Name: Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans genomuna ekstrakromozomal dizileri UV ışınlaması ile entegre etmek için hızlı ve düşük malzeme tüketen bir protokol. Bu yöntem, yüksek iletim hızına sahip transgenik hatlar için özellikle etkilidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, entegre olmayan Pdyc-1::d yc-1::gfp oluşturdukları için Claire Lecroisey ve Laurent Ségalat'a teşekkür eder; Pmyo-2::d sRed ve Pmyo-3::gfp transgenik suşları. Pmyo-2::d sRed plazmid hediyesi için Andy Fire'a ve Pmyo-3::gfp plazmid hediyesi için Pamela Hoppe'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, Fransız Ulusal Bilimsel Araştırma Merkezi (CNRS) ve Lyon Claude Bernard Üniversitesi tarafından kurulmuştur.

1. Entegrasyondan Önce Transgenik Nematodların Kültürlenmesi
Transgenik hatlar1'de açıklandığı gibi oluşturulabilir. Bu çizgiler genellikle ya bir floresan proteinin ekspresyonuna ya da belirli bir gelişim aşamasında spesifik bir davranışsal veya morfolojik fenotipe yol açan bir koenjeksiyon işaretleyici plazmid içerir1,3. Bu entegrasyon protokolü, floresan veya floresan olmayan koenjeksiyon belirteçlerini eksprese eden suşlara uygulanabilir. Aşağıdaki örnekte, floresan koenjeksiyon markörü olan bir suş kullanılmıştır.
<ol>
	<li>Kültür plakalarını hazırlayın:
		<ol>
			<li>Her biri 10 ml Nematod Büyüme Ortamı (NGM)6,7 ile aseptik olarak dökülen yaklaşık 500 adet 60 mm büyüklüğünde Petri kabı hazırlayın.</li>
			<li>Her plakayı 0.3 ml doymuş Escherichia coli OP50 kültürü ile standart prosedür6,7'ye göre tohumlayın.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Entegre edilecek transgenik hattın iletim hızını değerlendirin:
		<ol>
			<li>Her transgenik hat için,7'de tarif edildiği gibi bir solucan penası kullanarak bir floresan stereoskop altında on ayrı kültür plakasına on floresan gravid ergini seçin.</li>
			<li>Solucanların üremesine izin vermek için hayvanları 15-25 ° C'de (genetik arka plana bağlı olarak) bir solucan kuluçka makinesinde kültürleyin.</li>
			<li>Koenjeksiyon belirtecinin hangi gelişim aşamasında ifade edildiğini ve en iyi şekilde gözlemlenebileceğini değerlendirmek için her gün dölleri gözlemleyin. Halen kullanılan koenjeksiyon belirteçlerinin çoğunun ekspresyonu L4 larva evresinde veya yetişkinlikte gözlenir.</li>
			<li>Bir floresan stereoskop altında gözlemleyerek floresan döl yüzdesini belirleyerek döllerin iletim hızını değerlendirin.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Transgen entegrasyonu için bir transgenik hat seçin:
		<ol>
			<li>Mümkün olan en yüksek iletim hızına sahip transgenik hattı seçin (ideal olarak %≥80).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Entegrasyon için L4 larva aşamasında senkronize edilmiş bir transgenik hayvan popülasyonu elde edin:
	<ol>
		<li>Beş kültür plakasına (plakaya göre altı hayvan) 30 floresan gravid yetişkin seçin.</li>
		<li>Solucanların 15 °C'de 3-4 saat yumurta bırakmasına izin verin.</li>
		<li>Tabakta en az 30 yumurta olup olmadığını kontrol ettikten sonra yetişkinleri plakalardan çıkarın.</li>
		<li>Hayvanları, döl L4 larva aşamasına ulaşana kadar (15 ° C'de 96 saat veya 25 ° C'de 36 saat) 15-25 ° C'de bir solucan kuluçka makinesinde kültürleyin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. UV Işınlaması ve Transgenik Solucanların Geri Kazanımı
<ol>
	<li>Solucan ışınlaması:
		<ol>
			<li>30-100 floresan transgenik L4 hayvanını ayrı kültür plakalarına seçin (plaka başına 15-20 hayvan).</li>
			<li>Plakaları, kapakları çıkarılmış olarak bir UV çapraz bağlayıcıya yerleştirin. Solucanları 0.012 J /cm2'de ışınlayın. Suşların UV'ye az ya da çok duyarlı olduğunu ve sonuçların kullanılan UV ışınlayıcıya bağlı olarak değişebileceğini unutmayın. 0.010-0.015 J /cm2 arasında bir doz aralığı test edilebilir.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Işınlamadan sonra solucan geri kazanımı:
	<ol>
		<li>Geri kazanım için ışınlanmış solucanların bulunduğu plakaları gece boyunca 15 ° C'de yerleştirin.</li>
		<li>Canlı olan hayvanların sayısını kontrol edin. Elimizde, verimli bir ışınlama için yaklaşık %80-90'lık bir sağkalım oranı uyarlanmıştır.</li>
		<li>Işınlanmış hayvanları, adım 1.2'de belirtildiği gibi, koenjeksiyon belirteç ekspresyonunun gözlemlenmesine izin veren gelişim aşamasına ulaşana kadar 15-25 ° C'de büyütün.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Entegre Transgenik Hatların İzolasyonu
<ol>
	<li>F1 hayvanlarının seçimi:
		<ol>
			<li>Tek 150-200 floresan F1 hayvanlarını ayrı kültür plakalarına. Yüksek iletimli hatlar için (% ≥80), 100 F1 hayvanı yeterlidir.</li>
			<li>Bu F1 plakalarını, döl floresan F2 hayvanlarının gözlemlenmesi için uygun bir aşamaya gelene kadar 15-25 °C'de tutun.</li>
			<li>i) F1 hayvanının kısır olduğunu veya öldüğünü gösteren hiçbir döl göstermeyan veya ii) F1 hayvanının transgeni beklenen oranda iletmediğini gösteren floresan F2 hayvanı olmayan veya sadece birkaç floresan F2 hayvanı sergileyen tüm F1 plakalarını atın. Bu adım hızlıdır ve %≥75 floresan döl sergileyen F1 plakalarını seçmek için floresan F2 solucanlarının yüzdesinin tahmin edilmesini gerektiren standart protokolle karşılaştırıldığında gerçek bir avantajı temsil eder (Tablo 1).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>F2 hayvanlarının seçimi:
		<ol>
			<li>Seçilen her F1 plakasından tek dört floresan transgenik F2 hayvanı. Floresan transgenleri kullanırken (örneğin mCherry8, gfp9 veya dsRed10), yüksek düzeyde floresan ile F2 solucanlarını seçin, çünkü bu, bu hayvanların entegre dizi için homozigot olduğunu gösterebilir. F2 hayvanlarını toplarken, bir sonraki adımda yanlış negatiflerden kaçınmak için yumurta veya larva taşımamanın çok önemli olduğunu unutmayın.</li>
			<li>F2 hayvanlarını 15-25 °C'de büyütün.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Entegre transgenik suşların izolasyonu ve validasyonu:
		<ol>
			<li>% 100 floresan transgenik F3 solucanları için ekran F2 plakaları. Floresan olmayan tek bir solucanın varlığı plakanın atılması gerektiğini gösterdiğinden ekran oldukça hızlıdır. Entegre transgen için homozigot bir F2 hayvanı, %100 homozigot floresan döl verecektir.</li>
			<li>Transgenin %100 kalıtımını doğrulamak için seçilen plakalardan tek sekiz floresan F3 hayvanı. Teorik olarak, bu adımda bir hayvan seçmek yeterlidir. Bununla birlikte, ışınlama, solucan fizyolojisi için önemli olan genleri etkileyen mutasyonları rastgele indükleyebileceğinden, verimsiz veya sağlıksız hayvanları seçmekten kaçınmak için sekiz floresan F3 hayvanının seçilmesi gerekli olabilir.</li>
			<li>Mümkünse, birkaç bağımsız entegre transgenik suşu, yani farklı F1 hayvanlarından geri kazanılan suşları saklayın.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WormBook%22">WormBook</a>. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+Fusion-Based+Approach+to+Create+Reporter+Gene+Constructs+for+Expression+Analysis+in+Transgenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans.</a> BioTechniques. 32, 728-730 (2002).</li>
<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+vector+kit+for+transgenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Worm+Meeting%22%5BJournal%5D)">A modular vector kit for transgenesis in C. elegans.</a> International Worm Meeting. , (2007).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Fleenor, J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discosoma+sp.+Red+Fluorescent+Protein+%28dsRED%29+as+a+reporter+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Worm+Breeder%27s+Gazette%22%5BJournal%5D)">Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans.</a> Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).</li>
<li>Lecroisey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZYX-1%2C+the+unique+zyxin+protein+of+Caenorhabditis+elegans%2C+is+involved+in+dystrophin-dependent+muscle+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration.</a> Mol. Biol. Cell. , (2013).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).</li>
<li>Frøkjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li>
<li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada açıklanan protokol, ekstrakromozomal transgenik dizileri C. elegans'ın genomuna entegre etmek için etkili bir yöntem sağlar. Aynı transgen Pdyc-1::d yc-1::gfp'yi (pKG45) farklı oranlarda (%10-15, %50-60 ve >%80) ileten farklı entegre olmayan hatlar kullanarak, UV ışınlamasından sonra geri kazanılan entegre suşların sayısının, entegre olmayan hattın başlangıç iletim seviyesine bağlı olduğunu gösterdik (Tablo 2). Bu nedenle, transgenlerin yüksek iletim hızı sergileyen hatlara enteg...

Transgenler, C. elegans'ta çok çeşitli uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Transgenik suşlar tipik olarak sinsityal hermafrodit gonad1,2'ye DNA enjeksiyonu ile üretilir. İlgilenilen transgeni taşıyan DNA, koenjeksiyon belirteçleri1,3,4'ü kodlayan plazmitlerle birlikte birlikte enjekte edilir. Koenjeksiyon belirteçleri, bir floresan proteinin ekspresyonuna veya spesifik bir davranışsal veya morfolojik fenotipe yol açan yerleşik transgenlerdir. Enjekte edilen DNA'lar, çok kopyalı ekstrakromozomal diziler oluşturmak için yeniden düzenlenir; Böylece, ilgilenilen transgen ve koenjeksiyon markörü birlikte iletilir5,4. Transgenik hatlar, enjekte edilen hayvanların F2 neslinde, koenjeksiyon markörünün (floresan veya spesifik fenotip) ekspresyonu tarafından indüklenen fenotipi takip ederek seçilir1. Transgenik hatlar, ekstrakromozomal dizilerin bir sonraki nesle kısmi ve değişken iletim hızlarını sergiler. Suşa bağlı olarak, hayvanların% 10-100'ü (% 100 nadir bir olaydır) ekstrakromozomal dizileri miras alır. Ek olarak, transgenik hayvanlar mozaiktir ve transgeni değişken sayıda hücrede ifade eder. Bu mozaikliğin bir sonraki nesle aktarım hızı ile ilişkili olması muhtemeldir. Gerçekten de, hem germ hattında hem de somatik hücrelerde iletim hızı, hücre bölünmeleri sırasında ekstrakromozomal dizilerin ayrılmasına bağlıdır. Bu sorunu önlemenin bir yolu, transgeni genoma entegre etmektir. Klasik olarak, bir transgenin bir kromozoma entegrasyonu, ekstrakromozomal diziler taşıyan transgenik solucanlarınışınlanmasına (ultraviyole veya gama) dayanır 3. Kısaca 50-100 adet hermafrodit hayvan L4 larva evresinde ışınlanmaktadır. F1 neslinde 200-800 transgenik hayvan seçilir ve ayrı ayrı plakalara kültürlenir. Mendel ayrımına göre, transgenin genoma heterozigot bir entegrasyonunu taşıyan transgenik F1 hayvanları, entegre dizi için heterozigot olan transgenik torunların 1/2'sini, entegre dizi için homozigot olan transgenik torunların 1/4'ünü ve diziyi entegre etmemiş torunların 1/4'ünü üretecektir (Şekil 1). Bu nedenle, F2 neslini içeren plakalar, koenjeksiyon markörünün ekspresyonu ile gözlemlendiği gibi% ≥75 transgenik hayvanlar için görsel olarak taranır. İntegral adayı olmak için seçilen F2 hayvanlarının yaklaşık 1/3'ünün entegre dizi için homozigot olduğu ve homozigot F3 hayvanlarının %100'ünü ürettiği varsayılmaktadır. Bu nedenle, seçilen her plakadan, üç ila sekiz transgenik F2 hayvanı ayrı ayrı kültürlenir ve %100 transgenik torunları olan plakalar seçilir. Daha sonra, transgenin% 100 kalıtımını doğrulamak için sekiz F3 hayvanı ayrı ayrı kültürlenir.
Bu yöntemin ana dezavantajları şunlardır:
<ol type="i">
	<li>%≥75 transgenik F2 dölleri için birkaç yüz F1 plakasından oluşan bir görsel ekran gerektirir, bu da entegre olmayan ekstrakromozomal dizilerin değişken ve öngörülemeyen iletim yüzdesi nedeniyle zaman alıcıdır. Alternatif olarak, F1 plakalarının taranmasını önlemek için, P0 hayvanlarının ışınlanmasından sonra birkaç müteakip açlık aşaması gerçekleştirilebilir; ardından 100 transgenik hayvanın seçilmesi ve %100 transgenik döllerin taranması3.</li>
	<li>%60'tan daha yüksek bir kromozomal dizi iletim yüzdesi sergileyen suşlar için uyarlanmamıştır, çünkü bu yüzdeyi %75'ten ayırt etmek zordur.</li>
	<li>sadece nispeten düşük iletim hızına sahip suşlar kullanılabildiğinden, çok sayıda ışınlanmış transgenik P0 hayvanının yanı sıra çok sayıda F1 ve F2 hayvanının gözlemlenmesi gereklidir, bu da oldukça zaman alıcıdır ve önemli sayıda plaka gerektirir.</li>
</ol>
Solucanların ışınlanması muhtemelen DNA'da çift iplikli kırılmalara neden olur ve kromozom dışı dizilerin kromozomlara entegrasyonu DNA onarımı sırasında gerçekleşir. Bu nedenle, başarılı ışınlama aracılı entegrasyon elde etme şansının, ekstrakromozomal bir dizi taşıyan germ hattı hücrelerinin sayısı ile doğru orantılı olması muhtemeldir. Yüksek iletim hızına sahip suşlar,2'de önerildiği gibi düşük iletim hızına sahip suşlardan daha fazla transgenik DNA dizisi içerebilir ve ekstrakromozomal diziler taşıyan daha fazla sayıda germ hattı hücresi sergileyebilir. Bu nedenle, yüksek iletim hızına sahip hatlarda, transgenlerin entegre edilmesinin, düşük iletim hızına sahip hatlara göre daha kolay olabileceğini düşündük. Bununla birlikte, standart protokol, transgenlerin yüksek iletim frekansı ile entegre edilme olasılığını dışlar, çünkü entegre olmayan bir ekstrakromozomal diziye sahip transgenik hayvanların yüzdesi, transgenin genoma heterozigot bir entegrasyonunu taşıyan bir F1 hayvanının dölünün yüzdesinden neredeyse ayırt edilemez (Şekil 1).
Burada, belirli bir transgen için, ultraviyole (UV) ışıkla ışınlamadan sonra geri kazanılan entegre hatların sayısının, entegre olmayan dizinin ilk iletim yüzdesine bağlı olduğunu gösteriyoruz. UV ışınlaması aracılı transgen entegrasyonu için, özellikle yüksek oranda transgen dizisi iletimi sergileyen hatlarla ilgili olan gelişmiş bir protokol sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>NGM (nematod büyüme ortamı) hazırlığı için</td> <td>Agar</td><td>Prolabo</td><td>20768.292</td> (6,7)</tr><tr><td>NaCl</td><td>Chimie-Plus</td><td>40045</td><td>NGM hazırlığı için</td></tr><tr><td>Bacto-peptone</td><td>BD</td><td>211820</td><td>NGM hazırlığı için</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>NGM hazırlığı için</td> <td>Roth</td><td>3904-1</td></tr><tr><td>K2HPO4</td>NGM hazırlığı için <td>Prolabo</td><td>26930.293</td><td>NGM hazırlığı için</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Roth</td><td>P027.2</td><td>NGM hazırlığı için</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>NGM hazırlığı için</td> <td>Prolabo</td><td>22317.297</td></tr><tr><td>NGM hazırlığı için</td><td>Kolesterol</td><td>Rectapur</td><td></td></tr><tr>OP50 kültürü için<td>LB</td> suyu <td>Sigma</td><td>L3022</td><td> bakteri</td></tr><tr><td>EKİPMANLARI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV çapraz bağlayıcı</td><td>Fischer Bilimsel</td><td></td><td>Dalga Boyu 254 nm</td></tr><tr><td>Mikroskop SteREO Discovery V8</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları, 60 mm</td><td>CML</td><td>BPS55E6</td><td></td></tr><tr><td>Platin tel 0,25 mm</td><td>Alfa Aesar</td><td>7440-06-4</td><td>Solucanlar için bir seçim yapmak için (7)</td></tr></tbody></table>

yüksek İletim hızına sahip ekstrakromozomal dizileri c. elegans genomuna entegre etmek İçin hızlı bir protokol

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Caenorhabditis elegans'ın sinsityal gonadının sitoplazmasına DNA enjekte etmek, ekstrakromozomal dizilerin bir sonraki nesle kısmi ve değişken iletim hızlarını sergileyen transgenik çizgiler oluşturmak için kullanılan ana tekniktir. Ek olarak, transgenik hayvanlar mozaiktir ve transgeni değişken sayıda hücrede ifade eder. Ekstrakromozomal diziler, transgenin %100 iletim hızına sahip mozaik olmayan transgenik suşlar oluşturmak için UV ışınlaması kullanılarak C. elegans genomuna entegre edilebilir. Bu kapsamda, UV ışınlanmış transgenik hayvanların F1 soyları, transgenin heterozigot bir entegrasyonunu taşıyan hayvanlar için taranır ve bu da F2 döllerine %75'lik bir Mendel iletim oranına yol açar. Bu yöntemin zorluklarından biri, bir popülasyondaki transgen iletim yüzdesini entegrasyondan önce (% X transgenik hayvanlar) ve sonra (% ≥75 transgenik F2 hayvanları) arasında ayrım yapmaktır. Bu nedenle, bu yöntem,% 75'lik Mendel ayrımından önemli ölçüde daha düşük bir transgenik hayvan yüzdesi ile entegre olmayan bir transgenik hattın seçilmesini gerektirir. Sonuç olarak, bir sonraki nesle %≤60 kromozomal dizi iletim hızına sahip entegre olmayan transgenik hatlar genellikle entegrasyon için tercih edilir ve yüksek iletimli suşlarda transgen entegrasyonu zordur. Burada, yüksek derecede ileten transgenik hatlar kullanıldığında (% ≥80) ekstrakromozomal dizilerin genoma entegrasyonunun etkinliğinin arttığını gösteriyoruz. Tarif edilen protokol, yüksek oranda ekstrakromozomal dizi iletimi sergileyen transgenik solucanların UV ışınlamasından sonra genoma homozigot transgen entegrasyonu ile birkaç bağımsız hattın kolayca seçilmesine izin verir. Ayrıca, bu yöntem oldukça hızlı ve düşük malzeme tüketir. Belirli bir entegre transgeni ifade eden farklı çizgilerin hızlı bir şekilde üretilmesi olasılığı, gen ekspresyon paterni ve regülasyonu, protein lokalizasyonu ve aşırı ekspresyonunun yanı sıra hücre altı belirteçlerin geliştirilmesine odaklanan çalışmalar için büyük ilgi görmektedir.

Ekstrakromozomal dizileri yaklaşık aynı frekansta (%50-60) aktaran iki farklı hattaki transgenlerin entegrasyonları, standart ve geliştirilmiş protokoller kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Tablo 1). Standart protokol, 91 transgenik L4 hayvanın UV radyasyonuna maruz bırakılmasından sonra üç bağımsız entegre hattın geri kazanılmasını sağlarken, geliştirilmiş protokol 30 transgenik L4 hayvanın UV radyasyonuna maruz bırakılmasından sonra bir entegre hattın geri kazanılmasını sağlamıştır. Bu durum, entegrasy...

Bu protokol, ultraviyole (UV) ışınlaması kullanılarak transgenik ekstrakromozomal dizilerin Caenorhabditis elegans genomuna entegrasyonu için hızlı ve düşük malzeme tüketen bir prosedürü tanımlar. Ayrıca, bu protokol özellikle ekstrakromozomal dizileri yüksek oranda ileten transgenik hatlar için çok uygundur.

Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Bu prosedürün genel amacı, ultraviyole ışınlama kullanarak transgenik ekstrkromozomal dizileri serratus elegance genomuna entegre etmektir. Öncelikle, mümkün olan en yüksek iletim oranına sahip, ideal olarak %80'den fazla olan transgenik hattı seçin. Ardından, seçilen transgenik L4 larvalarına UV ışınlaması uygulayın ve seçilen her bir F1 plakasından dört adet floresan transgenik F2 hayvanı ayırın. Sonrasında, %100 floresan transgenik olanları belirlemek için F2 plakalarını tarayın.F3 solucanlarını belirleyin. Nihayetinde, F3 neslinden floresan özellik gösteren hayvanların seçilmesi, transgenin %100 kalıtımını gösterebilir. Bu deneysel yaklaşım, ekstra kromozom dizilerini yüksek oranda aktaran transjenik hatlar için oldukça uygundur.Prosedürü, laboratuvarımızdan teknisyen Stephanie Belman gerçekleştirecek. Nematod büyüme ortamı içeren 500 adet büyük Petri kabı ile başlayın. Her plakaya 0,3 milliliters doymuş isia coli ekin.OP 50 kültürü. Entegre edilecek her bir transgenik hat için transmisyon oranını değerlendirin. Floresan stereoskop kültürü altında 10 floresan yetişkin bireyi 10 ayrı kültür plakasına seçerek yerleştirin.Hayvanlar, genetik arka planın üremesine izin veren bir sıcaklığa ayarlanmış solucan inkübatörüne yerleştirilir. Co-enjeksiyon belirtecinin hangi gelişim aşamasında ifade edildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak en iyi şekilde nasıl gözlemlenebileceğini değerlendirmek için progeniler her gün izlenir. Floresan progenilerin yüzdesi belirlenerek progenilerin aktarım oranı değerlendirilir.Transgen entegrasyonu için, en yüksek aktarım oranına sahip transgenik hattı seçin. L4 larva evresinde senkronize edilmiş bir transgenik hayvan popülasyonu elde edin. Entegrasyon için, 30 floresan GRA yetişkini beş kültür plağına ayırın.Solucanlar 15 °C'de üç ila dört saat boyunca yumurta bıraktıktan sonra, plaka başına en az 30 yumurtanın varlığını kontrol edin ve ardından yetişkinleri plakalardan uzaklaştırın; hayvanları, döller L4 larva evresine ulaşana kadar bir solucan inkübatöründe kültüre edin. İçinde 15 ila 20 floresan transgenik L4 hayvan bulunan her plakayı, kapakları çıkarılmış halde bir UV crosslinker'a yerleştirin ve solucanları recovery için ışınlayın. Işınlanan solucanları 15 °C'de gece boyunca inkübe edin.Elimizdeki canlı hayvan sayısını kontrol edin. Verimli bir ışınlama için yaklaşık %80 ila %90'lık bir sağkalım oranı uygundur. Işınlanmış hayvanları, progeniler ortak enjeksiyon marker ekspresyonunun gözlemlenebileceği gelişimsel evreye ulaşana kadar 15 ila 25 °C'de büyütün.Tekil floresan F1 hayvanlarını ayrı kültür plakalarına aktarın. Bu F1 plakalarını, kullanılan ko-marköre bağlı olarak, progenyler floresan F2 hayvanlarının gözlemlenebileceği uygun bir evreye gelene kadar 15 ila 25 degrees Celsius arasında tutun. Bu özel durumda, solucanları yetişkin olarak gözlemledik ve şu durumdaki tüm F1 plakalarını eledik: birincisi, F1 hayvanının steril olduğunu veya öldüğünü gösteren tek bir progeniyin olduğu veya hiç progeniyin olmadığı durumlar; ikincisi ise F1 hayvanının transgeni beklenen oranda aktarmadığını gösteren, hiç floresan F2 hayvanının olmadığı veya yalnızca birkaç tane olduğu durumlar.Seçilen her F1 plağından dört adet floresan transgenik F iki hayvan ayırın. Floresan transgenler kullanırken, yüksek düzeyde floresans gösteren F iki solucanları seçin; çünkü bu durum, hayvanların entegre dizi için homozigot olduğunu gösterebilir. F iki hayvanları seçerken, bir sonraki adımda yanlış negatif sonuçlardan kaçınmak için yumurta veya larvaların beraberinde taşınmamasının kritik olduğunu unutmayın.F2 hayvanları büyütüldükten sonra, F2 plakaları %100 floresan transgenik F3 solucanları için taranır. Tek bir floresan olmayan solucanın varlığı plakanın atılması gerektiğini gösterdiğinden tarama oldukça hızlıdır; transgenin %100 kalıtımını doğrulamak için seçilen plakalardan sekiz adet floresan F3 hayvanı ayrıştırın. Mümkünse, birkaç bağımsız entegre transgenik suş saklayın.Ekstra kromozomal dizileri yaklaşık olarak aynı frekansta ileten iki farklı hatta transgen entegrasyonları gerçekleştirilmiştir. Standart ve geliştirilmiş protokoller kullanılarak, entegre edilen hat başına gereken süre ve plaka sayısı geliştirilmiş protokolde optimize edilmiştir. Ardından, entegre edilmemiş bir hatta daha yüksek transgen iletim oranının, transgenin genomuna entegrasyonunu kolaylaştırdığı hipotezini test ettik.Geliştirilmiş protokol kullanılarak, farklı iletim oranlarına sahip hatlarda belirli bir transgen entegre edilmiş ve en yüksek iletim oranına sahip hat seçilmiştir. Sadece 90 seçilmiş F1 hayvandan üç entegre hat elde edilirken, %50 ila %60 oranında iletim gösteren transgenik hat için 110 seçilmiş F1 hayvandan bir entegre hat elde edilmiştir. Bu prosedürü takiben; gen ekspresyonunun, paterninin ve düzenlemesinin belirlenmesi, protein lokalizasyonu ve protein aşırı ekspresyonu veya subselüler markörlerin geliştirilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için farklı yöntemler uygulanabilir.

a-rapid-protocol-for-integrating-extrachromosomal-arrays-with-high

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

C. elegans Genomuna Yüksek İletim Oranı ile Ekstrakromozomal Dizilerin Entegrasyonu için Hızlı Bir Protokol

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Sıvı tabanlı kültür ve dağıtımı için bir...

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Mikroarray analizi genetik ekspresyon profillerini belirlemek için...

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Burada uzun süreli koku adaptasyon moleküler okuma...

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

Bu videoda, PCR taraması ile tek bir nematodun genetik bir belirteç için hızlı bir şekilde taranması için kullanılan bir teknik açıklanmaktadır. Örnek protokolde, CRISPR tabanlı genom düzenlemeyi tarıyoruz.

Tek Solucan PCR: Genomik DNA'yı Çıkarmak ve Çoğaltmak için Bir Yöntem

Transgenlerin mikroenjeksiyonu genellikle büyük ekstrakromozomal dizilere sahip C. elegans suşları ile sonuçlanır, bu da transgenin değişken ekspresyonu ve iletimi ile sonuçlanır. UV Işınlaması, dizinin kromozomal entegrasyonunu ve daha kararlı transgen iletimini indükleyebilir.

UV Işınlaması: Kromozomal Dışı Dizileri Entegre Etmek İçin Bir Yöntem

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Burada, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sının ticari olarak temin edilebilen bir doku kiti kullanılarak bir veya birkaç hayvandan basit ve nispeten hızlı bir şekilde izole edilmesinin bir açıklaması sunulmaktadır. Elde edilen gDNA preparatı PCR için uygun bir şablondur.

Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu

Bu protokol, Caenorhabditis elegans'ta mayoz bölünme sırasında çaprazlama frekanslarını ve dağılımını ölçmek için bir yöntem sağlar. Kromozomların kökenini belirlemek için gerçek zamanlı PCR ile tek nükleotid polimorfizm genotiplemesi kullanıldı. 4 noktalı haritalama, her kromozomun sol kol, merkez ve sağ kol bölgelerinin çapraz dağılımlarını belirlemeye izin verdi. ...

Gerçek Zamanlı PCR Kullanılarak SNP Genotipleme ile Caenorhabditis elegans Mayozunda Çaprazlama Sıklığı ve Dağılımı

Burada, sadece 30 μL solucan pelleti kullanılarak L4-aşama Caenorhabditis elegans tüm solucanında uygulanacak hızlı ve basit bir ATAC-seq protokolünü sunuyoruz.

Bütün Caenorhabditis elegans L4 larvalarda kromatin erişilebilirlik profili

Caenorhabditis elegans germ hattında endogen floresan etiketleme için CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon iş akışı, in vivo protein lokalizasyon analizi için homozigot knock-in çizgileri elde etmek.

Caenorhabditis elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı Endojen Floresan Etiketleme Germline-Spesifik Genlerin

Öğrenin, Caenorhabditis elegans genomuna ekstrakromozomal dizileri UV ışınlaması ile entegre etmek için hızlı ve düşük malzeme tüketen bir protokol. Bu yöntem, yüksek iletim hızına sahip transgenik hatlar için özellikle etkilidir.

Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol

Daha fazla video keşfet