Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol

Bu prosedürün genel amacı, ultraviyole ışınlama kullanarak transgenik ekstra kromozomal dizileri serratus elegance genomuna entegre etmektir. İlk olarak, mümkün olan en yüksek iletim hızına sahip, ideal olarak %80'den büyük olan transgenik hattı seçinArdından, seçilen transgenik L'yi dört larva, seçilen her F1 plakasından floresan transgenik F iki hayvandan dördünü ayırarak UV ışınlayın. Sonraki ekran,% 100 floresan transgenik için F iki plaka.

F üç solucan. Sonuç olarak, F üç neslinden bir floresan hayvanın seçilmesi, transgenin %100 kalıtımını gösterebilir. Bu deneysel yaklaşım, ekstra kromozom dizilerini yüksek oranda ileten transgenik hatlar için çok uygundur.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Stephanie Belman olacaktır. Nematod büyümesi içeren 500 büyük Petri kabı ile başlayın. Orta Her plakayı 0.3 mililitre doymuş isia coli ile tohumlayın.

OP 50 kültürü. Her bir transgenik hat için entegre edilecek transgenik hattın iletim hızını değerlendirin. Bir floresan stereoskop kültürü altında 10 ayrı kültür plakasına 10 floresan yerçekimi yetişkini seçin.

Bir solucan kuluçka makinesindeki hayvanlar, genetik arka planın üremesine izin veren bir sıcaklığa ayarlanmıştır. Ko enjeksiyon belirtecinin hangi gelişim aşamasını ifade ettiğini ve en iyi floresan oskopi kullanılarak gözlemlenebileceğini değerlendirmek için her gün dölleri izleyin. Floresan döl yüzdesini belirleyerek döllerin iletim hızını değerlendirin.

Transgen entegrasyonu için, en yüksek iletim hızına sahip transgenik hattı seçin. L dört larva aşamasında senkronize edilmiş bir transgenik hayvan popülasyonu elde edin. Entegrasyon için, beş kültür plakasına 30 floresan GRA yetişkini seçin.

Solucanlar 15 santigrat derecede üç ila dört saat boyunca yumurta bıraktıktan sonra, plakada en az 30 yumurta olup olmadığını kontrol edin ve ardından yetişkinleri plakalardan çıkarın, yavrular L dört larva aşamasına ulaşana kadar hayvanları bir solucan kuluçka makinesinde kültürleyin. 15 ila 20 floresan transgenik L dört hayvan içeren her bir plakayı, kapakları çıkarılmış bir UV çapraz bağlayıcıya yerleştirin, geri kazanım için solucanları ışınlayın. Işınlanmış solucanları gece boyunca 15 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Elimizde yaşayan hayvanların sayısını kontrol edin. Yaklaşık% 80 ila 90'lık bir sağkalım oranı, verimli bir ışınlama için uyarlanmıştır. Işınlanmış hayvanları, döller gelişim aşamasına ulaşana kadar 15 ila 25 santigrat derecede büyütün, bu da koenjeksiyon belirteç ifadesinin gözlemlenmesine izin verir.

Tek floresan F1 hayvanlarını ayrı kültür plakalarına aktarın. Bu F1 plakalarını, kullanılan ortak marköre bağlı olarak, döl floresan F iki hayvanın gözlemlenmesi için uygun bir aşamaya ulaşana kadar 15 ila 25 santigrat derecede tutun. Bu özel durumda, yetişkinler olarak solucanların, F1 hayvanının kısır olduğunu veya öldüğünü gösteren bir, döl olmayan veya F1 hayvanının transgeni beklenen oranda iletmediğini gösteren iki hayır veya sadece birkaç floresan F iki hayvan sergileyen tüm F1 plakalarını attığını gözlemledik.

Seçilen her F1 plakasından dört floresan transgenik F, iki hayvan ayırın. Floresan transgenleri kullanırken, yüksek düzeyde floresan içeren F iki solucan seçin, çünkü bu, bu hayvanların entegre dizi için homozigot olduğunu gösterebilir. F iki hayvan seçerken, yanlış negatiflerden kaçınmak için yumurta veya larva taşımamanın kritik olduğunu unutmayın Bir sonraki adımda.

Büyüdükten sonra, F iki hayvan,% 100 floresan transgenik F üç solucan için F iki plakayı tarar. Floresan olmayan tek bir solucanın varlığı, plakanın atılması gerektiğini gösterdiğinden, transgenin% 100 kalıtımını doğrulamak için seçilen plakalardan sekiz floresan F üç hayvanı ayırdığı için ekran oldukça hızlıdır. Mümkünse, birkaç bağımsız entegre transgenik suş bulundurun.

Transgenlerin iki farklı hatta entegrasyonları, yaklaşık aynı frekansta ekstra kromozomal diziler ileterek gerçekleştirildi. Standart ve geliştirilmiş protokoller kullanılarak, entegre hat başına gerekli olan zaman ve plaka sayısı, geliştirilmiş protokolde optimize edilmiştir. Daha sonra, entegre olmayan bir hatta daha yüksek bir transgen iletim hızının, transgenin genoma entegrasyonunu kolaylaştırdığı hipotezini test ettik.

Belirli bir transgen, en yüksek iletim hattı için geliştirilmiş protokol kullanılarak farklı oranlarda iletim yapan hatlara entegre edildi. Sadece 90 seçilmiş F1 hayvanından üç entegre hat geri kazanılırken, %50 ila %60 oranında iletim yapan transgenik hat için 110 seçilmiş F1 hayvanından bir entegre hat geri kazanıldı. Bu prosedürü takiben, gen ekspresyonunun belirlenmesi, patern ve regülasyon, protein lokalizasyonu ve protein aşırı ekspresyonu veya hücre altı belirteçlerin geliştirilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için farklı yöntemler uygulanabilir.