Name: Isı Kaynaklı Antijen Alımı: Yetişkin Hipokampal Nörojenez Sırasında Progenitör Hücre Tiplerini Tespit Etmek ve Tanımlamak İçin Etkili Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Keşfedin ısı kaynaklı antijen alımı yöntemiyle yetişkin hipokampal nörojenez sırasında progenitör hücre tiplerini tespit etmeyi. Bu teknik, fare dokusunda nöral kök hücreleri görselleştirmek için etkili bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Metodoloji ilk olarak Dr. Hongjun Song'un Johns Hopkins Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalı Hücre Mühendisliği Enstitüsü'ndeki laboratuvarında geliştirilmiştir. Bu çalışma NIMH (R00MH090115), NARSAD, Kardeşlik Kartalları Düzeni Mayo Kanser Araştırma Fonu ve Mayo vakfından M.H.J. ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı, Eğitim, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (A3014385) tarafından finanse edilen ve W.R.K.'ye verilen bir başlangıç paketidir.

1. Pre-immünohistokimya: Perfüzyon ve Histoloji
<ol>
	<li>Fareler için uyarlanmış genel bir transkardiyal protokole göre fareleri perfüze edin ve beyinleri %4 paraformaldehite (PFA) çıkarın9.</li>
	<li>Beyni gece boyunca 4 °C'de PFA'da bırakın (örneğin, PFA ile doldurulmuş 10 ml'lik konik bir tüp). Tam fiksasyon için PFA'da en az 12-24 saat, en fazla 36 saat tutun. Gece boyunca fiksasyondan sonra, PFA'yı konik tüpten boşaltın, ancak beyinleri içeride bırakın. % 30 sükrozu tüpe dökün ve kalan PFA'yı çıkarmak için beyinleri 5 saniye boyunca kısa bir süre yıkayın. Son olarak, beyinleri tekrar %30 sükroz ile doldurun. Beyinler tüpün dibine batana kadar beyinleri 4 ° C'de sakarozda tutun.</li>
	<li>Bir mikrotom üzerinde 40 μm beyin bölümleri kesin. Dentat girusun başından sonuna kadar bölümleri toplamaya başlamak için bir fare beyin atlasına danışın. İmmünohistokimya için hazır olana kadar bölümleri antifriz solüsyonunda (basit bir tarif, 500 ml 0.1 M PBS ve 300 ml etilen glikol içinde 300 g sükrozdur) koruyun.</li>
	<li>Kesilen dokuyu, dokuya güçlü bir şekilde yapışması için özel olarak tasarlanmış mikroskop slaytlarına monte edin. Bu slaytlar kaynama aşamasında dokuya güçlü bir tutuş sağlar. Mendili monte ettikten sonra, lütfen slaytı 10 dakika veya tamamen kuruyana kadar kurumaya bırakın. Slayt, alt kenarı bir kağıt havlu üzerinde olacak şekilde dikey bir yüzeye yaslanırsa kurutma hızlandırılabilir. Birden fazla sürgü monte ediliyorsa, diğer sürgü(ler) bir sonraki adıma geçmeye hazır olana kadar bu süre zarfında (1-2 saat tamam) kuru bırakılabilir.</li>
	<li>Slayt kuruduktan sonra, PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın ve tekrar kurutun (PBS tamponu = 0.137 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.0119 M Na2PO4). Bu, önceki herhangi bir kimyasalın (donma önleyici depolama solüsyonundan gelen gliserol gibi) yeterince uzaklaştırılmasını sağlar ve dokunun slayta yapışmasını bozmaz.</li>
</ol>
2. Reaktiflerin ve Küçük Ekipmanların Hazırlanması
<ol>
	<li>Doku bölümlerinin kaynatılacağı Çözelti A'yı (0.1 M veya 19.21 g/l sitrik asit) ve Çözelti B'yi (0.1 M veya 24.9 g/l tris-sodyum sitrat) hazırlayın.</li>
	<li>Dereceli bir silindirde, 9 ml Çözelti A ve 41 ml Çözelti B'yi birleştirin ve bu karışıma 450 ml ddH2O ekleyin.</li>
	<li>Bu karışımı mikrodalgaya uygun boş bir kaba (örn. boş bir pipet ucu kutusu) dökün.</li>
</ol>
3. Isı Kaynaklı Antijen Alımı
<ol>
	<li>2. adımda yapılan çözeltiyi standart bir mikrodalgada standart ayarda 5 dakika kaynatın. Çözelti 100 °C'de veya üzerinde kaynamaya başlayacaktır.</li>
	<li>Kaynatma işlemi tamamlandıktan sonra, kabı mikrodalgadan dikkatlice çıkarın ve kurutulmuş slaytları içine yerleştirin, hipokampal bölümlere sahip slayt yüzünün aşağı baktığından ve sıvıya tamamen maruz kaldığından emin olun. Mümkünse, slaytları kutunun duvarlarına doğru bir açıyla yerleştirin ve diğer slaytları etraflarına istifleyin. Kutunun içindeki "uyumlarının" sıkı olduğundan emin olun, böylece kızakların üst üste hareket edecek yeri kalmaz.</li>
	<li>Bu karışımı slaytlarla mikrodalgada standart ayarlarda 7 dakika kaynatın. Çözelti bu süre zarfında 100 ° C'de veya üzerinde kaynayacaktır.</li>
	<li>Bu kaynatma aşamasında, iki buz kovasını yarısına kadar buzla doldurun.</li>
	<li>Adım 3.3'te kaynatma işlemi tamamlandıktan sonra, kabı mikrodalgadan çıkarın ve buz kovalarından birinin içine yerleştirin. Diğer kovadaki buzun geri kalanını kabın her tarafına dökün ve tamamen örtün. 1 saat bekletin.</li>
</ol>
4. Primer ve Sekonder Antikor Boyama
<ol>
	<li>1 saatlik bekleme süresinin sonunda slaytları kaptan çıkarın ve TBS-T tampon 3x ile 5'er dk yıkayın. Bu temel yıkamaları gerçekleştirmek için herhangi bir aparat kullanılabilir. (Tampon TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T =% 0.05 Triton X-100 TBS tamponu, TBS-TT =% 4 eşek serumu TBS-T tamponu).</li>
	<li>Yıkadıktan sonra, slaytları karanlık bir yerde (örneğin bir tezgah çekmecesinin içinde, çekmecenin içine bir kağıt havlu yerleştirin ve slaytı buna doğru eğin) 5-10 dakika veya slayt tamamen kuruyana kadar kurumaya bırakın. Bu süre zarfında, gece boyunca primer antikor boyaması için bir oda hazırlayın. Basit bir boyama odası, ddH2O ile doldurulmuş geniş yüzey alanına sahip bir kap ve kabın içinde, üzerine sürgünün ddH2O'nun üzerine oturtulabileceği bir aşama içerebilir.</li>
	<li>Slayt kuruduktan sonra, su itici bir kalem kullanarak doku bölümlerinin etrafına bir taslak çizin. Adım 4.5 sırasında, bu taslak antikor karışımının akmasını önleyen bir bariyer görevi görür.</li>
	<li>TBS-TT'de birincil antikor karışımını hazırlayın. Örneğin, bir slaytın tamamını kaplamak için en az 500 μl gereklidir, örneğin antikor stoğu 1:500 konsantrasyondaysa, 500 μl TBS-TT'ye 1 μl özel antikor ekleyin). Reaktifler tablosunda belirtildiği gibi birincil antikorları kullanın.</li>
	<li>Kurutulmuş slaytı boyama odasındaki sahnenin üzerine yerleştirin. 500 μl primer antikorları yavaşça ekleyin ve tüm yüzeyi kaplayın. Tüm cihazı örtün ve dış ışığı engellemek için alüminyum folyoya sarın. Gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.</li>
	<li>Ertesi gün, slaytı her biri TBS-T tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Adım 4.2'de açıklandığı gibi karanlık bir alanda kurumaya bırakın.</li>
	<li>Adım 4.4'e benzer şekilde ikincil antikor karışımı hazırlayın. İkincil antikorlar için reaktifler tablosuna bakın.</li>
	<li>Kurutulmuş slaytı adım 4.2 ve 4.5'te açıklandığı gibi boyama odasına yerleştirin. 500 μl sekonder antikorları yavaşça ekleyin ve tüm yüzeyi kaplayın. Boyama haznesini dış ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın. Oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca üstü kapalı ve dış ışıktan korunarak bekletin.</li>
	<li>İkincil boyamanın tamamlanmasından sonra, slaytı her biri TBS-T tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Slaytı karanlık bir alanda kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, montaj solüsyonunu koyun ve sürgünü bir kapak kaymasıyla, herhangi bir kabarcık girmesini önleyerek dikkatlice örtün. Sonraki analizden önce slaytı en az 2 saat karanlık bir alanda bekletin.</li>
	<li>Lekeli doku üzerinde hızlandırılmış veya konfokal analiz yapın.</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Santarelli, L., Saxe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hippocampal+neurogenesis+for+the+behavioral+effects+of+antidepressants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants.</a> Science. 301 (5634), 805-809 (2003).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).</li>
<li>Clelland, C. D., Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325 (5937), 210-213 (2009).</li>
<li>Wang, J. W., David, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+fluoxetine+stimulates+maturation+and+synaptic+plasticity+of+adult-born+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).</li>
<li>D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+antigen+retrieval+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).</li>
<li>Daneshtalab, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).</li>
<li>Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+frizzled-related+protein+3+regulates+activity-dependent+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-thermal+effects+of+microwaves+on+proteins%3A+Thermophilic+enzymes+as+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system.</a> FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).</li>
<li>Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visualization+of+a+new+class+of+traumatically+injured+axons+through+the+use+of+a+modified+method+of+microwave+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval.</a> Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Progenitör hücre tiplerinin başarılı bir şekilde antijen alımı ve boyanması için en kritik adımlar şunlardır: 1) optimal koronal kalınlıkta iyi perfüze edilmiş ve sabitlenmiş doku kullanılması; 2) antijen alımı sırasında kaynatma ve ardından soğutma için yeterli zaman tanımak; 3) Sabit koronal bölümlerin montajında el becerisi ve bunu yaparken hasar görmelerini önleme.
IHK'de yeterli fiksasyona uğramış ancak aşırı fiksasyona uğramamış perfüze doku kullanılması kritik öneme sahiptir. Birincil z...

Nöral kök hücrelerden yeni nöronların üretilmesi olan nörogenezin, artık beyindeki iki özel bölgede yetişkinliğe kadar sürekli olarak meydana geldiği bilinmektedir. Bunlar, koku alma ampulünün subventriküler bölgesini (SVZ) ve hipokampustaki dentat girusun subgranüler bölgesini (SGZ) içerir. Son on yılda, yetişkin hipokampal nörojenez alanı önemli çalışmalar gördü. SGZ'deki yenidoğan nöronları, belirli beyin fonksiyonlarını1-5 sürdürebilen gelişmiş nöral plastisiteye katkıda bulunduğundan, bölge büyük ilgi görmüştür. Erişkin hipokampal nörogenez, duygudurum düzenlemesi, yenilenme ve öğrenme ve hafızada önemli roller oynamakla ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, bu zengin nörojenik nişteki nöronların gelişimini ve düzenlenmesini anlamak için ortak bir çaba sarf edilmiştir.
Erişkin hipokampal nörojenezi incelemenin kaçınılmaz ve önemli bir yönü, aktive edilmiş bir nöral kök hücrenin tamamen işlevsel bir nöron olma yolunda geçtiği ayrı aşamaların tanımlanmasıdır. Bu süreçte, hareketsiz nöral kök hücre aktive edilir ve bir dizi erken aktif ve geç aktif progenitör hücre tipi boyunca ilerler (Şekil 1). Nöral progenitörlerin bu farklı popülasyonları, morfoloji ve RGL'lerin kendi progenitör hücre tiplerine dönüşümünü yönlendiren MCM2, nestin, Tbr2 ve Doublecortin (DCX) ve NeuN gibi moleküler belirteçlerin ekspresyonu ile tanımlanabilir. Nestin, radyal glia benzeri hücreler ve bazı erken progenitör hücre tipleri boyunca eksprese edilen bir ara filament proteinidir. Diğer bir belirteç, amplifiye edici progenitör hücrelerde spesifik olarak eksprese edilen Tbr2'dir. Tbr2 transgen ekspresyonu başlangıçta Tip-1 hücrelerde (radyal-glia benzeri) kapatılır, Tip-2a, Tip-2ab ve Tip-2b progenitörlerinde açılır ve daha farklılaşmış Tip-3 ve olgunlaşmamış nöronlar arasında kapatılır (Şekil 1). DCX, Tip-2ab, Tip-2b ve Tip-3 nöral progenitörlerde eksprese edilen bir nöronal migrasyon belirtecidir. Bu üç işaretleyicinin kombinasyonunu kullanarak, nöral progenitörlerin farklı alt tiplerini etiketleyebiliriz. Bunlar arasında Tip-1 (MCM2+nestin+Tbr2-), Tip-2a (MCM2+nestin+Tbr2+), Tip-2ab (kısmi MCM2+nestin-Tbr2+ ve kısmi MCM2+Tbr2+DCX-), Tip-2b (MCM2+Tbr2+DCX+) ve Tip-3 (MCM2+Tbr2-DCX+). Olgunlaşmamış ve fonksiyonel olarak entegre nöronlar gibi post-mitotik hücreler, DCX ve olgun nöronal belirteç NeuN kullanılarak tanımlanabilir.
Geleneksel IHC yöntemleri, gen ekspresyonlarına dayalı olarak belirli hücre tipleri için antijenleri tanımlamak için antikorlar kullanır. Konfokal mikroskopi gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri ile daha sonraki görselleştirme, bunların tanımlanması için kullanılabilir. Bununla birlikte, şu anda, radyal glia benzeri hücrelerin ve erken progenitör hücre tiplerinin verimli bir şekilde tanımlanmasına izin vermeyen bu yöntemlerle ilgili sorunlar vardır. Bu belirli hücre tiplerini tanımlamak zordur, çünkü uygulanan antikor nestin proteinine nüfuz edemez ve etkili bir şekilde bağlanamaz. Nestin, radyal glia benzeri hücre tarafından üretilen radyal süreçleri içeren ara filament proteinidir. Bir antikorun antijene verimsiz bağlanması, fiksasyon süresi, sıcaklık ve kullanılan teknik gibi birçok faktörün bir sonucu olabilir6-7. Bu tür sorunları çözmeye yardımcı olmak için bir antijen geri kazanımı veya "kaynatma" yöntemi geliştirdik. Nestinin yanı sıra, bu antijen elde etme yöntemi ayrıca Ki67, BrdU, glial fibriler asidik protein (GFAP), Tbr2 ve MCM2 gibi diğer belirteçler için boyamayı da iyileştirir. Yöntemimiz kimyasal ve fiziksel yaklaşımları bir araya getirir. Dokunun paraformaldehitte kimyasal olarak sabitlenmesini ve ardından ince koronal hipokampal bölümlerin denatüran ve kaotropik bir tedavi tamponunda yüksek sıcaklıkta kaynatılmasını içerir. Bu, antijenin antikora erişilebilirliğini artırır, antikor özgüllüğünü iyileştirir ve progenitör hücre tiplerinin daha iyi tanımlanmasını sağlar. Yaklaşımımızın kullanımı basittir ve laboratuvarda çoğunlukla mevcut olan araçları ve reaktifleri gerektirir. Nöral kök hücrelerin gelişimini ve bunların içsel genetik veya dışsal çevresel faktörler aracılığıyla düzenlenmesini incelemek için yaygın olarak kullandık8.

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus Slide</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>Kaynatma sırasında hipokampal dokuya güçlü yapışma sağlar</td></tr><tr><td>PVA/DABCO Montaj Ortamı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10981-100 ml</td><td> </td></tr><tr><td>Nestin (tavuk) </td><td>Aves Lab</td><td>NES</td><td>Nöral kök hücre işaretleyici</td></tr><tr><td>GFAP (tavşan)</td><td>Dako Kuzey Amerika</td><td>Z033401-2</td><td>Astrosit ve nöral kök hücre belirteci</td></tr><tr><td>MCM2 (fare)</td><td>BD Transdüksiyon Laboratuvarı</td><td>610701</td><td>Proliferasyon belirteci</td></tr><tr><td>DCX (keçi)</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC8066</td><td>Olgunlaşmamış nöron belirteci</td></tr><tr><td>Tbr2 (tavşan)</td><td>Abcam</td><td>Ab23345</td><td>Amplifiye edici progenitör belirteç</td></tr><tr><td>NeuN (fare)</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>Olgun nöron belirteci</td></tr><tr><td>Cy2 (tavşan karşıtı)</td><td>Jackson İmmünoaraştırma</td><td>111-226-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy2 (tavuk karşıtı)</td><td>Jackson İmmünoresearch</td><td>303-165-006</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (fare karşıtı)</td><td>Jackson İmmünoaraştırma</td><td>315-175-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (keçi karşıtı)</td><td>Jackson İmmünoaraştırma</td><td>305-165-047</td><td> </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Yaşam Teknolojileri Şirketi</td><td>D1306</td><td> </td></tr><tr><td>Dako Kalem</td><td>S2002</td><td>Dako</td><td>Su geçirmez kalem</td></tr></tbody></table>

isı kaynaklı antijen alımı: yetişkin hipokampal nörojenez sırasında progenitör hücre tiplerini tespit etmek ve tanımlamak İçin etkili bir yöntem

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Doku fiksasyonunu takip eden geleneksel immünohistokimya (IHC) yöntemleri, çeşitli hücre tiplerinin görüntülenmesine izin verir. Bunlar tipik olarak antijenleri bağlamak ve doğal biyoloji ve gelişimin bir fonksiyonu olan özelliklere sahip hücreleri tanımlamak için antikorların uygulanmasıyla devam eder. Erişkin hipokampal nörogenez, hareketsiz bir nöral kök hücrenin aktive olabildiği ve proliferasyon, farklılaşma, olgunlaşma ve fonksiyonel entegrasyon aşamalarından geçebildiği sıralı bir süreçtir. Her faz, karakteristik bir morfoloji ve genlerin yukarı regülasyonu ile farklıdır. Bu aşamaların tanımlanması, oyundaki düzenleyici mekanizmaları ve zayıflatıcı bozuklukların patofizyolojisinin altında yatan bu süreçteki herhangi bir değişikliği anlamak için önemlidir. Isı kaynaklı antijen alma yaklaşımımız, tespit edilen sinyalin yoğunluğunu artırır ve progenitör hücre tipinin doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu yazıda tartışıldığı gibi, özellikle belirli progenitör hücre tiplerinin tespitindeki mevcut sorunları aşmamıza izin verir.

Yetişkin hipokampal nörogenez, her aşamadaki temsilci progenitör hücre tipinin bir dizi belirteç kombinasyonu ile tanımlanabildiği ardışık bir süreçtir. Dikkatli kimyasal tespit ve antijen geri kazanımı, aksi takdirde tespit edilmesi zor olan belirteçlerin etkinliğini ve erişilebilirliğini artırır. Bunlardan biri, radyal glia benzeri nöral kök hücrelerde ve bazı erken aktif progenitör hücre tiplerinde eksprese edilen nestin'dir. Kök hücre veya progenitör daha sonra olgun bir nörona farklılaştığında ekspresyonu kaybolduğu...

Erişkin hipokampal nörogenez sırasında, hareketsiz bir nöral kök hücre sırayla ilerlediğinde ve devrede işlevsel olarak entegre bir nörona dönüştüğünde farklı bir genetik belirteç seti ifade edilir. Isı kaynaklı antijen alımı kullanılarak, aksi takdirde tespit edilmesi zor olan progenitör hücre tipleri, geliştirilmiş etkinlik ile tanımlanır.

Isı Kaynaklı Antijen Alımı: Yetişkin Hipokampal Nörojenez Sırasında Progenitör Hücre Tiplerini Tespit Etmek ve Tanımlamak İçin Etkili Bir Yöntem

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Bu prosedürün genel amacı, yeni doğan nöronları meydana getiren progenitör hücre tiplerini daha iyi görüntüleyebilmek için hipokampal beyin dokusunda antijen geri kazanımı gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle fareden perfüze edilmiş beynin alınması, ince koronal kesitlerin çıkarılması ve bu kesitlerin dokuya güçlü şekilde yapışması için özel olarak tasarlanmış bir cam lama yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, doku içeren lamların kaynatılması, atopik işlem uygulanması ve soğuma için yeterli sürenin tanınmasıdır.Ardından, dokuyu bir gece boyunca primer antikorlarla boyayın. Son adım, ertesi gün doku üzerinde en az iki saat boyunca sekonder antikor boyaması gerçekleştirmektir. Nihayetinde, hipokampal dokunun yetişkin nörojenezi sırasındaki çeşitli gelişim evrelerinde bulunan farklı pro-gender hücre tiplerini, time-lapse veya konfokal mikroskopi ile görüntüleyin.Merhaba, ismim Hun Jo; Dr. Ian John'un laboratuvarında ve Mayo Clinic'te doktora sonrası araştırmacı olarak görev yapmaktayım. John Laboratuvarı'ndaki temel odak noktamız, nörolojik ve psikiyatrik bozukluklarda yetişkin nörogenezi sürecini araştırmaktır. Nihai hedefimiz, bu bilgileri terapötik uygulamalara başarıyla aktarmaktır; bu doğrultuda antijen geri kazanım prosedürümüzü Quam Hui ve laboratuvarımızdan John ile birlikte sunacağız.Tekniğimizin mevcut immünohistokimya yöntemlerine göre temel avantajı, yetişkin hipokampal nörojenez sırasında farklı hücre tiplerinin etkili bir şekilde görselleştirilmesine olanak tanımasıdır. Diğer türlü tespit edilmesi zor olan öncül nöral kök hücreler de dahil olmak üzere bu hücre tipleri, kullandığımız antijen geri kazanım yöntemi ile verimli bir şekilde işaretlenebilir ve görselleştirilebilir. Bu yöntem, yetişkin hipokampal nörojenez sırasında yeni doğan nöronların gelişimi ve düzenlenmesi hakkında bilgi sağlayacaktır.Ruhsal bozuklukların ve farmakolojik tedavinin incelenmesiyle ilgilenenler için, uyguladığımız antijen geri kazanımı, bu hastalığın patogenezi sırasında nöronal gelişimin rolünü araştırmada faydalı olacaktır. İşleme, perfüze edilmiş bir farenin beynini, 10 mililitrelik konik bir tüp içinde 4% paraformaldehitte, dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca veya tam fiksasyon için en az 12 ila 24 saat (ancak 36 saatten fazla olmamak kaydıyla) bekleterek başlayın. Gece boyu süren fiksasyonun ardından PFA'yı uzaklaştırın ve beyni konik tüpün içinde bırakın.Ardından, kalıntı PFA'yı uzaklaştırmak için beyni %30 sükroz ile yıkayın ve sükrozu atın. Sonra tüpü tekrar %30 sükroz ile doldurun ve beyin tüpün tabanına çökene kadar dört santigrat derece Celsius'ta tutun. Daha sonra, hipokampusu bir mikrotomda 40 mikrometre beyin kesitleri halinde kesin.Kesitleri, immünohistokimya aşamasına hazır olana kadar antifriz solüsyonunda muhafaza edin. Ardından, kesitleri dokuya güçlü bir şekilde tutunacak şekilde özel olarak tasarlanmış mikroskop lamlarına monte edin. Dokuyu monte ettikten sonra, lamların yaklaşık 10 dakika boyunca kurumasına izin verin.Önceki kimyasalların tamamen uzaklaştırıldığından emin olmak için lamlar bir kağıt havlu üzerinde dikey bir yüzeye yaslanırsa kuruma süreci hızlandırılabilir. Lamlar kuruduktan sonra, her biri beş dakika sürecek şekilde 3 kez PBS ile yıkayın. Ardından tekrar kurumaya bırakın.Bu prosedürde, doku kaynatma solüsyonunu beraberindeki makaledeki açıklamaya göre hazırlayın. Ardından, solüsyonu standart ayarlardaki standart bir mikrodalga fırında beş dakika boyunca kaynatın. Kaynatma işlemi tamamlandığında, kabı dikkatlice mikrodalga fırından çıkarın.Ardından, kurutulmuş lamları solüsyonun içine aktarın. Hipokampal kesitlerin bulunduğu tarafın solüsyonla tamamen temas ettiğinden emin olun. Mümkünse, lamları kabın duvarlarına eğimli bir şekilde yerleştirin ve diğer lamları etraflarına dizin.Ardından, lamların bulunduğu karışımı mikrodalga fırında standart ayarlarda yedi dakika boyunca kaynatın. Bu sırada, iki buz kovasını yarıya kadar buzla doldurun. Kaynama işlemi tamamlandığında, kabı mikrodalga fırından çıkarıp buz kovalarından birinin içine yerleştirin.Diğer kovadaki buzun geri kalanını kabın çevresine dökün ve kabı tamamen kaplayın. Ardından, bir saat boyunca bekletin. Lamları kaptan çıkarın.Bunları üç kez, her seferinde beş dakika boyunca TBST tamponu ile yıkayın. Ardından, lamları karanlıkta beş ila 10 dakika veya lam tamamen kuruyana kadar kurutun. Bu sırada, gece boyu sürecek birincil antikor boyaması için DDH₂O içeren bir hazne hazırlayın.Lamlar kuruduktan sonra, doku kesitlerinin etrafını su itici bir kalemle çevreleyerek bir hat çizin. Bu hat, antikor karışımının taşmasını önlemek için bir bariyer görevi görür. Ardından, T-B-S-T-T içerisinde primer antikor karışımını hazırlayın.Kurutulmuş lamları boyama haznesindeki tabloya yerleştirin. Tüm yüzeyi kaplayacak şekilde 500 µL primer antikoru yavaşça ekleyin. Ardından, dış ışığı engellemek için boyama haznesini kapatın ve oda sıcaklığında gece boyunca bekletin; ertesi gün lamları TBST tamponu ile her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.Ardından, bunları karanlıkta kurutun. Şimdi T-B-S-T-T içerisinde sekonder antikor karışımını hazırlayın. Daha sonra kuru lamları boyama haznesine yerleştirin.500 µL sekonder antikor ekleyin. Boyama haznesini yavaşça kapatın ve sekonder boyama tamamlandıktan sonra oda sıcaklığında en az iki saat boyunca dış ışıkla temasını kesin; ardından lamları TBST tamponu ile her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın ve karanlıkta kurutun. Lamlara kapatma solüsyonu ekleyin.Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için üzerlerini dikkatlice lamellerle kapatın. Ardından, sonraki analizler ile boyanmış doku üzerinde zaman ayarlı (time-lapse) veya konfokal analizler gerçekleştirmeden önce lamları en az iki saat boyunca karanlıkta bekletin. Erişkin hipokampal nörojenez, dentat girusun subgranüler zonu boyunca betimlenmiştir.Aktive olmuş radyall glial benzeri tip bir kök hücre, farklılaşırken, olgunlaşırken ve karmaşık bir morfoloji ile nöronal devreye fonksiyonel olarak entegre olurken belirgin evrelerden geçer. Bu evrelerin her biri ve ilgili hücre tipleri, belirteçlerin kombinasyonlarının ekspresyonuna göre tanımlanabilir. MCM two, tüm mitotik öncül hücre tiplerinde eksprese edilen bir proliferasyon belirteciyken, nein radyall ve radyall olmayan glial benzeri kök hücrelerde eksprese edilir.Tip iki A progenitörleri diferansiye oldukça, nestin ekspresyonu ilk olarak kapatılır. Post-mitotik progenitörde anti TBR iki ekspresyonu artar, MCM iki ekspresyonu kaybolurken DCX ve NEWAN ekspresyonları migrasyonu ve fonksiyonel bir nörona matürasyonu belirler. Bu; mor MCM iki, yeşil nestin ve kırmızı dappy boyamasının temsili bir konfokal görüntüsüdür.Kutulardaki büyütülmüş görüntüler, neston, MCM 2 ve dpi eksprese eden radial GL benzeri bir progenitörü göstermektedir. Burada mavi MCM 2, kırmızı TBR 2, yeşil DCX ve gri dpi'nin temsilci bir konfokal görüntüsü yer almaktadır. Tip 2 B progenitör hücre tipinin karakteristiği olan MCM 2, TBR 2, DCX ve dpi ekspresyonu, kutulardaki büyütülmüş görüntülerde gösterilmiştir.Bu prosedürü uygularken üç noktayı hatırlamak önemlidir. Birincisi, uygun koronal kalınlıkta, iyi perfüze edilmiş ve fikse edilmiş doku kullanılmasıdır. İkincisi, dokunun lamlara düz bir şekilde yerleştirilmesi ve bu işlem sırasında herhangi bir hasarın önlenmesidir.Ve son olarak, üç; antijen geri kazanımı sırasında kaynatma ve ardından soğutma için yeterli süre tanıyın. Bu prosedürün ardından, yeni doğan nöronların hipokampal devreye nasıl entegre olabileceği ve bilişsel işleve nasıl katkıda bulunabileceği ile ilgili ek soruları yanıtlamak için konfokal doku rekonstrüksiyonu ve davranış deneyleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, diğer hipokampal nörogenez süreçleri sırasında yeni nöronların oluşmasını sağlayan temsili hücre tiplerini daha etkili bir şekilde görselleştirmek için hipokampal dokunuzda antijen geri kazanımını nasıl gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

heat-induced-antigen-retrieval-an-effective-method-to-detect-identify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Isı ile İndüklenen Antijen Alma: Yetişkin Hipokampal Nörojenez sırasında Progenitör Hücre Tiplerini Algılamak ve Tanımlamak için Etkili Bir Yöntem

Video, yetişkin hipokampusundaki nörojenezi incelemek için kullanılan bir immünofloresan boyama yöntemini göstermektedir. Başlangıçta, bir fare beyin bölümü, nöronal progenitör hücrelerde nörojenez ile ilişkili işaretleyici proteinlere yönelik birincil antikorlarla tedaviye tabi tutulur. Daha sonra, floroforlarla etiketlenmiş ikincil antikorlarla etiketlenir. Beyin bölümü daha sonra, işaretleyici proteinlerin farklı kombinasyonlarının ekspresyon modellerine dayalı olarak, progenitör hücrelerin...

Erişkin Hipokampal Nörojenezi Tespit Etmek için Bir İmmünofloresan Boyama Tekniği

Bu video, EdU dahil edilmesi kullanılarak beyin dokusu kesitlerinde yeni çoğalan nöral kök hücrelerin boyanması prosedürünü ve ardından spesifik proteinleri görselleştirmek için immünofloresan ile hücre dinamiklerinin ve proliferasyonunun anlaşılmasını geliştirme prosedürünü göstermektedir.

Fare Beyin Bölümlerinde Prolifere Nöral Kök Hücreleri Görselleştirmek için İmmünofloresan Boyama

Bu video makale, aynı doku kesitinde yetişkin hipokampal nörogenezin tüm aşamalarını tespit etmek ve ölçmek için kapsamlı bir protokolü göstermektedir. Farklı konakçı türlerden uygun antikorlar mevcut olmadığında ortaya çıkan dolaylı çoklu immünofloresan sınırlamalarının üstesinden gelmek için bir yöntem geliştirdik.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için bir immünohistokimya protokol açıklar. Bu protokol bilişsel karakterize hem genetik ya da farmakolojik fare modellerine uygulanabilir.

Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Bu protokolün amacı, belirli bir lokal nöral devrenin kemogenetik manipülasyonuna yanıt olarak yetişkin nöral kök/progenitor hücrelerin davranışını analiz etmek için bir yaklaşım tanımlamakta.

Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği

Bu makale, sıçanlarda yetişkin nörogenezini ölçmek için BrdU pozitif hücrelerini görselleştirmek için en yaygın tekniklerden dördünü sunmaktadır. Bu çalışma, reaktif hazırlama, timidin analog uygulaması, transkardiyal perfüzyon, doku hazırlığı, peroksidaz immünohistokimyasal reaksiyonu, immünofloresan, sinyal amplifikasyonu, karşı boyama, mikroskopi görüntüleme ve hücre analizi için talimatları içerir.

Thymidine Analog BrdU Kullanarak Sıçanlarda Hücresel Proliferasyon ve Nörogenezi Analiz Etmek için İmmünohistokimya Teknikleri

Otoimmün ensefalit, merkezi sinir sisteminin antikor aracılı hastalıklarının yeni bir kategorisidir. Hipokampal nöronlar bu antikorları keşfetmek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Bu makalede, hastaların serum ve beyin omurilik sıvısındaki otoantikorları belirlemek için primer hücre kültürü ve immün boyama için bir protokol sunulmaktadır.

Otoimmün Ensefalitte Yer Alan Yeni Patojenik Antikorları Tespit Etmek ve İncelemek için Hipokampal Nöronal Kültürler

Nöronal programlama ile üretilen insan pluripotent kök hücre kaynaklı GABAerjik nöronların transplantasyonu, nörogelişimsel bozukluklar için potansiyel bir tedavi yaklaşımı olabilir. Bu protokol, insan kök hücre kaynaklı GABAerjik nöronal öncüllerin yenidoğan farelerin beyinlerine üretilmesini ve transplantasyonunu tanımlar, aşılanmış nöronların uzun süreli araştırılmasına ve terapötik potansiyellerinin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan Kök Hücre Kaynaklı GABAerjik Nöronların Nörogelişimsel Bozuklukları Hafifletmek İçin Erken Postnatal Fare Hipokampüsüne Transplantasyonu

Burada, floresan ile aktive olmuş çekirdekler (FAN) sıralama yoluyla çoğu nöronu dışlayan fare dentat girusundan izole edilen tek çekirdekleri sıralamak için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, yüksek kaliteli ekspresyon profilleri oluşturur ve nöral kök hücreler gibi kıt popülasyonlar da dahil olmak üzere niş içinde temsil edilen diğer hücre tiplerinin çoğunun incelenmesini kolaylaştırır.

Hipokampal Nörojenik Nişi İncelemek için Tek Çekirdekli RNA Dizilimi ile Birleştirilmiş Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Negatif Nöronik Sıralama

Keşfedin ısı kaynaklı antijen alımı yöntemiyle yetişkin hipokampal nörojenez sırasında progenitör hücre tiplerini tespit etmeyi. Bu teknik, fare dokusunda nöral kök hücreleri görselleştirmek için etkili bir yaklaşım sunar.

Isı Kaynaklı Antijen Alımı: Yetişkin Hipokampal Nörojenez Sırasında Progenitör Hücre Tiplerini Tespit Etmek ve Tanımlamak İçin Etkili Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal

Isı Kaynaklı Antijen Alımı: Yetişkin Hipokampal Nörojenez Sırasında Progenitör Hücre Tiplerini Tespit Etmek ve Tanımlamak İçin Etkili Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet