve besleme ortamı ile değiştirin.

Ardından plakayı her dört ila yedi günde bir inkübatöre geri koyun. Ortamın yarısını dikkatlice taze besleme ortamıyla değiştirin, hücre kültürleri yavaş yavaş yoğunluğu kaybederken iki hafta hayatta kalabilir. DNA, her embriyonun hasat edilen dokusundan izole edildi.

Sex PCR, erkeğe özgü gen, SRY ve evrensel belirteç için primerler kullanılarak gerçekleştirildi. Myo genin. Sonuçlar, erkek primer hipokampal nöron kültürlerinde iki doku havuzunun cinsiyet özgüllüğünü doğrulamaktadır: PJ 34 ile PARP'ın farmakolojik inhibisyonunun oksijen ve glikoz yoksunluğuna karşı nöroprotektif olduğu bulunmuştur, ancak dişi embriyolarda görülmemiştir.

PARP bir nakavt farelerden hazırlanan erkek nöron kültürleri, TPM iki kanal inhibitörü ile vahşi tip erkek nöronların oksijen ve glikoz yoksunluğuna veya OGD kaynaklı hücre ölümü tedavisine karşı da korunmuştur. İki. PJ 34'e ek olarak bir PB'nin OGD iki'ye karşı başka nöroprotektif etkisi yoktu. Tek başına bir PB, vahşi tip erkeklerde OGD'ye karşı nöroprotektiftir, ancak iki.

Bir PB, erkek veya dişi PARP bir nakavt farede koruyucu değildir. Bu veriler, PARP bir aktivitesinin, TRP M iki kanalının aktivasyonu yoluyla erkek nöronlarda nöron hücre ölümünü şiddetlendirdiği, ancak dişi nöronlarda olmadığı hipotezini desteklemektedir. Bu prosedürü takiben, ek soruları cevaplamak için oksijen, glikoz yoksunluğu, western blotlama veya QPCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir.