Hücresel Dielektrik Spektroskopisi kullanarak İdiopatik Skolyoz Prognostik Tahmininde Hücre-tabanlı Deney Protokolü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücresel dielektrik spektroskopi kullanarak PBM C'nin GPCR R aktivasyonuna yanıtını tarayarak hastaların fonksiyonel gruplamasına göre idiyopatik skolyozun prognozunu tahmin etmektir. Bu, hücre sayısını artırmak için fito hemaglutinin veya PHA varlığında pbmc'nin kültürlenmesiyle elde edilir. Hücre genişlemesi, eğimli bir pozisyonda tutulan bir tüp içinde tamamlanır.

İkinci adım olarak, hücreler GI protein aktivitesini artıran veya azaltan OSTEOPONTIN veya OPN ile muamele edilir. Tedavi sonrası hastaya bağlı olarak, hücre süspansiyonu mikroplakaya aktarılır. Daha sonra, ortaya çıkan empedans değişikliklerini belirlemek için hücreler GI veya GS GPCR agonistleri ile uyarılır.

Sonuçlar, tüm kuyucuklar için kinetik yanıtlar sağlar ve entegre yanıtlar daha sonra empedans değişikliklerine dayalı olarak ölçülür. Bu tekniğin anlamı, basit teşhisin çok ötesindedir. Böylece ilk kez, skolyoz geliştirme riski taşıyan semptomatik hastaları erken bir aşamada tespit edebiliyoruz ve şimdi kimlerde skolyoz gelişeceğini veya hangi aşamada olduklarını bilerek, onları tedavi etmek için yeni tedaviler sağlayabiliriz.

Bu tekniğin x-ışınına maruz kalma gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu tekniğin covid ölçmeye gerek kalmadan ve sağlık riski olmadan progno osteopati skolyozunu tahmin etmeye izin vermesidir. En son şey, şimdi teknik, araştırma asistanımız Nita Franco, 37 santigrat derece su banyosunda periferik kan mononükleer hücrelerinin donmuş alikotunun çözülmesi olacak. Steril bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 15 mililitre tam ortam ve santrifüj içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreler süpernatanı aspire eder. Ardından, hücre peletini bir mililitre PHA ortamında nazikçe askıya alın, aynı ortamla hacmi 20 mililitreye tamamlayın, havanın girmesine izin vermek için tüpü gevşek bir şekilde kapatın. Hareketsiz lenfositlerin hızla çoğalan lenfoblastlara dönüşmesine izin vermek için tüpü gece boyunca 37 santigrat derecede bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin.

Kapakları tamamen sıkın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı aspirasyon ile çıkarın. Hücre peletini bir mililitre tam ortamda nazikçe süspanse edin.

Aynı ortamla hacmi 20 mililitreye kadar tamamlayın ve hücre sayılarını genişletmek için tüpü gece boyunca gevşek bir şekilde kapatın. 10 mililitre RPMI 1640 ile iki yıkamadan sonra, hücre peletini 600 mikrolitre RPMI 1640'ta nazikçe yeniden süspanse edin. Otomatik bir hücre sayacı ve canlılık analizörü kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığını ölçün.

Ardından, 20 mikrolitre başına 1,5 kat 10 ila beşinci hücre hücre konsantrasyonuna ayarlamak için uygun bir RPMI 1640 hacmi ekleyin. Süspansiyonun 100 mikrolitresini iki steril 1.5 mililitre eend orph tüpüne aktarın. Bir tüpte rekombinant osteopontini, mililitre başına 0.5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin.

İkinci tüpe eşit hacimde PBS ekleyin. 100 mikrolitrelik steril bir pipet seti kullanarak iki kez pipetleyerek her koşulu nazikçe karıştırın. Daha sonra, 96 Kuyulu bir plakanın her bir kuyucuğuna beş mikrolitre RPMI 1640 ekleyin, hücreleri tüpten mikroplakaya aktarmak için hava kabarcıklarını gidermek için plakayı 200 GS'de üç dakika santrifüjleyin.

Hücrelerin düzgün bir şekilde askıya alınmasını sağlamak için bir kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Tohum: Oyuk başına 40 mikrolitre hücre süspansiyonu, tedavi edilmemiş hücreler için dörtlü kopya halinde ve ROPN veya PBS ile muamele edilmiş hücreler için çift kopya halinde. Hücrelerin dinlenmesini ve kuyu dibine eşit şekilde yerleşmesini sağlamak için hücre plakasını steril davlumbazın altında beş dakika bırakın.

OPN kültürünün etkisini optimize etmek için, bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede 18 saat boyunca hücreler, kültürleri oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika dengeler. Bu arada, RPMI 1640'ta bir mililitre 100 mikromolar somatostatin ve izoproterenol hazırlayın. Uygun kuyucuklara 20 mikrolitre dağıtarak bileşik plakayı doldurun.

Bileşik plakayı sertleştirilebilir bir conta ile örtün. Plakayı, pipet uçlarını ve bileşik plakayı CDS tabanlı sisteme yükleyin. CDS tabanlı enstrüman yazılımında plakayı adlandırın.

Protokol listesine gidin ve protokolü başlatmak için uygun protokolü seçin. Başlat'a tıklayın. Entegre akışkan sistemi, bileşikleri aynı anda tüm kuyucuklara ekler.

CDS tabanlı sistem, bileşik baskı hücre canlılığı, tüm numuneler arasında% 86 ve 96 aralığında tutarlı değerlerle karşılaştırılabilir olduktan sonra 15 dakika boyunca verileri otomatik olarak toplar. Buna karşılık, hücre sayılarında yüksek farklılıklar kaydedildi. 32 numuneden kullanılan iki numunede yetersiz sayıda hücre vardı ve sınıflandırılmamıştı. Bu örnek, GI ve GI sinyalizasyonu arasındaki dengesizlik derecesine göre fonksiyonel sınıflandırmayı göstermektedir.

GI stimülasyonuna yanıt olarak OPN etkisinin değerlendirilmesi, OPN'nin 353 ve 371 numaralı hastalarda yanıtı artırdığını ortaya koymuştur. Buna karşılık, ROPN tedavisini takiben yanıt 345 ve 382 numaralı hastalarda% 50'den fazla ve 370 numaralı hastada% 50'den az azalmıştır. Sınıflandırma kriterlerimize göre, FG 1'de 353 ve 371 numaralı hastaları, FG 1'de 300 ve FG iki'de 382 ve FG 370'i kategorize edebildik.

Paralel olarak, tüm hastalar GI protein stimülasyonuna yanıtları açısından tarandı ve kontrol denekleriyle karşılaştırıldı. Beklendiği gibi, tüm hastalar kontrol deneklerinden daha az duyarlıydı. Aynı fonksiyonel grupta sınıflandırılan hastalar, maksimum yanıtın benzer seviyelerini sergiledi.

San Justine Hastanesi'ndeki özel kliniğimizde düzenli olarak takip edilen geniş bir SK hasta kohortunun sınıflandırılması, üç fonksiyonel grubun benzer şekilde dağıldığını ortaya koymuştur. Orta dereceli vakalar arasında, FG iki ciddi vakalar arasında baskındı. Bu videoyu bekledikten sonra, hücresel dielektrik spektroskopi kullanarak hastayı iki, üç fonksiyonel gruba nasıl sınıflandıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.