Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol

Bu prosedürün genel amacı, ultraviyole ışınlama kullanarak transgenik ekstrkromozomal dizileri serratus elegance genomuna entegre etmektir. Öncelikle, mümkün olan en yüksek iletim oranına sahip, ideal olarak %80'den fazla olan transgenik hattı seçin. Ardından, seçilen transgenik L4 larvalarına UV ışınlaması uygulayın ve seçilen her bir F1 plakasından dört adet floresan transgenik F2 hayvanı ayırın. Sonrasında, %100 floresan transgenik olanları belirlemek için F2 plakalarını tarayın.

F3 solucanlarını belirleyin. Nihayetinde, F3 neslinden floresan özellik gösteren hayvanların seçilmesi, transgenin %100 kalıtımını gösterebilir. Bu deneysel yaklaşım, ekstra kromozom dizilerini yüksek oranda aktaran transjenik hatlar için oldukça uygundur.

Prosedürü, laboratuvarımızdan teknisyen Stephanie Belman gerçekleştirecek. Nematod büyüme ortamı içeren 500 adet büyük Petri kabı ile başlayın. Her plakaya 0,3 milliliters doymuş isia coli ekin.

OP 50 kültürü. Entegre edilecek her bir transgenik hat için transmisyon oranını değerlendirin. Floresan stereoskop kültürü altında 10 floresan yetişkin bireyi 10 ayrı kültür plakasına seçerek yerleştirin.

Hayvanlar, genetik arka planın üremesine izin veren bir sıcaklığa ayarlanmış solucan inkübatörüne yerleştirilir. Co-enjeksiyon belirtecinin hangi gelişim aşamasında ifade edildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak en iyi şekilde nasıl gözlemlenebileceğini değerlendirmek için progeniler her gün izlenir. Floresan progenilerin yüzdesi belirlenerek progenilerin aktarım oranı değerlendirilir.

Transgen entegrasyonu için, en yüksek aktarım oranına sahip transgenik hattı seçin. L4 larva evresinde senkronize edilmiş bir transgenik hayvan popülasyonu elde edin. Entegrasyon için, 30 floresan GRA yetişkini beş kültür plağına ayırın.

Solucanlar 15 °C'de üç ila dört saat boyunca yumurta bıraktıktan sonra, plaka başına en az 30 yumurtanın varlığını kontrol edin ve ardından yetişkinleri plakalardan uzaklaştırın; hayvanları, döller L4 larva evresine ulaşana kadar bir solucan inkübatöründe kültüre edin. İçinde 15 ila 20 floresan transgenik L4 hayvan bulunan her plakayı, kapakları çıkarılmış halde bir UV crosslinker'a yerleştirin ve solucanları recovery için ışınlayın. Işınlanan solucanları 15 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Elimizdeki canlı hayvan sayısını kontrol edin. Verimli bir ışınlama için yaklaşık %80 ila %90'lık bir sağkalım oranı uygundur. Işınlanmış hayvanları, progeniler ortak enjeksiyon marker ekspresyonunun gözlemlenebileceği gelişimsel evreye ulaşana kadar 15 ila 25 °C'de büyütün.

Tekil floresan F1 hayvanlarını ayrı kültür plakalarına aktarın. Bu F1 plakalarını, kullanılan ko-marköre bağlı olarak, progenyler floresan F2 hayvanlarının gözlemlenebileceği uygun bir evreye gelene kadar 15 ila 25 degrees Celsius arasında tutun. Bu özel durumda, solucanları yetişkin olarak gözlemledik ve şu durumdaki tüm F1 plakalarını eledik: birincisi, F1 hayvanının steril olduğunu veya öldüğünü gösteren tek bir progeniyin olduğu veya hiç progeniyin olmadığı durumlar; ikincisi ise F1 hayvanının transgeni beklenen oranda aktarmadığını gösteren, hiç floresan F2 hayvanının olmadığı veya yalnızca birkaç tane olduğu durumlar.

Seçilen her F1 plağından dört adet floresan transgenik F iki hayvan ayırın. Floresan transgenler kullanırken, yüksek düzeyde floresans gösteren F iki solucanları seçin; çünkü bu durum, hayvanların entegre dizi için homozigot olduğunu gösterebilir. F iki hayvanları seçerken, bir sonraki adımda yanlış negatif sonuçlardan kaçınmak için yumurta veya larvaların beraberinde taşınmamasının kritik olduğunu unutmayın.

F2 hayvanları büyütüldükten sonra, F2 plakaları %100 floresan transgenik F3 solucanları için taranır. Tek bir floresan olmayan solucanın varlığı plakanın atılması gerektiğini gösterdiğinden tarama oldukça hızlıdır; transgenin %100 kalıtımını doğrulamak için seçilen plakalardan sekiz adet floresan F3 hayvanı ayrıştırın. Mümkünse, birkaç bağımsız entegre transgenik suş saklayın.

Ekstra kromozomal dizileri yaklaşık olarak aynı frekansta ileten iki farklı hatta transgen entegrasyonları gerçekleştirilmiştir. Standart ve geliştirilmiş protokoller kullanılarak, entegre edilen hat başına gereken süre ve plaka sayısı geliştirilmiş protokolde optimize edilmiştir. Ardından, entegre edilmemiş bir hatta daha yüksek transgen iletim oranının, transgenin genomuna entegrasyonunu kolaylaştırdığı hipotezini test ettik.

Geliştirilmiş protokol kullanılarak, farklı iletim oranlarına sahip hatlarda belirli bir transgen entegre edilmiş ve en yüksek iletim oranına sahip hat seçilmiştir. Sadece 90 seçilmiş F1 hayvandan üç entegre hat elde edilirken, %50 ila %60 oranında iletim gösteren transgenik hat için 110 seçilmiş F1 hayvandan bir entegre hat elde edilmiştir. Bu prosedürü takiben; gen ekspresyonunun, paterninin ve düzenlemesinin belirlenmesi, protein lokalizasyonu ve protein aşırı ekspresyonu veya subselüler markörlerin geliştirilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için farklı yöntemler uygulanabilir.