Name: İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-26T21:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Öğrenin, C57BL/6 farelerinden naif CD4+ T lenfositleri izole ederek Th17 hücrelerine nasıl farklılaştırılacağını. Bu yöntem otoimmün hastalıklardaki inflamatuar yanıtları anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Florida TL1 TR000066 ve UL1 TR000064, Ulusal Sağlık Enstitüsü, BD Biosciences reaktif hibe Veli Grant R01AI056152 bir çeşitlilik takviyesi Üniversitesi NIH / NCATS Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülleri ve Üniversite tarafından kısmen desteklenen Florida.

Tüm hayvan kullanımı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir. 1.. Karışımları ve Medya hazırlanması <ol><li> Steril PBS pH 7.3 (1 L) 0.23 g NaH 2 PO 4 1.15 g Na 2 HPO 4 9.0 g NaCl DI su ile sesini alın. Otoklav ile sterilize edin. </li><li> Hücre Kültürü Ortamı (100 mi) 89 ml RPMI 10 mi% 10 FBS 1 ml antibiyotik antimikotik (ABAM) 100 ug, 50 mM 2-merkaptoetanol (96.5 ug PBS&#39;ye 3,5 ug stok 2-merkaptoetanol) </li><li> , Steril PBS içinde FACS tampon (Floresan sokma Hücre Ayırma) (akış sitometrisi sırasında kullanılmak üzere)% 2 FBS </li><li> iTh17 Mix (numune sayısına dayanarak, tüm karışımları ve medya için gerekli hacmi belirlemek) 1.5 ug / ml anti-CD28 20 ng / ml IL-6 5 ng / mlTGF-β </li></ol> 2. Hücreler aşağıdaki koşullar altında, üç nüsha olarak Tabakta Olacak <ol><li> Anti-CD3 bağlı Plate, anti-CD28 (bu aktivasyon kontrol karışımıdır). </li><li> iTH17: levha anti-CD3 bağlı, anti-CD28, IL-6, TGF-β. </li></ol> 3. Levha-bağlı anti-CD3 (10 ug / ml) Bu plaka bağlı anti-CD3 plakaların hazırlanması önce hücreler plakalardan eklenecek zaman için en az 4 saat yapılması önerilir. <ol><li> Kuyulara 30 ul anti-CD3 ekleme yeni bir 96 oyuklu U tabanlı bir Microtest doku kültür plakasının (anti-CD3, steril PBS içerisinde seyreltilmektedir) ve kuyu yeknesak bir şekilde kaplanmasını sağlamak için levhanın kenarlarını dokunun. Bu plaka karışımları ve hücreleri ekleme zamanı gelinceye kadar buzdolabında daha sonra 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve. </li></ol> 4. Fare Diseksiyon <ol><li> Bu protokol, C57BL / 6 mikrofon kullanımına dayanıre, 3-8 aylık, ve The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) satın alınmıştır. </li><li> CO 2 boğulma kullanarak fare Kurban ve sonraki servikal dislokasyon ile ölüm onaylayın. </li><li> % 70 etanol ile fareler diseksiyon araçları ve kesi alan sterilize ve diseksiyon başlamak. </li><li> Ventral görünümünde, üretral açılış anterior olan cildi kapmak ve çene alanı ulaşana kadar makas ile ventral orta hat kesmeye başlar. Önlemleri gözyaşı veya periton duvarı zarının içine kesmek için değil almak. </li><li> Ciltte geri çekin ve çıkarılması sırasında lenf düğümlerine rahat erişim sağlamak için aşağı pin. </li><li> Toplanan lenf düğümleri ve dalak tüm forseps ile çıkarılır, ve tampon (lenf bezi ve dalak kaldırma diyagramları için, Şekil 2 ve 3&#39;e bakınız) Miltenyi Biotec satın Running autoMACS 5 ml ihtiva eden steril bir Petri tabağına yerleştirilir. <ol><li> Olan aksiller lenf düğümleri kaldırmakHer fare göğüs kaslarının arkasında aksilla (koltuk altı) yanında bulundu. </li><li> Her aksillaya yakınında bulunan bağ dokularında bulunan brakiyal lenf düğümleri kaldırın. </li><li> Her bir fare boyun bulunan yüzeysel servikal lenf düğümleri çıkarın. </li><li> 3 kan damarlarının bağlantılı olarak kalça bölgesinde bulunan kasık lenf düğümleri çıkarın. </li><li> Periton zarının yukarı ventral orta hat kesti mezenterik lenf düğümleri, erişmek için. Mezenterik lenf düğümleri bağırsakları arada tutan bağ dokusu bulunur. Genellikle 4-8 düğümleri bir dizesinde bulunan ve bir &quot;inci string&quot; olarak görünebilir. Tüm dize çekin emin olun. </li><li> Dalak, mide ve bağırsakların arkasında, karın bölgesinde yer almaktadır. Pankreas çekerek ve ayırarak çıkarın. </li></ol></li><li> 2 buzlu mikroskop slaytlar kullanılarak steril bir başlık altında organlarını eziyet. Lenf düğümleri veya dalak üzerine yerleştirinparçalanmış kadar ikinci sürgünün buzlu tarafı ile bir mikroskop lamı, ve ovmak buzlu tarafı. Tüm lenf düğümleri ve dalak toprağa kadar tekrarlayın. </li></ol> Not: Kan zor autoMACS tamponunda kalan lenf düğümleri görmek için yapacak gibi, lenf düğümleri ile başlar ve dalak ile bitirmek için tavsiye edilir. <ol start="9"><li> Tek bir hücre süspansiyonu halinde öğütülmüş organları filtre etmek için, 40 um naylon bir parça üzerinde bir kaç kez katlanır ve bir 15 ml santrifüj tüpünün üst yerleştirilmesiyle başlar. Naylon malzeme kabaca 3 x 3 inç olmalıdır </li><li> Tampon ve toprak organları Koşu autoMACS içinde 5 ml aspire bir 5 ml şırınga ve 21 G iğne kullanın. Katlanmış naylon malzeme yavaşça koyun. Iğne ile malzemeyi delinmesiyle önlemek için özen gösterin. </li></ol> Not: tek bir hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, çözelti visib hiç sahip, açık ve tutarlı bir çözüm olarak görünmelidirkatı doku le adettir. Katı maddeler, yeniden aspire kalır ve yeni bir 15 ml santrifüj tüpüne yerleştirilmiş naylon yeni bir katlanmış parça aracılığıyla dağıtım edin. <ol start="11"><li> Kullanılmadığı zaman her zaman buz üzerinde hücre tutmak. </li></ol> 5. Hücre Ayırma <ol><li> En iyi sonuçlar için, MACS CD4 + CD25 + düzenleyici T hücre izolasyon kiti, fareyi kullanarak autoMACS Pro Hücre Ayırıcı ile en az% 80 oranında saf CD4 + CD25-hücre popülasyonu edinin. CD4 + CD25-hücre popülasyonu negatif tutulması için protokol Miltenyi Biotec ile elde edilir. </li></ol> 6. Th17 Farklılaşma <ol><li> AutoMACS Pro hücre ayırıcı ile ayrıldıktan sonra CD4 + CD25-hücre popülasyonu toplayın. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak, tripan mavisi ile 1:1000 oranında seyreltilmiş hücre sayımı. </li><li> Yoğunluğu hücre sayısı tespit edildikten sonra, hücre kültür ortamı içinde 1 x 10 6 hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltin. </li><li> 4 saat sonra anti-CD3 bağlı plaka ile 96 oyuklu plakalar çıkar. </li><li> PBS içinde 200 ul anti-CD3 kaplı kuyu yıkayın. 2 kez tekrarlayın. <ol><li> Yıkamak için anti-CD3 kaplı oyuklara steril PBS içinde 200 ul ekleyin ve bir atık kabı içine PBS çıkarın. </li></ol></li><li> Üç kopya halinde oyuklara iTh17 karışımı ya da aktivasyon kontrol karışımı, 100 ul (noktası # 2 ye bakınız) eklenir. </li><li> Her bir Th17 karışımı veya aktivasyon kontrol karışımı da altına yerleştirilebilir edildiği hücre 100 ul ekle. </li><li> En az 72 saat boyunca ya da 5 güne kadar inkübe hücreleri (Th17 farklılaşma 72 saat sonra ya da 5 gün sonra elde edilebilir.) </li><li> Th17 farklılaşma, hücre içi boyama ve akış sitometrik analizi, ELISA veya qPCR ile değerlendirilebilir </li></ol> 7. Hücre Aktivasyon (Sadece gerekli Intraselüler Boyama için) <ol><li> 72 saat ve 5 gün ya da sonunda, kuluçka 96 kuyucuğu çıkarmak <ol><li> Hatırlayın Th17 differentiation, 72 saat ya da 5 gün sonra ya da elde edilebilir. </li></ol></li><li> Her bir durum (ör. aktivasyon kontrol veya iTh17) için, 24 gözlü hücre kültür plakasının bir yuvası içine üç kopya halinde olan hücrelere transfer. 96 oyuklu U tabanlı bir kültür plakasında, üç kopya halinde olmanın aksine bir durum için hücreler artık, 24 delikli kültür plakasının bir yuvası içine toplanmış edilmiştir. </li><li> 24 yuvalı hücre kültürü plakasının her bir in toplam hacmi hemen 600 ul. Iyi hücre kültür ortamı ile 1 ml her bir hacmini kaldırın. </li><li> (1 uM) ve iyonomisin, PMA (phorbol myristate asetat) (50 ng / ml) ekleyin ve BFA (Brefeldin-A) (10 ug / ml) belirtilmiş olan konsantrasyonlarda 24 yuvalı hücre kültürü plakasının her bölmeye. </li><li> 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li></ol> 8. Hücre içi boyama <ol><li> Akış sitometrik analiz için arzu edilen hücre dışı ve hücre içi işaretleri ile Leke hücreleri. O varlığı tespit etmek içinf IL-17, hücre içi boyama anti-IL-17A antikorları ile yapılır. Tavsiye edilen hücre dışı bir yüzey belirteçleri, CD4, CD8, CD25 ve içerir. <ol><li> IL-17 Hücre içi boyama BD Bioscience&#39;den içi sitokin boyama Starter Kit-Mouse kullanın. </li><li> Her numune için, hücreler topak, süpernatant kaldırmak ve 200 ul FACS tampon maddesi (PBS içinde% 2 FBS) tekrar süspansiyon hücre topağı. </li><li> Plaka 96, hücre akış sitometresi için hücreler yeniden süspansiyon haline aktarın. </li><li> 1.200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca hücreleri aşağı Spin ve süpernatant atın. </li><li> 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca 200 ul PBS FACS tampon, santrifüj ekleyin ve supernatant atın. </li><li> FACS 100 ul tampon içinde süspanse hücreler ve hücre dışı bir antikor, 100 ul (Ab) karışımı (hücre dışı Ab kanşımı FACS tampon maddesi içinde yapılır) uygulanır. Folyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 8.1.4 adımı tekrarlayın. </li><li> Adımı tekrarlayın 8.1.5 2x. </li><li> BD Cytofix / Cytoperm Tampon 100 ul hücreleri tekrar. Inkubasyonfolyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca yedi. </li><li> 1x BD Perm / Wash tampon 100 ul, 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ve supernatant atın. Tekrarlayın. </li><li> Hücre içi Ab karışımı 50 ul ekle. Folyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin (hücre içi Ab karışımı 1x BD Perm / Wash içinde yapılır). </li><li> 8.1.10 adımı tekrarlayın. </li><li> BD Boyama Tampon 200 ul hücreleri tekrar. </li><li> 200 ul BD Boyama Buffer (son hacmi 400 ul) içeren tüplere sitometri akışına süspanse hücreleri yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın örnekleri okunacak hazır olana kadar. </li></ol></li></ol> 9. Akış Sitometrik Analizi <ol><li> Gate canlı hücre popülasyonu. </li><li> Canlı hücre popülasyonu, CD4 + CD8-nüfus kapısı. </li><li> CD4 + CD8-nüfus, IL-17A + nüfus kapısı. <ol><li> Daha önceki deney sonuçlarına göre, IL-17A + nüfusunun% 100 CD25 + olacaktır. </li></ol></li></ol> * Toplam mutlak hücre sayımları örnek triplicates havuzu sonra elde edildi ** CD4 + CD25 + IL-17A + hücrelerinin mutlak sayısı, canlı kapı yüzdesi ve soy spesifik işaretleyicileri, CD4, CD25 ve IL-17A taşıyan toplam hücrelerin yüzdesi ile hücrelerin toplam sayısı çarpılarak, olarak belirlendi akış sitometresi ile tespit edilmiştir. 10. QPCR ve ELISA <ol><li> Yer hücreler 5-10 dakika süreyle 13,000 rpm&#39;de bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne ve santrifüj akış sitometrik analiz için kullanılmaz. Santrifüj sonrasında hücre peleti bulunan hücreler QPCR analiz için kullanılacaktır. QPCR analiz PTC-200 Peltier termal döngü cihazı (Biorad) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. </li><li> ELISA için santrifüj tüplerinden süpernatan toplamak. IL-17A ELISA antikor çifti TC11-18H10 (yakalama, katalog numarası 555068) kullanılarak gerçekleştirildi ve TC11-8h4 biotin (tespiti, katalog no 555067) BD Biosciences &#39;den satın alınmıştır. IL-17A ELISA standards eBioscience (katalog no: 14-8171-80) &#39;dan elde edilmiştir. </li><li> Yüzer maddelerin alınmasından sonra, (daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de RNA ekstre etme, cDNA sentezi ve QPCR veya deposu için hemen kullanılmalıdır) 175 ul lisis tamponu içinde RNA QPCR için kullanılmak üzere geri kalan hücreler tekrar süspansiyon haline getirin. <ol><li> IL-17A ve aktin (house-keeping gen) için primer dizileri için Tablo II bakın </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chen, Z., Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+and+ROR%CE%B3T%3A+transcriptional+regulation+of+Treg+and+Th17%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17.</a> International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).</li>
<li>Cua, D. J., Sherlock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-23+rather+than+interleukin-12+is+the+critical+cytokine+for+autoimmune+inflammation+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain.</a> Nature. 421, 742-748 (2003).</li>
<li>El-Behi, M., Rostami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+views+on+the+roles+of+Th17+and+Th17+cells+in+experimental+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).</li>
<li>Inaba, K., Kroide, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+memory+T+lymphocytes+isolated+from+the+mixed+leukocyte+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction.</a> Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).</li>
<li>L, I. vanovF. rutosR., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+microbiota+direct+the+differentiation+of+IL-17-producing+T-helper+cells+in+the+mucosa+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine.</a> Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).</li>
<li>Jager, L. D., Dabelic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kinase+Inhibitory+Region+of+SOCS-1+is+Sufficient+to+Inhibit+T+helper-17+Function+in+Experimental+Allergic+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis.</a> J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).</li>
<li>Kimura, A., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6%3A+regulator+of+Treg%2FTh17+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-6: regulator of Treg/Th17 balance.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+transmitted+segmented+filamentous+bacteria+segregate+with+diabetes+protection+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice.</a> PNAS. 108, 11548-11553 (2011).</li>
<li>Langrish, C. L., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).</li>
<li>Lau, K., Benitez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+1+diabetes+by+a+Lactobacillus+johnsonii+mediated+Th17+bias%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias.</a> J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).</li>
<li>Lee, Y., Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells.</a> Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).</li>
<li>Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+and+regulatory+T+cells+in+mediating+and+restraining+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation.</a> Cell. 140, 845-858 (2010).</li>
<li>O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protective+function+for+interleukin+17A+in+T+cell-mediated+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation.</a> Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).</li>
<li>Picca, C. C., Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TCR+specificity+in+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cell+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection.</a> Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).</li>
<li>Shah, K., Lee, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disregulated+balance+of+Th17+and+Th1+cells+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research & Therapy. 12, R53(2010).</li>
<li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of Multiple Sclerosis.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).</li>
<li>Stockringer, B., Veldhoen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+function+of+Th17+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and function of Th17 T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24, 179-189 (2006).</li>
<li>Zou, Y., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+production+of+interleukin-17%2Finterferon-%CE%B3+and+matrix+remodeling-associated+genes+in+experimental+Candida+albicans+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis.</a> Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).</li>
</ol>

Ilan etmek hiçbir açıklama.

Burada in vitro Th17 farklılaşma ulaşmak için protokol tanımlanmıştır. T farklılaşma insan patojenleri 13 etkin bir şekilde ortadan kaldırılması için kritik olan Th17 alt kümesi içine lenfositler gibi Th17 farklılaşma çalışma önemlidir. Tersine, IL17 üretim otoimmün hastalık ilerlemesi 13 ile ilişkilendirilmiştir. Bu, bağışıklık düzenleme ve otoimmünitenin çok sayıda farklı kemirgen modelleri için uygulanabilir olarak Th17 farklılaşma gibi bir yöntem birçok araştırma ayarları için geçerlid...

CD4 + T lenfositler (T hücreleri), bulaşıcı mikroorganizmalara karşı bağışıklık sistemi aracılı savunma önemli bir rol oynamaktadır. Tersine, T-hücreleri, aynı zamanda iyice bu tip 1 diyabet, sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit gibi otoimmün hastalıkların başlaması ve ilerlemesi ile ilişkilidir. CD4 + T lenfositleri, T hücresi reseptörü kognat antijeni / majör histokompatibilite kompleksi II (MHC II) molekülleri ile (TCR) etkileşimlerinin bir kombinasyonu ile aktif hale gelir ve B7.1/B7.2 ile CD28 reseptör etkileşimleri 15 ligandları. TCR ve CD28 uyarımı ko-stimülasyon sağlanmasına ek olarak, antijen sunan hücreler de bu şekilde belirli bir antijene T lenfosit yanıtı yönlendirme, T lenfosit farklılaşması durumunu belirleyen bir sitokin ortam sağlar. Farklı patojen / antijen sunan hücre etkileşimleri T eli odaklanmış farklı yollar aşağı lenfosit çarpık ayrı sitokin ortamları oluşturmak,başlatılması patojen ele almaktadır. Ne yazık ki, orijinal olarak, istila eden patojenlere ortadan kaldırmak için tasarlanmış T lenfosit efektör yolları, hatalı kendi dokularına 15 karşı yönlendirilebilir. Bu nedenle, her farklı CD4 + T hücre alt sitesini farklılaşması durumunun daha iyi anlaşılması patojenlerin ortadan kaldırılması ve kendini hoşgörü arasındaki dengeyi düzenleyen nasıl anlayışımız için çok önemlidir. Th1, Th2 ve indüklenebilir düzenleyici T hücresi farklılaşma yollarının ek olarak, naiv T lemfositleri aynı zamanda Th17 yolunun aşağı sitokinler tarafından tahrik edilebilir. Th1 hücreleri, hücre içi patojenlere mücadele ise, Th2 hücreleri, hücre-dışı patojenlerin uzaklaştırılması ve düzenleyici T hücreleri (Tregs) enflamatuar tepkileri 1, 16, en aza indirmek, Th17 hücre dışı bakteri ve mantar yok edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Th17 hücreler genel olarak soy spesifik transkripsiyon faktörü ve IL RORγT üretim ifadesi ile gösterilirMakrofajlar ve nötrofiller 1, 7 aktivasyonunu teşvik-17A. Th17 hücreler çeşitli otoimmün hastalıklarda rol oynadığı ve bunların ilişkili kemirgen modelleri edilmiştir. Örneğin, IL-23 (Th17 fenotipi sürdürmek için gerekli olan) olduğu gösterilmiştir, ancak IL-12, deneysel otoimmün ensefalitte (EAE) &#39;de, merkezi suçlu olduğu, MS için kemirgen hastalık modeli. Bu, daha sonra IL-17 üretiminde azalma EAE önleme 2, 6, 17 ilişkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, Th17 hücreleri arterit ve sistemik lupus eritematosus (SLE) 10, 16 dahil olmak üzere diğer oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili olmuştur. IL-23 p19 eksikliği olan - / - fareler Th17 hücrelerinin çok az sayıda olduğu gösterilmiştir ve EAE sadece gelişen karşı dirençli olan, ama aynı zamanda kollajen ile indüklenen artrit, romatoid artrit 10, 18 için bir model. Buna ek olarak, fare kıç IL-17A, nötralize edici antikor ile işleme tabier kollajen kaynaklı arterit başlangıcı da eklem hasarı 18 çözünürlüğe sahip olduğu bulunmuştur. Bu son araştırmalar aynı zamanda, Tip 1 diyabet 9, 11 ve bağırsak iltihabı 14 Th17 hücre koruyucu bir rol gösterildiği gibi otoimmün hastalık ilerlemesinde Th17 hücrelerinin rolünün, özelliği gerekmektedir unutulmamalıdır. Bu çalışmalar otoimmünitede Th17 farklılaşma önemini doğrulamaktadır. 1) tam olarak nasıl IL-6 Treg ve Th17 farklılaşma arasındaki dengeyi düzenleyen etmez ve 2) kesin mekanizmaları nelerdir: daha fazla araştırılması gereken en az iki kafa karıştırıcı soru vardır çünkü in vitro Th17 farklılaşma T hücre araştırmalarındaki gerekli bir yöntemdir IL-17 kaynaklı enflamatuvar hastalıkların arkasında? Bizim yöntem olup, C57BL / 6 fare dalak ve lenf düğümleri CD4 + CD25-T hücreleri kullanır. Şunu belirtmek önemlidir ki bir saf olmayan kullanılarak Th17 farklılaşmasını teşvik etmek mümkün olmasına rağmenNüfus, en az bir% 80 saf CD4 + CD25-T hücresi popülasyonu elde herhangi bir kirlenme ortadan endişe ve daha başarılı Th17 farklılaşma sonuçlar sağlar. Uygun Th17 farklılaşma elde etmek için, CD4 + CD25-T-hücreleri, sırasıyla, anti-CD3 ve anti-CD28, aktivasyon sinyalleri sağlamak, 1 ve 2 varlığında inkübe edilir, ve IL-6 ve TGF-β. IL-23 tek başına Th17 farklılaşma elde etmek için kullanılabilir olduğunu rapor edilmiş olmasına rağmen, bu daha sonra IL-23 Th17 hücre popülasyonunun istikrarı için gerekli olduğu gösterilmiştir, ancak, IL-6 ve TGF-β Th17 farklılaşması için gerekli olan 3, 18, ​​19. Murin çalışmalar, IL-23 reseptör IL-6 ve TGF-β 13, 18 ile uyarılmış sonra CD4 + T hücreleri üzerinde ifade olduğunu göstermiştir. Ayrıca, Th17 hücreleri başarılı olduğu sürece, IL-6 ve TGF-β 18, 19 mevcut olduğu gibi IL-23 bloke edici antikorların varlığı gelişecektir. Bu nedenle, bu Th17 farklılaşma protokol atabaşarıyla Th17 farklılaşma ikna etmek için uygun koşullar Ides. Otoimmün hastalıklar 13 hedefleyen daha iyi terapötik maddelerin geliştirilmesi için fırsat sunmaktadır Th17 farklılaşması ve IL-17 üretimini altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması geliştirilmesi.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>Steril Poliester Petri Kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>autoMACS Çalıştırma Tamponu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Premium Mikroskop Slaytları, Buzlu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td>3" x 1"1 mm</td></tr><tr><td>5 ml 21G1 Lateks İçermeyen Şırınga ve İğne</td><td>BD Biosciences</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 ml Santrifüj Tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Naylon 40 mikron</td><td>Miami Su Ürünleri</td><td>Naylonu 40/26</td><td></td></tr><tr><td>Microtest doku kültürü plakası 96 kuyu U alt </td><td>BD Biosciences</td><td>35-3077</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 24 kuyulu hücre kültürü plakaları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CL3524</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tüpleri 1.5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış NA/LE Hamster Anti-Fare CD3e</td><td>BD Biosciences</td><td>553057</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış NA/LE Hamster Anti-Fare CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553294</td><td></td></tr><tr><td>Fare IL-6 Rekombinant Protein</td><td>eBioscience</td><td>14-8061-62</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta</td><td>R& D Sistemleri</td><td>240-B-002</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi 0.4</td>% <td>Sigma-Aldrich</td><td>66H2364</td><td></td></tr><tr><td>Pac Mavi Sıçan Anti-Fare CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>558107</td><td></td></tr><tr><td>APC Sıçan Anti-Fare CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>553035</td><td></td></tr><tr><td>PE Konjuge Anti-fare CD25</td><td>eBioscience</td><td>E01155-516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Sıçan Anti-fare IL-17</td><td>BD Biosciences</td><td>560820</td><td></td></tr><tr><td>Hücre İçi Sitokin Boyama Başlangıç Kiti-Fare</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2041AK (559311)</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD4+CD25+ düzenleyici T hücre izolasyon kiti, fare</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>ABAM </td><td>Cellgro</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning, Cellgro</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>B 2-Mercapt&#8211; thanol</td><td>MP Biyomedikal</td><td>194834</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat 13-Asetat (PMA)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>İyonomisin Kalsiyum Tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909-1ML</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td> <td>MP Biyomedikal</td><td>159027</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Yakalama mAb </td><td>BD Biosciences</td><td>555068</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Algılama mAb </td><td>BD Biosciences</td><td>555067</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Standardı</td><td>eBioscience</td><td>14-8171-80</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 ELISA Kiti</td><td>BD Biosciences</td><td>555148</td><td></td></tr><tr><td>TMB Substrat Reaktif Seti </td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>autoMACS Pro Hücre Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT + Santrifüj</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Napco serisi 8000 WJ CO2 İnkübatör</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTC-200 Peltier Termal Döngüleyici</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İzolasyon ve naif cd4 t lenfositler th17 farklılaşma

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 hücreleri 17 (IL-17), interlökin üretmek için tespit edilmiştir T hücrelerinin bir alt kümesi ayrı olan ve Th1, Th2 ve düzenleyici T hücreleri dahil olmak üzere, diğer T hücre alt ikinci fonksiyon farklıdır. Th17 hücreler çok oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili çok istekli inflamatuar immün cevapların merkezi bir suçlu olarak ortaya çıkmıştır. Bu yöntemde biz C57BL / 6 farelerinin dalak ve lenf düğümleri T lenfositleri arındırmak ve kontrol ve Th17 uyaran ortamlarda saflaştırılmış CD4 + T hücrelerini teşvik eder. Th17 uyaran ortam anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları, IL-6 ve TGF-β varlığında uyarımı içerir. En az 72 saat süre ile inkübe edildikten sonra ve 37 ° C&#39;de en fazla beş gün boyunca, hücreler daha sonra sitometrisi, QPCR, ELISA ve akış boyunca IL-17 üretmek için yeteneği açısından analiz edilir. Th17 farklılaşmış CD4 + CD25-T hücreleri daha Th17 hücreleri otoimmün ve ev sahibi de başlangıcı ve ilerlemesinde oynadığı rolü aydınlatmak için kullanılabilirfense. Ayrıca, farklı kemirgen nakavt / hastalık modellerinde CD4 + CD25-lenfosit Th17 farklılaşma hücre kaderi plastisite anlamamıza katkıda bulunabilir.

Bu Th17 farklılaşma protokol dalak kaldırılması ve aksiller, brakiyal, mezenterik, servikal ve kasık lenf düğümleri ile başlar. Her yerlerinin bir gösterimi, Şekil 2 ve 3 de bulunabilir. Şekiller 1 ve 5 de bu protokolde tarif edilen yöntemlere görsel bir gösterimini sağlar. Bu Th17 protokol CD4 + CD25-T lenfosit nüfus farklılaşma üzerinde duruluyor. Bu autoMACS Pro Hücre ayırma havuza alınan toplam lenf nodu ve dalak <strong...

Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Bu prosedürün genel amacı, naif CD4 pozitif T lenfositlerinden Th17 hücrelerini farklılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle yetişkin bir C57BL/6 faresinden lenf düğümleri ve dalağın hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, tek hücre süspansiyonu elde etmek için dokular öğütülür.Ardından CD4 pozitif CD25 negatif T hücreleri izole edilir ve TH17 indükleyen veya aktivasyon kontrol koşulları altında kültüre edilir. Son aşamada, IL17A ekspresyonunu değerlendirmek için qPCR, ELISA ve akış sitometrisi kullanılabilir. Böylece bu yöntem, C57BL/6 farelerde CD4 T lenfositlerinin TH17 hücrelerine farklılaşmasına dair bilgi sağlayabilir.Bu yöntem diğer fare modellerine de uygulanabilir. Lenf düğümleri çok küçük olduğundan ve bu durum diseksiyon basamaklarını zorlaştırdığından, bu yöntemin gösterilmesi kritik önem taşır. Bu yöntemin doğrudan görselleştirilmesi olmadan, hücreleri eklemeden en az dört saat önce, yeni bir 96 kuyucuklu UBO mikro test doku kültürü plağının kuyucuklarını steril PBS içinde seyreltilmiş 30 microliters anti CD three ile kaplayın; kuyucukların homojen şekilde kaplandığından emin olmak için plağın kenarlarına hafifçe vurun ve ardından plağı 37 degrees Celsius'ta inkü

isolation-and-th17-differentiation-of-nave-cd4-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu prosedür, tespiti ve izolasyonu stimülasyon üzerine IL-17 aktif salgılar fare Th17 lökositlerin açıklamaktadır.

Canlı Fare IL-17 salgılayan T Hücreler Algılama ve İzolasyonu

Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

Naif CD4+ T hücreleri, aktivasyon sırasındaki ortama bağlı olarak çeşitli alt kümelere polarize olur.  Naif CD4 + T hücrelerinin çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşması, T hücresi reseptör uyaranlarının ve spesifik sitokin sinyallerinin eklenmesiyle in vitro olarak elde edilebilir.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Burada, yakın zamanda gösterdiğimiz gibi, ekstratimik bir αβ T hücresi progenitörü olan periferik Vδ1+CD4+ T hücrelerinin kıt T hücresi varlığının izolasyonu ve klonlanması için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, bu hücrelerin ex vivo kültürde kantitatif olarak izole edilmesine, klonlanmasına ve verimli bir şekilde genişletilmesine izin verir.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

Bu protokol, naif CD4+ T hücrelerinin in vitro olarak patojenik Th17 hücrelerine farklılaşmasını tanımlar. Spesifik olarak, çok parametreli akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımla birleştirildiğinde, bu farklılaşma yöntemi kullanılarak saf CD4+ T hücrelerinden %90 saflıkta patojenik Th4 hücreleri elde edilebilir.

Farede Naif CD4+ T Hücrelerinin Patojenik Th17 Hücrelerine İn Vitro Farklılaşması

Th17 farklılaşmasının incelenmesinde gen düzenleme için etkili bir alternatif sağlayan, Cas9 transgenik farelerden alınan birincil T hücrelerine kılavuz RNA'nın retroviral transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da...

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Fare genital lenfosit yalıtmak için verimli bir şekilde tarif edilmiştir. Bu yöntem verimli izolasyonu sağlamak için enzim sindirim ve Percoll degrade ayrılık yararlanır. Bu teknik, diğer tür kullanım için de...

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz...

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Palatin bademcikler B ve T lenfositleri açısından zengin bir kaynaktır. Burada, B ve T lenfositlerini insan palatin bademciklerinden izole etmek için kolay, verimli ve hızlı bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem, bademcik iltihabı olarak bilinen bademcik iltihabının viral etiyolojisi üzerine yapılan çalışmalar için özel olarak uyarlanmıştır.

İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Öğrenin, C57BL/6 farelerinden naif CD4+ T lenfositleri izole ederek Th17 hücrelerine nasıl farklılaştırılacağını. Bu yöntem otoimmün hastalıklardaki inflamatuar yanıtları anlamak için kritik öneme sahiptir.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Daha fazla video keşfet