Isı Kaynaklı Antijen Alımı: Yetişkin Hipokampal Nörojenez Sırasında Progenitör Hücre Tiplerini Tespit Etmek ve Tanımlamak İçin Etkili Bir Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, yenidoğan nöronlarına yol açan progenitör hücre tiplerini daha iyi görselleştirmek için hipokampal beyin dokusu üzerinde antijen alımı yapmaktır. Bu, ilk olarak perfüze edilmiş beynin fareden ince koronal bölümleri keserek ve bu bölümleri dokuya güçlü bir şekilde yapışması için özel olarak tasarlanmış bir cam slayt üzerine monte ederek gerçekleştirilir. İkinci adım, slaytları doku ve Kay atopik tedavisi ile kaynatmak ve soğuma için yeterli zaman tanımaktır.

Daha sonra, dokuyu gece boyunca birincil antikorlarla boyayın. Son adım, ertesi gün en az iki saat boyunca doku üzerinde ikincil antikor boyaması yapmaktır. Sonuç olarak, hipokampal dokunun yetişkin nörojenezi sırasında gelişimin çeşitli aşamalarında çeşitli cinsiyet yanlısı hücre tiplerini hızlandırılmış veya konfokal mikroskopi ile görselleştirin.

Merhaba, benim adım Hun Jo, doktora sonrası, Dr.Ian John'un laboratuvarı ve Mayo Clinic'in bir üyesi. John Lab'daki ana odak noktamız, nörolojik ve psikiyatrik bozukluklarda diğer nörojenez sürecini araştırmaktır. Nihai hedefimiz, bu tür bilgileri başarılı bir şekilde terapötik uygulamaya dönüştürerek antijen geri alma prosedürümüzün Quam Hui ve laboratuvarımızdan merhaba John olacağını göstermektir.

Tekniğimizin mevcut immünohistokimya yöntemlerine göre en önemli avantajı, erişkin hipokampal nörogenez sırasında farklı hücre tiplerinin etkili bir şekilde görüntülenmesine olanak sağlamasıdır. Aksi takdirde tespit edilmesi zor olan öncü nöral kök hücreler de dahil olmak üzere bu hücre tipleri, antijen toplama yöntemimiz kullanılarak verimli bir şekilde etiketlenebilir ve görselleştirilebilir. Bu yöntem, yetişkin hipokampal nörojenez sırasında yenidoğan nöronlarının gelişimi ve düzenlenmesi hakkında fikir verecektir.

Zihinsel bozukluklar ve farmakolojik tedavi çalışmaları ile ilgilenenler için, antijen alımımız, bu hastalık sırasında nöronal gelişimin rolünü araştırmada yararlı olacaktır. Patogenez. Prosedüre, perfüze edilmiş bir fareden alınan beyni, gece boyunca dört santigrat derecede veya en az 12 ila 24 saat, ancak tam fiksasyon için en fazla 36 saat boyunca 10 mililitrelik konik bir tüpe% 4 para formaldehit içinde yerleştirerek başlayın. Gece boyunca fiksasyondan sonra, PFA'yı çıkarın ve beyni konik tüpte bırakın.

Ardından, kalan PFA'yı çıkarmak için beyni% 30 sükroz ile durulayın ve sükrozu atın. Daha sonra tüpü tekrar% 30 sükroz ile doldurun ve beyin tüpün dibine batana kadar dört santigrat derecede tutun. Daha sonra, hipokampusu bir mikrotom üzerinde 40 mikrometre beyin bölümlerine kesin.

Antifriz solüsyonundaki bölümleri immünohistokimya için hazır olana kadar koruyun. Daha sonra dilimleri, dokuya güçlü bir şekilde yapışması için özel olarak tasarlanmış mikroskop slaytlarına monte edin. Dokuyu monte ettikten sonra, slaytları yaklaşık 10 dakika kurumaya bırakın.

Önceki kimyasalların tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için slaytlar bir kağıt havlu üzerinde dikey bir yüzeye yaslanırsa kurutma hızlandırılabilir. Slaytlar kuruduktan sonra, her seferinde beş dakika boyunca PB S3 ile yıkayın. Sonra tekrar kurumasını bekleyin.

Bu prosedürde, beraberindeki el yazmasındaki açıklamaya göre doku kaynatma çözeltisini hazırlayın. Daha sonra, çözeltiyi standart ayarda standart bir mikrodalgada beş dakika kaynatın. Kaynatma işlemi tamamlandıktan sonra, kabı mikrodalgadan dikkatlice çıkarın.

Bundan sonra, kurutulmuş slaytları çözeltiye aktarın. Hipokampal bölümlerin bulunduğu tarafın çözeltiye tamamen maruz kaldığından emin olun. Mümkünse, slaytları kabın duvarlarına doğru bir açıyla yerleştirin ve diğer slaytları etraflarına istifleyin.

Daha sonra karışımı slaytlarla birlikte standart ayarlarda mikrodalgada yedi dakika kaynatın. Bu arada, iki buz kovasını yarısına kadar buzla doldurun. Kaynatma işlemi tamamlandıktan sonra, kabı mikrodalgadan çıkarın ve buz kovalarından birinin içine yerleştirin.

Diğer kovadaki buzun geri kalanını kabın her tarafına dökün ve tamamen örtün. Bundan sonra, bir saat sonra bir saat bekletin. Slaytları kaptan çıkarın.

Her seferinde beş dakika boyunca üç kez TBST tamponu ile yıkayın. Ardından, slaytları karanlıkta beş ila 10 dakika veya slayt tamamen kuruyana kadar kurutun. Bu arada, gece boyunca primer antikor boyaması için DDH iki O içeren bir oda hazırlayın.

Slaytlar kuruduktan sonra, bir su temyiz kalemi kullanarak doku bölümlerinin etrafına bir taslak çizin. Bu taslak, antikor karışımının akmasını önlemek için bir bariyer görevi görür. Daha sonra birincil antikor karışımını T-B-S-T-T'de hazırlayın.

Kurutulmuş slaytları boyama odasındaki sahneye yerleştirin. Tüm yüzeyi kaplamak için 500 mikrolitre birincil antikoru yavaşça ekleyin. Daha sonra, dış ışığı engellemek için boyama odasını kapatın ve ertesi gün gece boyunca oda sıcaklığında tutun, slaytları TBST tamponu ile her seferinde beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Ondan sonra karanlıkta kurutun. Şimdi ikincil antikor karışımını T-B-S-T-T'de hazırlayın. Ardından kuru slaytları boyama odasına yerleştirin.

İkincil antikorun 500 mikrolitresini ekleyin. Boyama haznesini yavaşça kapatın ve ikincil boyamanın tamamlanmasından sonra oda sıcaklığında en az iki saat dış ışıktan uzak tutun, slaytları her seferinde TBST tamponu ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın, kuruduktan sonra slaytları karanlıkta kurutun. Slaytlara montaj çözümü ekleyin.

Herhangi bir baloncuk girmesini önlemek için bunları dikkatlice kapak fişleri ile örtün. Ardından, sonraki analizden ve lekeli doku üzerinde hızlandırılmış veya konvo analizi yapmadan önce slaytları en az iki saat karanlıkta tutun. Erişkin hipokampal nörogenez, dentat girusun sub granüler bölgesi boyunca tasvir edilmiştir.

Tip bir kök hücre gibi aktive edilmiş bir radyal glial, farklılaştıkça, olgunlaştıkça ve işlevsel olarak ayrıntılı bir morfoloji ile nöronal devreye entegre olurken farklı fazlardan geçer. Fazların her biri ve ilgili hücre tipleri, bir işaretleyici kombinasyonunun ifadelerine dayalı olarak tanımlanabilir. MCM iki, tüm mitotik progenitör hücre tiplerinde eksprese edilen bir proliferasyon belirtecidir, nein ise radyal ve radyal olmayan glial benzeri kök hücreler arasında eksprese edilir.

Tip iki A ataları farklılaştığından, iç içe ifade önce kapatılır. Mitotik progenitör MCM'de anti TBR iki ekspresyon artar, iki ekspresyon kaybolurken, DCX ve NEWAN ekspresyonu fonksiyonel bir nörona göç ve olgunlaşmayı belirler. Bu, mor MCM, iki yeşil neston ve kırmızı benekli boyamanın temsili bir konfokal görüntüsüdür.

Kutulardaki büyütülmüş görüntüler, neston MCM iki ve dpi'yi ifade eden radyal GL benzeri bir progenitörü göstermektedir. İşte mavi MCM iki kırmızı, TBR iki yeşil DCX ve gri dpi'nin temsili bir konfokal görüntüsü. Tip iki B progenitör hücre tipinin karakteristiğinin boyanması, MCM iki, TBR 2D, c, X ve dpi'yi ifade eden kutulardaki büyütülmüş görüntülerde gösterilmiştir.

Bu prosedürü denerken, üç şeyi hatırlamak önemlidir. Birincisi, doğru koronal kalınlıkta iyi perfüze edilmiş ve sabitlenmiş doku kullanın. İkincisi, dokuyu kızakların üzerine düz bir şekilde monte etmek ve bunu yaparken herhangi bir hasarı önlemek.

Ve son olarak, üç, antijen alımı sırasında kaynatma ve ardından soğutma için yeterli zamana izin verir. Bu prosedürü takiben, yenidoğan nöronlarının kendilerini hipokampal devrelere nasıl entegre edebileceği ve bilişsel işleve nasıl katkıda bulunabileceği ile ilgili ek soruları yanıtlamak için konfokal doku rekonstrüksiyonu ve davranış deneyleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, diğer hipokampal nevroz sırasında yeni nöronlara yol açan mevcut hücre tiplerini daha etkili bir şekilde görselleştirmek için hipokampal dokunuzda antijen retriever'in nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamalısınız.