Name: İskemik Hücre Ölümü Pathways Eğitim için seks Katmanlı Nöronal Kültürleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Öğrenin cinsiyet ayrımlı hipokampal primer dissosiye nöron kültürleri hazırlama yöntemini. Embriyonik gün 18'te embriyoları cinsiyetlendirerek iskemik hücre ölümündeki cinsiyete özgü yanıtları araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Kısmen Walter S. ve Lucienne Driskill Vakfı ve NIH R01NS058792 tarafından desteklenen çalışma.

Bu protokoldeki tüm prosedürler, hayvanların etik muamelesi ve bakımı için Ulusal Sağlık Enstitüsü yönergelerine ve onaylanmış bir IACUC hayvan kullanım protokolüne göre yürütülmüştür.
1. Diseksiyondan En Az Bir Gün Önce Yapılacak Doku Kültür Yemeklerinin, Kültür Besiyerlerinin ve Diseksiyon Aletlerinin Hazırlanması
<ol>
	<li>1 L borat tamponu hazırlayın: 3.1 g / L borik asit ve 4.75 g / L Boraks çift damıtılmış H2O'da pH'ı 8.4'e ayarlayın. Filtre-sterilize edin ve kullanana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Poli-D-lizini 0.1 mg / ml'ye seyreltin.
	<ol>
		<li>Laminer akışlı bir doku kültürü başlığının altına, çok kuyulu, kültürle muamele edilmiş, steril bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunun dibini cömertçe kaplayacak kadar seyreltilmiş poli-D-lizin yerleştirin. (İstenirse, poli-D-lizin ilavesinden önce her bir kuyucuğun dibine önceden temizlenmiş, steril, cam kapaklı fişler eklenebilir. Kapak kaymaları, poli-D-lizin ilavesinden sonra yüzebilir, bu nedenle gerekirse steril forseps ile aşağı itilmelidir.)</li>
		<li>Plakaları gece boyunca inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 L diseksiyon tamponu hazırlayın: 350 mg / L NaHCO3, 2.38 g / L HEPES, 1.44 g / LMgSO4 ve 300 mg / L BSA, Ca, Mg, sodyum piruvat veya fenol kırmızısı içermeyen 1x Hanks Dengeli Tuz Çözeltisinde. PH'ı 7.3'e ayarlayın. Filtreyle sterilize edin ve ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>500 ml kaplama ortamı hazırlayın:% 10 Fetal Sığır Serumu, her biri 100 birim / ml penisilin ve streptomisin ve fenol kırmızısı içermeyen MEM'de 2.5 mM glutamin. Filtre-sterilize edin. İhtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın. Kullanılmayan ortamları 1 ay sonra atın.</li>
	<li>500 ml besleme ortamı hazırlayın:% 2 B-27 takviyesi, her biri 100 birim / ml penisilin ve streptomisin ve fenol kırmızısı içermeyen Nörobazal'da 2.0 mM GlutaMAX (glutamin değil). Filtre-sterilize edin. İhtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın. Kalan besleme ortamlarını 1 ay sonra atın.</li>
	<li>Standart yöntemlere göre gerektiği gibi 10 ml 100 mM CaCl2, 500 mM EDTA ve 1 M NaOH hazırlayın.</li>
	<li>Cerrahi/diseksiyon aletlerini otoklavlayın ve ihtiyaç duyulana kadar steril koşullarda saklayın. Bu prosedür iki keskin ekstra ince uçlu açılı forseps, bir ince uçlu kavisli forseps, tırtıklı kavisli bir forseps, küçük bir sıçan dişli forseps, bir çift mikro cerrahi makas, bir çift ince, dar uçlu cerrahi makas, bir çift orta uçlu makas ve künt uçlu bir diseksiyon probu gerektirir. Kişisel tercihe göre ek steril aletler eklenebilir.</li>
</ol>
2. Diseksiyon Günü Yapılacak Doku Kültür Yemeklerinin, Kültür Ortamlarının, Diseksiyon Aletlerinin ve Diseksiyon Alanının Hazırlanması
<ol>
	<li>Poli-D-lizin kaplı doku kültürü plakalarını yıkayın. Laminer akışlı biyogüvenlik kabininin altında, poli-D-lizini bir vakum hattı veya pipet ile aspire edin, her kuyucuğa su ekleyin ve oda sıcaklığında ~ 5 dakika inkübe edin. Suyu aspire edin ve temiz, steril suyla değiştirin. 3x tekrarlayın.
	<ol>
		<li>Plakaların oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tezgahı ve diseksiyon kapsamını %70 etanol ile silerek diseksiyon alanını hazırlayın.
	<ol>
		<li>Büyük bir Kimwipe'ı %70 etanol ile doyurun ve otoklavlanmış diseksiyon aletlerini yerleştirin. Başka bir Kimwipe ile örtün.</li>
		<li>Büyük, düz bir tabağı buzla doldurun. Uygun sayıda 60 mm'lik kültür kabını etiketleyin ve soğuk diseksiyon solüsyonu ile doldurun. Erkek ve dişi kafaları, beyinleri ve hipokampusları ayrı tutmak için yeterli miktarda yemek hazırlayın (varsa).</li>
		<li>İki büyük 100 mm kültür kabını soğuk diseksiyon tamponu ile doldurun.</li>
		<li>Tamponsuz (kuru) ayrı bir 100 mm tabak koyun.</li>
		<li>Biyolojik tehlike atıkları için bir alan ve hayvan dokusu için başka bir alan oluşturun (kurumsal standartlara göre diseksiyondan sonra uygun şekilde imha edilmelidir).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>30 ml'lik kaplama ortamını 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın. Bu sıcak çözelti, protokolün hücre ayrışması aşamasında kullanılacaktır.</li>
	<li>24 oyuklu, poli-D-lizin kaplı, doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 1 ml kaplama ortamı yerleştirin. Daha küçük plakalar kullanılıyorsa uygun bir küçük hacim kullanın. Diseksiyon sırasında ısınmak ve CO2'ye dengelemek için kapalı plakayı% 5 CO2'de 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Papain çözeltisini hazırlayın.
	<ol>
		<li>Biri "erkek", diğeri "dişi" olmak üzere iki adet 15 ml'lik steril konik tüpü etiketleyin.</li>
		<li>Her tüpe aşağıdakileri ekleyin: 10 ml diseksiyon tamponu, 150 μl 100 mM CaCl2, 10 μl 500 mM EDTA, 10μl 1 M NaOH ve 150 U papain.</li>
		<li>Tüpü üç kez ters çevirerek nazikçe karıştırın, ardından 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın. Not: Her bir papain şişesi, mg papain başına farklı bir aktivite birimine sahip olacaktır, bu nedenle çözeltiye eklenen papain hacmi şişeden şişeye farklılık gösterecektir. Papain başlangıçta bulanık olacak, ancak papain tamamen çözüldüğünde çözelti berraklaşacaktır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. E18 Embriyolarının Toplanması, Cinsiyetlendirilmesi ve Diseksiyonu
<ol>
	<li>Hamile dişi fareyi izofluran veya diğer uygun anestezi ile uyuşturun. Fareyi derin anestezi altında dekapitasyon veya servikal çıkık ile ötenazi yapın.</li>
	<li>Hızlı çalışarak, dişinin karnını% 70 etanol ile temizleyin. İstenirse, kontaminasyon risklerini azaltmak için etanol püskürtülmeden önce karın traş edilebilir. Karın derisini sıçan dişli forseps ile kaldırın. Orta uçlu makasla karın bölgesinde büyük bir kesi yapın, cilt ve karın kaslarını kesin, iç organları açığa çıkarın.</li>
	<li>Embriyoları dikkatlice çıkarın, her bir uterus boynuzunu karından kaldırın, mümkünse herhangi bir dış dokuya temas etmesine izin vermemeye dikkat edin (kontaminasyonu önlemek için). Embriyoları içeren uterus boynuzlarını soğuk diseksiyon tuzlu su ile bir kaba yerleştirin ve buza aktarın.</li>
	<li>Her yavruyu uterus boynuzlarından ve embriyonik keseden dikkatlice çıkarın. Yavrular kırılgandır, bu nedenle bu en iyi şekilde embriyonik kesesi ortaya çıkarmak için her embriyo arasındaki rahim dokusunu keserek ve ardından küçük, dar makasın kenarı ile yüzeydeki kesesi dikkatlice dilimleyerek yapılır. Embriyonik sıvı ve yavru daha sonra embriyoya zarar vermeden açıklıktan nazikçe itilebilir.
	<ol>
		<li>Embriyonik kesedeki kesi, sıvının ve yavrunun kolayca çıkması için yeterince büyük değilse, yavru minimum kuvvetle dışarı kayana kadar kesiyi dikkatlice büyütün.</li>
		<li>Embriyoyu dışarı çıkmaya zorlamak için kesesi çok kuvvetli bir şekilde sıkmayın, çünkü bu da embriyolara zarar verebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kafayı tek bir embriyodan çıkarın. Kafayı buz üzerinde bir diseksiyon tuzlu su kabında bırakın. Embriyonun gövdesini, diseksiyon kapsamı altındaki kuru 100 mM'lik tabağa sırt üstü yerleştirin. Bir elinizde kavisli orta uçlu forsepsleri ve diğer elinizde tırtıklı kavisli forsepsleri kullanarak, arka bacakları ve ventrali, ön bacakları aşağı ve sırtı aşağı iterek yavruyu nazikçe düzleştirin.</li>
	<li>Gerekirse kuyruğu makasla çıkarın; kuyruk karın üzerinde kıvrılma eğilimindedir ve diseksiyonun önüne geçebilir.</li>
	<li>Arka bacakları serbest bırakın ve karnı, göbek adı verilen göbek kordonunun kökünde sıkıştırın. Yavaşça yukarı kaldırın. Ön bacakları serbest bırakın ve diğer elinizle ve mikro makasla, göbek deliğinin hemen üzerinde karın bölgesinde "v" yi işaret eden kraniyal küçük bir ters "v" yapın.</li>
	<li>Makası tekrar kavisli forseps ile değiştirin. Forsepsleri, nokta yukarı ve hayvandan uzak olacak şekilde ters çevirin. Hafif bir kuvvetle, kavisli forsepslerin kapalı, yuvarlatılmış kenarı ile göğüs kafesini aşağı ve sırta doğru iterken, diğer forsepslerle aşağı ve ventral itin, yavruyu ventral olarak dorsale doğru yayın. Bu yayılma hareketi karın boşluğunu açarak bağırsakları, karaciğeri ve diğer iç organları açığa çıkaracaktır.</li>
	<li>Kavisli forsepsleri kullanarak, tekrarlanan süpürme hareketlerini kullanarak bağırsakları ve karaciğeri çok nazikçe kraniyal olarak itin. Bu yavaş yavaş böbrekleri, mesaneyi ve en önemlisi iç cinsel organları ortaya çıkaracaktır.
	<ol>
		<li>Erkek yavrular, her iki tarafta böbreklerin hemen altında bulunan çizgili testislerin varlığı ile tanımlanır. Testisler böbreklerin yaklaşık 1 / 3-1 / 2'si büyüklüğündedir ve bazen mesanenin hemen üzerine oturmak için düşmüş olacaktır.</li>
		<li>Dişiler en kolay testis eksikliği ile tanımlanır, ancak mesanenin üzerinde oturan küçük rahim ve böbreklere doğru uzanan fallop tüpleri ile de tanımlanabilir. Diseksiyon kapsamındaki yüksek güç altında, yumurtalıklar, fallop tüplerinin ucunda, hemen altında ve bazen de böbreklerin altında bilateral olarak küçük, koyu renkli organlar olarak da tanımlanabilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cinsiyet belirlendikten sonra, vücudu atın ve kafayı uygun şekilde etiketlenmiş bir tabağa (erkek veya dişi) yerleştirin. Diseksiyon solüsyonunda kafaları buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Her yavru cinsiyetlendirilene kadar 3.5-3.10 adımlarını tekrarlayın. En iyi sonucu elde etmek için, her diseksiyon arasında tabağı bir Kimwipe ile silerek temizleyin; Sıvı, yavruları kaygan hale getirir ve diseksiyon için kavramayı zorlaştırır.</li>
	<li>Tüm embriyolar cinsiyetlendirildikten ve erkek ve dişi kafalar ayrıldıktan sonra, tüm erkek ve dişi kaynaklı dokuları ayrı tutmak için özel dikkat göstererek diseksiyonun geri kalanına devam edin.</li>
	Her <li>seferinde bir beyni soğuk diseksiyon tamponu ile doldurulmuş 100 mM'lik bir tabağa aktarın. Diseksiyon kapsamı altında, embriyonun gözlerini delmek ve diseksiyon için tutturmak için kavisli forsepsleri kullanın. Mikrocerrahi makası kullanarak, cildi ve kafatasını orta hattan aşağıya, kafatasının tabanından başın üstüne, burun pasajının hemen üzerine kadar bölerek sığ bir orta hat kesisi yapın.</li>
	<li>Cildi ve kafatasını iki taraflı olarak nazikçe bir kenara itin ve mikro cerrahi makasın tabanıyla veya kapalı, açılı bir forseps ile ön beyinden beyin sapına doğru dikkatlice çekerek beyni çok nazikçe çıkarın.
	<ol>
		<li>Çıkarılan beyni soğuk diseksiyon tamponu ile doldurulmuş temiz, etiketli bir kaba aktarmak için forsepsleri dikkatlice kullanın. Çanağı buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Tüm beyinler hasat edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Bu adım, diseksiyon tamponunda biri erkek diğeri kadın dokusu için olmak üzere iki plaka tam beyin vermelidir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Diseksiyon dürbününün altına temiz bir tabak yerleştirin ve diseksiyon tamponu ile doldurun. Hipokampusun diseksiyonu boyunca beyinleri nemli tutmak için yeterli miktarda çözelti dökün; Çok fazla beynin yüzmesine ve kullanımı zorlaştırmasına neden olur. İstenirse, diseksiyon kabını steril balmumu ile önceden kaplayın. Balmumu, üzerinde çalışmak için kaymaz bir yüzey sağlar ve hassas diseksiyon aletlerinin uçlarını korur; Kaplanmamış bir kabın tabanını çizmek, aletlerin keskin kenarlarını bükebilir veya köreltebilir.</li>
	<li>Diseksiyon kapsamını yüksek güç ayarına değiştirin ve odağı buna göre ayarlayın. Diseksiyon kabına her seferinde bir beyni dikkatlice aktarın. Ekstra ince uçlu forsepsleri kullanarak, her bir beyin yarım küresini ayırın ve beyin sapından sıkıştırın.</li>
	<li>Çok dikkatli bir şekilde, meninksleri her yarım küreden çıkarın. (Meninksler pembemsi bir zardır, kan damarları bakımından zengindir ve nöron kültüründe yaygın bir glial kontaminasyon kaynağıdır.)
	<ol>
		<li>Meninksleri çıkarmak için, altındaki beyin dokusunu delmemeye dikkat ederek zarı nazikçe sıkıştırın, kaldırın ve çekin.</li>
		<li>Meninksleri beyinden uzaklaştırın, beynin forsepsin altında biraz yuvarlanmasına izin verin, ancak zarın çekilebilmesi için yerinde tutun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bu noktada, tercih edilen dokuyu kullanmak için beyni daha fazla inceleyebilirsiniz. Örneğin, hipokampusu her yarım küreden inceleyin. Yan tarafı aşağı bakacak şekilde bir yarım küre yerleştirin. Hipokampusu kaplayan bir flep oluşturan büyük ventrikül boşluğunu gözlemleyin. Hilal şeklindeki hipokampus görülene kadar bu kanadı nazikçe geri çekin. Hipokampus hafifçe yükseltilmiştir ve orta beyin ile korteks arasında yer alır.</li>
	<li>İki çift keskin, ekstra ince forseps kullanarak, bir elinizle beyin yarım küresini açık tutun ve diğer elinizle hipokampusu korteksten ve beynin ortasından kesin.
	<ol>
		<li>Hipokampusu, diseksiyon tamponu ile doldurulmuş ve buz üzerinde tutulan, doğru etiketlenmiş bir tabağa (erkek veya dişi) yerleştirin.</li>
		<li>Hipokampusu kalan yarım küreden ayırın ve bu işlemi her beyinle tekrarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hipokampusu uygun şekilde etiketlenmiş 15 ml'lik konik tüplere aktarın.
	<ol>
		<li>Soğuk diseksiyon tamponu ile iki kez nazikçe yıkayın. Bu aşamada vakum emişini çok dikkatli kullanın. Hipokampus küçüktür ve geri dönüşü olmayan bir şekilde vakumda kaybolabilir. Dokunun tüpün dibine çökmesine izin vererek, bir pipetle tüpten mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın, çözeltiyi atın ve taze, temiz diseksiyon tamponu ile değiştirin.</li>
		<li>Adım 3.20.1'i tekrarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Nöronal Ayrışma
<ol>
	<li>Hipokampusu uygun şekilde etiketlenmiş, önceden ısıtılmış papain çözeltisine aktarın. 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun ve 8-10 dakika inkübe edin, her 2-3 dakikada bir karıştırmak için tüpleri hafifçe ters çevirin.</li>
	<li>Papain karışımını ve dokuyu su banyosundan çıkarın. Dokunun yerleşmesine izin verin ve ardından dokuyu tüpün dibinde bırakarak bir pipetle mümkün olduğunca çok papain solüsyonunu dikkatlice çıkarın. Dokuyu 3 kez kaplama ortamı ile yıkayın. Kaplama ortamındaki serum, papain enzimatik sindirimini söndürür. Kaplama ortamında serum kullanılmazsa tripsin inhibitörü gereklidir.</li>
	<li>Kaplama ortamını çıkarın.
	<ol>
		<li>2 ml taze nörobazal ortam ekleyin ve en düşük hızda ayarlanmış 5 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak dokuyu nazikçe ayırın.</li>
		<li>Ayrışma, 8x yukarı ve aşağı hafifçe pipetlenerek gerçekleştirilir. Çözeltiye kabarcıklar sokmamaya dikkat edin. En iyi sonuçları elde etmek için, çözeltiyi ve dokuyu pipette alın ve ardından çözeltiyi konik tüpün yan tarafına bırakın, böylece dokunun yandan aşağı ve tüpün dibine geri kaymasına izin verin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>8. öğütmeden sonra, dokunun yerleşmesine ve bulanık ortamı üstte toplamasına izin verin. Bu medya ilişkisiz hücreler içeriyor.
	<ol>
		<li>Yeni, etiketli bir tüpe aktarın.</li>
		<li>İlişkisiz dokuya 2 ml daha ekleyin.</li>
		<li>Tekrar 8x daha ezin.</li>
		<li>Bulutlu medyayı hasat edin.</li>
		<li>Bu işlemi 3-5 kez tekrarlayın. Bazı ayrışmamış dokular kalacaktır. Tüm doku ayrışana kadar tritürasyon yapmak mümkün olsa da, aşırı tritürasyon kötü nöronal sağlığa neden olur ve önerilmez.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Erkek ve dişi doku arasındaki hacimleri ve ağırlıkları eşitlemek için konik tüplere gerektiği kadar ekstra ortam ekleyin. Hücreleri dönen bir kova santrifüjünde 228 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Hücreleri 2 ml'lik taze kaplama ortamında nazikçe yeniden süspanse edin ve çözeltiyi bir ağ hücre süzgecinden temiz, etiketli, 50 ml'lik konik bir tüpe süzün.</li>
	<li>450 μl% 0.4 Tripan Mavisi'ne 50 μl hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri Tripan Mavisi içinde 2 dakika inkübe edin, hafifçe karıştırın ve bir hemositometreye 10 μl yükleyin. Tripan Mavisi boyasını almış olanlar hariç hücreleri sayın; Koyu mavi hücreler öldü ya da ölüyor.</li>
</ol>
5. Kaplama ve Kültür Bakımı
<ol>
	<li>İstenen hücre yoğunluğunu elde etmek için doku kültürü plakasının her bir oyuğuna eklenecek doğru hücre süspansiyonu hacmini hesaplayın. Nöron kültürleri hücre yoğunluğuna karşı çok hassastır ve glia ile birlikte kültürlenmedikçe veya glial şartlandırılmış ortamla beslenmedikçe orta ila yüksek yoğunlukta en iyisini yapar. Bu protokolde hücreler 150.000-200.000 hücre/cm2 oranında kaplanır.</li>
	<li>Kaplama ortamı ile önceden doldurulmuş doku kültürü plakasını inkübatörden çıkarın (yukarıdaki 2. adımda hazırlanmıştır).
	<ol>
		<li>Hücre süspansiyonunu 50 ml'lik konik tüpte hafifçe döndürün, ardından istenen hacimde hücre süspansiyonunu (yukarıda adım 5.1'de hesaplanmıştır) her bir oyuğun ortasına pipetleyin.</li>
		<li>Her oyukta eşit hücre yoğunluğunu sağlamak için pipetlemeden önce her seferinde hücre süspansiyonunu döndürerek tekrarlayın. Hücreler hızlı bir şekilde yerleşir ve dönme adımı atlanırsa hücre yoğunluğu kuyudan kuyuya değişebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Her bir oyuğa hücreler eklendikten sonra, hücreleri dağıtmak için plakayı hafifçe döndürün ve ardından çanağı hemen inkübatöre yerleştirin. Hücreleri en az 24 saat boyunca rahatsız etmeyin.</li>
	<li>Hücreleri kapladıktan en az 24 saat sonra, tam nörobazal besleme ortamını 37 ° C'ye ısıtın. Kaplama ortamını her bir oyuktan aspire edin ve besleme ortamı ile değiştirin. Nöronal stresi en aza indirmek ve hücre sağkalımını iyileştirmek için her seferinde bir kuyudan aspire edin ve değiştirin.</li>
	<li>Nöron kültürleri her 4-7 günde bir, ortamın yarısını dikkatlice çıkararak ve eşit miktarda taze ortam ekleyerek beslenmelidir. Bu koşullar altında, kültürler iki hafta boyunca korunabilir. Primer nöronal kültürlerde bir miktar hücre ölümü beklenir. Böylece kültürler olgunlaştıkça yoğunluk azalacaktır. Bu protokolde, hücre yoğunluğu in vitro olarak 10. günde yaklaşık% 30 oranında azalır.</li>
</ol>

<ol><li>Andreano, J. M., Cahill, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+on+the+neurobiology+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Sex influences on the neurobiology of learning and memory.</a> Learn Mem. 16, 248-266 (2009).</li>
<li>Arnold, A. P., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+XX+and+XY+brain+cells+intrinsically+different%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Are XX and XY brain cells intrinsically different.</a> Trends Endocrinol. Metab. 15, 6-11 (2004).</li>
<li>Cahill, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+sex+matters+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Why sex matters for neuroscience.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 477-484 (2006).</li>
<li>Jazin, E., Cahill, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+molecular+neuroscience%3A+from+fruit+flies+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sex differences in molecular neuroscience: from fruit flies to humans.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 9-17 (2010).</li>
<li>Morris, J. A., Jordan, C. L., Breedlove, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+differentiation+of+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sexual differentiation of the vertebrate nervous system.</a> Nat. Neurosci. 7, 1034-1039 (2004).</li>
<li>Lang, J. T., McCullough, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+to+ischemic+neuronal+cell+death%3A+are+sex+differences+relevant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Pathways to ischemic neuronal cell death: are sex differences relevant.</a> J. Transl. Med. 6, 33(2008).</li>
<li>Van Den Eeden, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+Parkinson%27s+disease%3A+variation+by+age%2C+gender%2C+and+race%2Fethnicity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Incidence of Parkinson's disease: variation by age, gender, and race/ethnicity.</a> Am. J. Epidemiol. 157, 1015-1022 (2003).</li>
<li>Abel, K. M., Drake, R., Goldstein, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Sex differences in schizophrenia.</a> Int. Rev. Psychiatry. 22, 417-428 (2010).</li>
<li>Vest, R. S., Pike, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender%2C+sex+steroid+hormones%2C+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Behav%22%5BJournal%5D)">Gender, sex steroid hormones, and Alzheimer's disease.</a> Horm. Behav. 63, 301-307 (2013).</li>
<li>Fernandez-Guasti, A., Fiedler, J. L., Herrera, L., Handa, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex%2C+stress%2C+and+mood+disorders%3A+at+the+intersection+of+adrenal+and+gonadal+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Sex, stress, and mood disorders: at the intersection of adrenal and gonadal hormones.</a> Horm. Metab. Res. 44, 607-618 (2012).</li>
<li>Hall, E. D., Pazara, K. E., Linseman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+postischemic+neuronal+necrosis+in+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Sex differences in postischemic neuronal necrosis in gerbils.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 11, 292-298 (1991).</li>
<li>Hawk, T., Zhang, Y. Q., Rajakumar, G., Day, A. L., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testosterone+increases+and+estradiol+decreases+middle+cerebral+artery+occlusion+lesion+size+in+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Testosterone increases and estradiol decreases middle cerebral artery occlusion lesion size in male rats.</a> Brain Res. 796, 296-298 (1998).</li>
<li>Nakano, T., Hurn, P. D., Herson, P. S., Traystman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testosterone+exacerbates+neuronal+damage+following+cardiac+arrest+and+cardiopulmonary+resuscitation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Testosterone exacerbates neuronal damage following cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in mouse.</a> Brain Res. 1357, 124-130 (2010).</li>
<li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+testosterone+on+functional+recovery+in+a+castrate+male+rat+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of testosterone on functional recovery in a castrate male rat stroke model.</a> Brain Res. 1043, 195-204 (2005).</li>
<li>Siegel, C., Turtzo, C., McCullough, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+cerebral+ischemia%3A+possible+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Sex differences in cerebral ischemia: possible molecular mechanisms.</a> J. Neurosci. Res. 88, 2765-2774 (2010).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+androgens+on+outcome+after+focal+cerebral+ischemia+in+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of androgens on outcome after focal cerebral ischemia in adult male mice.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1454-1462 (2009).</li>
<li>Yang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testosterone+increases+neurotoxicity+of+glutamate+in+vitro+and+ischemia-reperfusion+injury+in+an+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Testosterone increases neurotoxicity of glutamate in vitro and ischemia-reperfusion injury in an animal model.</a> J. Appl. Physiol. 92, 195-201 (2002).</li>
<li>Cheng, J., Alkayed, N. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+effects+of+dihydrotestosterone+on+cerebral+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Deleterious effects of dihydrotestosterone on cerebral ischemic injury.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1553-1562 (2007).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+steroid+hormones+in+early+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Endocr.+Metab.+Disord%22%5BJournal%5D)">Sex and steroid hormones in early brain injury.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 13, 173-186 (2012).</li>
<li>Renolleau, S., Fau, S., Charriaut-Marlangue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-related+differences+in+apoptotic+pathways+after+neonatal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Gender-related differences in apoptotic pathways after neonatal cerebral ischemia.</a> Neuroscientist. 14, 46-52 (2008).</li>
<li>McCarthy, M. M., Konkle, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+a+sex+difference+not+a+sex+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">When is a sex difference not a sex difference.</a> Front Neuroendocrinol. 26, 85-102 (2005).</li>
<li>Aarts, M. M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPMs+and+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">TRPMs and neuronal cell death.</a> Pflugers Arch. 451, 243-249 (2005).</li>
<li>Jiang, L. -H., Yang, W., Zou, J., Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM2+channel+properties%2C+functions+and+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">TRPM2 channel properties, functions and therapeutic potentials.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 973-988 (2010).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+neuroprotection+provided+by+inhibition+of+TRPM2+channels+following+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Sex differences in neuroprotection provided by inhibition of TRPM2 channels following experimental stroke.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2160-2168 (2011).</li>
<li>Fairbanks, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+sex+difference+in+neuronal+ischemic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the sex difference in neuronal ischemic cell death.</a> Neuroscience. 219, 183-191 (2012).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM2+channel+activation+following+in+vitro+ischemia+contributes+to+male+hippocampal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">TRPM2 channel activation following in vitro ischemia contributes to male hippocampal cell death.</a> Neurosci. Lett. 530, 41-46 (2012).</li>
<li>Bai, P., Canto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+PARP-1+and+PARP-2+enzymes+in+metabolic+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">The role of PARP-1 and PARP-2 enzymes in metabolic regulation and disease.</a> Cell Metab. 16, 290-295 (2012).</li>
<li>Blenn, C., Wyrsch, P., Bader, J., Bollhalder, M., Althaus, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29glycohydrolase+is+an+upstream+regulator+of+Ca2%2B+fluxes+in+oxidative+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose)glycohydrolase is an upstream regulator of Ca2+ fluxes in oxidative cell death.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 1455-1466 (2011).</li>
<li>Buelow, B., Song, Y., Scharenberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poly%28ADP-ribose%29+polymerase+PARP-1+is+required+for+oxidative+stress-induced+TRPM2+activation+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Poly(ADP-ribose) polymerase PARP-1 is required for oxidative stress-induced TRPM2 activation in lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 283, 24571-24583 (2008).</li>
<li>Fonfria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM2+channel+opening+in+response+to+oxidative+stress+is+dependent+on+activation+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">TRPM2 channel opening in response to oxidative stress is dependent on activation of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Br. J. Pharmacol. 143, 186-192 (2004).</li>
<li>Miller, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+TRPM2+function+by+PARP+inhibitors+protects+cells+from+oxidative+stress-induced+death%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of TRPM2 function by PARP inhibitors protects cells from oxidative stress-induced death.</a> Br. J. Pharmacol. 143, 515-516 (2004).</li>
<li>Vagnerova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28ADP-ribose%29+polymerase-1+initiated+neuronal+cell+death+pathway--do+androgens+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Poly (ADP-ribose) polymerase-1 initiated neuronal cell death pathway--do androgens matter.</a> Neuroscience. , 166-476 (2010).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+the+response+to+activation+of+the+poly+%28ADP-ribose%29+polymerase+pathway+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in the response to activation of the poly (ADP-ribose) polymerase pathway after experimental stroke.</a> Exp. Neurol. 217, 210-218 (2009).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2496-2500 (1986).</li>
<li>Dumesic, D. A., Renk, M., Kamel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+effects+of+phenol+red+on+rat+pituitary+cell+responsiveness+to+gonadotropin-releasing+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Estrogenic effects of phenol red on rat pituitary cell responsiveness to gonadotropin-releasing hormone.</a> Life Sci. 44, 397-406 (1989).</li>
<li>Ernst, M., Schmid, C., Froesch, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+mimics+biological+actions+of+estradiol%3A+enhancement+of+osteoblast+proliferation+in+vitro+and+of+type+I+collagen+gene+expression+in+bone+and+uterus+of+rats+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phenol red mimics biological actions of estradiol: enhancement of osteoblast proliferation in vitro and of type I collagen gene expression in bone and uterus of rats in vivo.</a> J. Steroid Biochem. 33, 907-914 (1989).</li>
<li>Hubert, J. F., Vincent, A., Labrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red+in+rat+anterior+pituitary+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red in rat anterior pituitary cells in culture.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 885-891 (1986).</li>
<li>Ortmann, O., Sturm, R., Knuppen, R., Emons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weak+estrogenic+activity+of+phenol+red+in+the+pituitary+gonadotroph%3A+re-evaluation+of+estrogen+and+antiestrogen+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem%22%5BJournal%5D)">Weak estrogenic activity of phenol red in the pituitary gonadotroph: re-evaluation of estrogen and antiestrogen effects.</a> J. Steroid Biochem. 35, 17-22 (1990).</li>
<li>Rajendran, K. G., Lopez, T., Parikh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+effect+of+phenol+red+in+MCF-7+cells+is+achieved+through+activation+of+estrogen+receptor+by+interacting+with+a+site+distinct+from+the+steroid+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Estrogenic effect of phenol red in MCF-7 cells is achieved through activation of estrogen receptor by interacting with a site distinct from the steroid binding site.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 142, 724-731 (1987).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Mol. Cell Endocrinol. 57, 169-178 (1988).</li>
<li>Moreno-Cuevas, J. E., Sirbasku, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+mitogenic+action.+III.+is+phenol+red+a+%22red+herring%22%3F%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Estrogen mitogenic action. III. is phenol red a "red herring"?</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 447-464 (2000).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Erkek ve dişi hipokampusların ayrı ayrı diseke edildiği, ayrıldığı ve kültürlendiği cinsiyet tabakalı birincil ilişkisiz hipokampal nöronal kültürler, nöron hücre ölümünde cinsiyete özgü hücre sinyalini araştırmak için yararlı bir araç sunar. Sinirbilimciler genellikle birincil nöronal kültürleri kullanırken, protokoller laboratuvarlar arasında özel deneysel amaçlarına ve ilgi alanlarına bağlı olarak farklılık gösterir. Birçok araştırmacı, nöronları glia ile birlikte kültürlemeyi, ya karışık kültürde ya da nöronları önce...

Memeliler, farklı özellikler ve özellikler sergileyen erkek ve dişilerle cinsel olarak dimorfiktir. Cinsiyet farklılıkları beyne kadar uzanır ve yaralanma ve hastalığa karşı nöronal duyarlılıkta belirgindir (1-5'te gözden geçirilmiştir). Örneğin, erkek beyni, inme veya kalp durmasından kaynaklanan iskemik nöronal hasara ve ardından resüsitasyona daha duyarlıdır (6'da gözden geçirilmiştir). Parkinson hastalığı (7'de gözden geçirilmiştir) ve şizofreni (8'de gözden geçirilmiştir) insan erkeklerinde kadınlardan daha yaygındır, kadın insan beyni ise Alzheimer hastalığına (9'da gözden geçirilmiştir) ve depresyon gibi duygudurum bozukluklarına (10'da gözden geçirilmiştir) daha duyarlı görünmektedir. Nöronal yaralanma ve hastalığa duyarlılık açısından cinsiyetler arasında gözlenebilir farklılıklara rağmen, mevcut tedavi paradigmalarının çoğu cinsiyeti dikkate almamaktadır ve hem erkeklerde hem de kadınlarda benzerdir. Cinsiyet farklılıkları hesaba katılır ve anlaşılırsa daha büyük başarılar elde edilebilir.
İn vivo nöronal yaralanma ve hastalık hayvan modelleri, insanlara benzer cinsel dimorfizm gösterir ve cinsiyet farklılıkları ve bu farklılıkların nöronal sağkalım ve işleve nasıl katkıda bulunduğu konusundaki anlayışımızı geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Kanıtlar, örneğin, erkek kemirgenlerin iskemik nöronal hasara dişilerden daha duyarlı olduğunu göstermiştir11-15. Bu farkın, en azından kısmen, birincil erkek cinsiyet steroid hormonu olan testosteronun ve birincil kadın cinsiyet steroid hormonu olan östrojenin moleküler sinyalizasyonuna bağlı olduğu düşünülmektedir. Gonektomize erkek ve dişi kemirgenlerle yapılan çalışmalar, testosteron ve testosteron metaboliti, dihidrotestosteronun (DHT) şiddetlendiğini ve östrojenin serebral iskemiyi takiben nöronal hasarı azalttığını ortaya koymaktadır12-14,16-18. Bununla birlikte, serebral iskemide cinsiyet farklılıkları hem yenidoğan hem de yetişkin hayvanlarda mevcuttur19,20. Yenidoğanlar, gelişim sırasında uteroda östrojen veya testosteron dalgalanmaları yaşarlar, ancak doğumdan sonra ergenliğe kadar nispeten düşük hormon seviyelerine sahiptirler (21'de gözden geçirilmiştir). Bu nedenle, birincil cinsiyet hormonunun varlığı veya yokluğu, cinsiyetten etkilenen nöronal yaralanmaya yatkınlığın tek belirleyicisi değildir. Gerçekten de, gelişim sırasında, hormon seviyeleri düşük olsa bile hücre sinyallemesinde ve iskemiye yanıtta farklılıklara neden olan cinsel dimorfizmlerin oluşması muhtemeldir.
Cinsiyet farklılıklarının seks steroid hormonunun varlığına bağlı olup olmadığına veya gelişim sırasında oluşan dimorfizmlerden kaynaklanıp kaynaklanmadığına bakılmaksızın, beyindeki erkek ve dişiler arasında hücre sinyalizasyonunda farklılıklar olduğu daha fazla çalışma ile netleşmektedir. Colorado Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Herson Laboratuvarı'nda böyle bir fark tespit ettik. Kalsiyum, sodyum ve potasyum geçirgen iyon kanalının, TRPM2'nin (22,23'te gözden geçirilmiştir), iskemik hakaretin ardından nöronal hücre ölümünü indüklediğini bulduk in vivo erkekte ama dişi farededeğil 24. İnme24'ün in vivo orta karotis arteriyel oklüzyon (MCAO) modelimizde TRPM2'nin farmakolojik inhibisyonunun veya genetik yıkımının erkekte koruyucu olduğunu, ancak dişi farede koruyucu olmadığını gösterdik.
Kullanışlılıklarına rağmen, iskemik nöronal hasarın in vivo hayvan modelleri, bazen, araştırma için nöronları spesifik olarak hedeflemenin zorluğu veya yetersizliği nedeniyle, nöronal ölümün moleküler çalışmaları için sınırlı olabilir. Bu nedenle, laboratuvarımız in vivo çalışmalarımızı tamamlamak için in vitro olarak birincil ayrılmamış kortikal veya hipokampal nöronlar kullanır. Primer ayrışmış nöron kültürleri, nöronal hasar ve hastalıkta rol oynayan hücre sinyal yolaklarını araştırmak için yararlı bir araç sunar. Kültürdeki nöronlar, glial girdi olsun ya da olmasın, sıkı bir şekilde kontrol edilen bir ortamda muhafaza edilebilir. Glia yokluğunda, kültürde gözlenen herhangi bir yanıt nöronaldir. Farmakolojik ajanlar, kan beyin bariyeri boyunca emilim endişesi olmadan kültüre uygulanabilir ve belirli bir sinyal iletim yolunun spesifik bileşenlerinin inhibisyonuna veya aktivasyonuna izin verir. Moleküler biyoloji, ilgilenilen çeşitli proteinleri aşırı ifade etmek veya parçalamak için kullanılabilir ve tek tek hücreler üzerinde elektrofizyolojik ölçümler yapılabilir, bu da in vivo model bir sistemde mümkün olmayan bir şeydir.
Herson Lab, ilk olarak kültürleri hazırlamak için kullanılan embriyoları cinsiyetlendirerek birincil ilişkisiz nöronal kültürlerin kullanışlılığını genişletir. Erkek ve dişi cinsiyet tabakalı nöron kültürleri, erkek nöronların oksijen ve glikoz yoksunluğunu takiben nöronal hücre ölümüne dişi nöronlardan daha duyarlı olduğunu açıkça göstermektedir25. Oksijen ve glukoz yoksunluğu, iskemi beyne oksijen ve glukoz mevcudiyetini azalttığı için nöronal iskeminin in vitro olarak kabul edilen bir modelidir. Ayrıca, TRPM2'nin erkek nöronlarda aktive olduğunu, ancak dişi nöronlarda aktive olmadığını, ilişkisiz, cinsiyet tabakalı nöronlarda yapılan elektrofizyolojik deneylerle gösterdik24,26. Şu anda TRPM2 aktivitesinin moleküler cinsiyete özgü düzenleyicilerini araştırıyoruz24,26. Burada, cinsiyete göre tabakalı primer embriyonik ilişkisiz hipokampal nöron kültürleri oluşturmak için protokolümüzü paylaşıyor ve tartışıyoruz ve DNA onarım enzimi PARP-1'in TRPM2'ye benzer şekilde cinsiyete özgü bir şekilde iskemik hücre ölümüne katkıda bulunduğunu öne süren bu yöntemi kullanarak temsili veriler sunuyoruz. PARP-1, oksidatif strese bağlı DNA kırılması ile aktive edilir (27,28'de gözden geçirilmiştir). DNA hasarı minimal olduğunda, PARP-1 aktivitesi hücre sağkalımını arttırır, ancak hasar aşırı olduğunda, artan PARP-1 aktivitesi hücre ölümünü şiddetlendirir. PARP-1, TRPM2 kanal28-31'in bilinen bir aktivatörü olan poli-(ADP)riboz üretir ve bazı kanıtlar, PARP-1'in oksidatif strese yanıt olarak tercihen erkek beyninde aktive edildiğini, ancak kadın beyninde aktive olmadığını göstermektedir32,33. Bu nedenle, PARP-1'in erkeklerde TRPM2'yi aktive ettiğini, ancak kadınlarda değil, oksijen ve glikoz yoksunluğuna yanıt olarak nöronal hücre ölümünü indüklediğini varsayıyoruz.

<table><tbody><tr><td>B27 Takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Boraks</td><td>Sigma</td><td>71997</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>İnvitrojen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>İnvitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı yok</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM, glutamin yok, fenol kırmızısı yok</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal, glutamin yok, fenol kırmızısı</td><td>yok Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>İnvitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin, MW 70.000-150.000</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi %0.4</td> <td>İnvitrojen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>EKİPMAN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Açılı Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 &ndash; İnce Kavisli Forseps</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Tırtıklı (Londra) Forseps</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra İnce Graefe Forseps 1 x 2 diş</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11153-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria Yaylı Makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Orta Ameliyat Makası</td><td>Roboz Cerrahi</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra İnce Mikrodiseksiyon Makası</td><td>Roboz Cerrahi</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Doku Kültürü Plakaları</td><td>Fisher</td><td>87721</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci, 40 & M Naylon Hasır</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

İskemik hücre Ölümü pathways eğitim için seks katmanlı nöronal kültürleri

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

İskemik yaralanma ve nörodejeneratif hastalığa karşı nöronal duyarlılıkta cinsiyet farklılıkları uzun süredir gözlenmektedir, ancak bu farklılıklardan sorumlu sinyal mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır. Primer ilişkisiz embriyonik nöronal kültür, iskemi veya hastalığın bir sonucu olarak hücre ölümünde rol oynayan nöronal hücre sinyalini araştırmak için basitleştirilmiş bir deneysel model sağlar; Bununla birlikte, günümüzde araştırmalarda kullanılan çoğu nöronal kültür karışık cinsiyetlidir. Araştırmacılar, nöronal yaralanma ve hastalık modellerinde karışık cinsiyet nöronal kültürlerinde seks steroid tedavisinin etkilerini test edebilir ve test edebilirler, ancak biriken kanıtlar kadın beyninin androjenlere, östrojenlere ve progesterona erkek beyninden farklı tepki verdiğini göstermektedir. Ayrıca, yenidoğan erkek ve dişi kemirgenler iskemik hasara farklı yanıt verir, erkekler serebral iskemiyi takiben dişilerden daha fazla yaralanma yaşarlar. Bu nedenle, karışık cinsiyetli nöronal kültürler deneysel sonuçları gizleyebilir ve karıştırabilir; Önemli bilgiler gözden kaçabilir. Bu nedenle, Colorado Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Herson Laboratuvarı, rutin olarak hem hipokampus hem de korteksten cinsiyete göre tabakalı primer ilişkisiz embriyonik nöronal kültürler hazırlar. Embriyolar, beyin dokusu toplanmadan önce cinsiyetlendirilir ve erkek ve dişi doku ayrı ayrı ayrılır, ayrı ayrı kaplanır ve ayrı ayrı saklanır. Bu yöntemi kullanarak, Herson Laboratuvarı, iskemik hücre ölümünde iyon kanalı TRPM2 için erkeğe özgü bir rol göstermiştir. Bu yazıda, embriyonik farelerin cinsiyetlendirilmesi ve cinsiyete göre sınıflandırılmış hipokampal primer ilişkisiz nöron kültürlerinin hazırlanması için protokolümüzü paylaşıyor ve tartışıyoruz. Bu yöntem, cinsiyete göre tabakalı kortikal kültürler hazırlamak için uyarlanabilir ve embriyo cinsiyetlendirme yöntemi, cinsiyetin sonucun önemli bir belirleyicisi olduğu düşünülen herhangi bir çalışma için diğer protokollerle birlikte kullanılabilir.

Embriyonik farelerin doğru şekilde cinsiyetlendirilmesi, cinsiyete göre ayrıştırılmış primer nöron kültürlerinin hazırlanmasında kritik bir adımdır. Erkek ve dişi hipokampların, doğru cinsiyetlendirilmiş yavrulardan ayrı olarak kültüre edildiğinden emin olmak için embriyolar cinsiyete göre ayrılmış ve korteks ile hipokamp bölgeleri hasat edilmiştir. Her bir embriyonun hasat edilen dokusundan, cinsiyet ayrımına dikkat edilerek standart prosedürlere göre genomik DNA izole edilmiştir. Erkek cinsiyete özgü SRY geni ve evrens...

Primer ilişkisiz embriyonik hipokampal nöronal kültürler, nöron ölümünde rol oynayan sinyal mekanizmalarını araştırmak için yararlıdır. Hipokampusun izolasyonu ve ayrışmasından önce embriyoların cinsiyetlendirilmesi, araştırmacının cinsiyete özgü hücre sinyallerini tanımlamasını ve araştırmasını sağlayan ayrı erkek ve dişi kültürlerin hazırlanmasına izin verir.

İskemik Hücre Ölümü Pathways Eğitim için seks Katmanlı Nöronal Kültürleri

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Bu prosedürün genel amacı, cinsiyete göre ayrıştırılmış hipokampal birincil disosiye nöron kültürleri hazırlamaktır. Prosedürün ilk adımı, cinsiyete göre ayrıştırılmış birincil nöronal kültürler elde etmek için embriyonik 18. günde embriyoların cinsiyetinin belirlenmesi ve diseke edilmesidir. Bir sonraki adım ise nöronal dokudan ilişkili nöronların hazırlanmasıdır.Son adım, nöronların uygun yoğunlukta ekilmesi ve deneyler için büyütülmesidir. Nihayetinde, bu yöntem diğer protokollerle birlikte, cinsiyetin sonuçlar üzerinde önemli bir belirleyici olduğu düşünülen her türlü çalışmada kullanılabilir. Bu yöntem, erkek ve dişi kemirgenlerin nöronal iskemiye farklı yanıtlar verip vermediği gibi, cinsiyet araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Gerekli olan çeşitli hazırlıklar arasında, doku kültürü plakaları gibi gözden geçirmeye değer birkaç nokta bulunmaktaydı.Hazırlık aşamasında poli-D-lizin 0,1 mg/mL konsantrasyonuna kadar seyreltilir. Ardından, laminer akışlı doku kültürü kabininde, çok kuyucuklu steril doku kültürü plağının her bir kuyucuğunun tabanı seyreltilmiş poli-D-lizin ile bolca kaplanır; bu plaklar 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. İkin

sex-stratified-neuronal-cultures-to-study-ischemic-cell-death-pathways

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, rinal korteks-hipokampus organotipik dilimlerinde nöronal ölümü değerlendirme tekniğini göstermektedir. Nöronal ölüm, in vivo epilepsiye benzeyen gelişen epileptik nöbetler yoluyla meydana gelir ve propidyum iyodür ve immünofloresan kullanılarak ölü hücrelerin çift boyanması yoluyla tespit edilir.

Ex Vivo Epilepsi Modelinde Hücre Ölümünü Değerlendirmek İçin Nöronal Ölüm Testi

Bu video, sitotoksik CD8+ T hücrelerinin aracılık ettiği beyin hücresi ölümünü indüklemek için ex vivo bir tekniği göstermektedir. Beyin dilimleri elde edildikten sonra, aktive edilmiş oligodendrosit yönelimli CD8 + T hücreleri, miyelin kılıfını ve oligodendrositleri hedeflemek için dilimlere aktarılır. İnkübasyon sonrası, miyelin hasarı ve nöronal ölüm, ilgilenilen bölgelerde histolojik olarak değerlendirilebilir.

Oligodendrosit Spesifik CD8 + T Hücreleri Yoluyla Nöronal Ölümü İndüklemek için Ex Vivo Bir Teknik

Sistemik hipotansiyon ile birlikte iki taraflı karotis tıkanıklığı tekrarlanabilir şiddeti ile hipokampus hasar görebilir, sıçan küresel beyin iskemi üretir. Hayvanlar üzerinde beyin hasarı tahmin modelleri ile engelli, onlar expediently kurtarmak ve ölüm oranları nispeten düşüktür.

2-Gemi Tıkanıklığı / Hipotansiyon: Küresel Beyin İskemi Rat Modeli

Biz eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek bir beyin kesit modeli geliştirdik. Bu teknik açıdan olgun beyin dokusunu oluşturur ve kısmen sağlam nöronal devreleri, hücresel etkileşimleri ve postsinaptik bölmeleri korurken, deney için gerekli olan hayvan sayısı azalır.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir protokol sunulmaktadır. Protokol membran ekler kullanarak yaygın olarak kullanılan dilim kültür yönteminin bir varyasyonudur. Bu basit, maliyet-etkin, ve yaşilişkili beyin hastalıkları arkasında nörodejenerasyon mekanizmaları çözmek için amaçlayan kısa vadeli tahliller çalıştırmak için önerilir.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Organotipik dilim kültürleri nörogelişimsel veya dejeneratif /rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, fare serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücrelerinin nörogelişimsel ölüm modelleri bir protokol açıklar. Bu yöntem nöroprotektif ilaç keşfinde araştırma yada yararlı olabilir.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Korteks kritik devlet dinamikleri göstergesi nöronal çığ, yani uzay-zamansal ölçek değişmeyen aktivite patlamaları, çalışma için sağlam bir yol. Çığ faaliyet uzun vadeli ölçümler için tam kontrollü koşullar altında düzlemsel bütünleşik çoklu-elektrod (MEA) ile sağlar kültürlü korteks yüzeysel katmanları geliştirme kendiliğinden ortaya çıkar.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Öğrenin cinsiyet ayrımlı hipokampal primer dissosiye nöron kültürleri hazırlama yöntemini. Embriyonik gün 18'te embriyoları cinsiyetlendirerek iskemik hücre ölümündeki cinsiyete özgü yanıtları araştırın.

İskemik Hücre Ölümü Pathways Eğitim için seks Katmanlı Nöronal Kültürleri

Daha fazla video keşfet