Ifade İyon Kanallarının Çalışması için özel Duyusal Nöron Populasyonlarının Belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, retrograd boya etiketlemesi ile afferent nöronları tanımlamak ve bu nöronlardaki iyon kanallarını yama kelepçe elektrofizyolojisi ve immünokimya kullanarak incelemektir. Bu, innerve edici afferent nöronları etiketlemek için önce DAI'nin hedef dokuya enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, afferent nöronları dorsal kök gangliyonlarından izole etmektir.

Daha sonra, etiketli nöronlar, kapılı iyon kanallarını kaydetmek için yama klemplenir, son adım, immünokimya kullanılarak etiketli nöronlarda ifade edilen iyon kanallarını tanımlamaktır. Sonuç olarak, yama, kelepçe ve immünokimyanın bir kombinasyonunu kullanarak, afferent nöronlardaki iyon kanallarının fonksiyonel özelliklerinin yanı sıra ekspresyon modelini de tanımlayabiliyoruz. Bu yöntemin mevcut diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, non-invaziv bir yöntem olması ve kullandığımız DAI, DAI I'in nöronal terminaller tarafından hızlı bir şekilde alınmasıyla bilinmesidir.

Nöronlar arasında transfer eksikliği ve enjekte ettiğimiz nöronlar içinde uzun süreli kalıcılıklar. Prosedürü göstermek ben ve boya enjeksiyonu için laboratuvarımızdan araştırma teknisyeni Stephanie olacak. İlk olarak, anestezi uygulanmış farenin her iki bacağındaki baldır bölgesindeki kılları elektrikli bir tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin.

Daha sonra, bir CC steril şırıngayı 200 mikrolitre% 1.5 Dai çözeltisi ile doldurun. İğneyi her gastro kasının uzun eksenine paralel olarak yavaşça sokun ve iğneyi kastan çekmeden önce kas içine 100 mikrolitre dai enjekte edin. Boyanın uçtan daha fazla akmamasını sağlamak için şırınga pistonunu geri çekin.

10 saniye bekleyin ve ardından iğneyi kastan çekin. Boya dağılımının diseksiyon için ayarlanması için dört ila beş gün gerekir. Buzun üzerine 10 mililitre HBSS, 35 milimetre Petri kabı ve 100 milimetre Petri kabı içeren bir beher yerleştirin.

Daha sonra, yedi miligram kollajenaz, bir miligram DNA ve 10 miligram tripsin ön ısıtması, 37 santigrat dereceye kadar çalkalayan bir su banyosu tartın ve banyoda 10 mililitre EBSS içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünü ısıtın. Diseksiyondan önce fareye ötenazi yaptıktan sonra, hayvanın sırtındaki cildi hızlı bir şekilde kesin. Ardından, daha iyi maruz kalma için omurga boyunca bağ ve kas dokusunu çıkarın.

Daha sonra, vertebral kolonun bel bölümünü çıkarın. Ardından, izole edilmiş vertebral sütunu 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. Preparasyonu nemli ve soğuk tutmak için steril bir mera pipeti kullanarak soğutulmuş HBSS solüsyonu uygulayın.

Kasları vertebral kolonun yanlarından kesin. Kemiği nazikçe çıkarmak ve dorsal kök gangliyonlarını içeren girintileri kapatmak için rongeurs veya makas kullanarak dorsal laminektomi yapın. Defalarca. Bu işlem sırasında buz gibi soğuk HBSS uygulayın.

Mikroskop altında, periferik ve merkezi sinirleri keserek DRG'yi izole edin ve ganglionların işlenmesini kolaylaştırmak için bir ila iki milimetre sinir bırakın. Daha sonra izole edilmiş DRG'yi buz gibi soğuk HBSS tamponu içeren 35 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. L dört ve L beş DRG'nin tümü izole edilene kadar prosedürleri tekrarlayın.

Mikro makas ve forseps kullanarak fazla sinirleri ve kan damarlarını çıkarın. Enzimlere daha iyi maruz kalmak için DRG'yi kesin, ancak DRG nöron ayrışması için DRG'yi kılıfından çıkarmayın. Enzimleri ılık EBSS ortamına ekleyin, ardından çözünmesi için girdap yapın ve sterilize edin.

Daha sonra tüm DRG'yi steril bir mera borusu kafası ile enzim çözeltisine yerleştirin. Bundan sonra, şişeyi sıkıca kapatmadan önce şişeyi 60 saniye boyunca %95 oksijen ve %5 CO2 ile köpürtün. Daha sonra şişeyi 37 santigrat derece çalkalanan su banyosunda 240 RPM'de 60 dakika inkübe edin.

Kuluçka sonunda kuvvetli bir şekilde. DRG'yi steril koşullar altında ayırmak için şişeyi 50 kez çalkalayın. Enzimatik aktiviteleri durdurmak için şişeye beş mililitre MEM plus ekleyin.

Şişe içeriğini steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve altı dakika boyunca 16 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve atın. Numune tritratına pipet ile hafifçe beş mililitre MEM plus ekleyin.

Pelet tekrar santrifüjleme adımını kırmak için, süpernatanı çıkarın ve atın ve 500 mikrolitre MEM ekleyin ve bir hücre süspansiyonu yapmak için bir pipet üzerine bir mililitre pipet ucuyla hafifçe tritrate edin. Bundan sonra, boş, steril 35 milimetrelik bir tabağa polilisin kaplı bir cam kapak parçası yerleştirin. Ardından, kapak fişinin ortasına bir damla hücre süspansiyonu ekleyin.

Hücre çözeltisi tükenene kadar bu işlemi tekrarlayın. 35 milimetrelik tabakları bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin, böylece nöronların bir saat sonra kapak kızaklarına dudaklarına yapışmasını sağlayın. Her tabağa iki mililitre daha fazla ortam ekleyin ve yama kelepçesi kaydı yapmak için bunları inkübatöre geri koyun.

İlk olarak, epi floresan ile bir mikroskop kullanarak DRG nöronları etiketli boyayı tanımlayın. Ardından, cam elektrodu iç çözelti ile doldurun. Sıkışan baloncukları çıkarmak için hafifçe dokunun.

Ardından elektrodu elektrot tutucusuna yerleştirin. Bir mikro manipülatör kullanarak elektrodu hücreye indirin. Elektrot hücreye temas ettiğinde, sıkı bir sızdırmazlık oluşana kadar emme borusundan hafifçe emme uygulayın.

Ardından membran voltajını istenen tutma potansiyelinde sıkıştırın. Daha güçlü emiş uygulayarak tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonunu elde edin. Elektrotun ucundaki membran yamasını çıkarmak için, tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonu kurulduktan sonra kaydı başlatın.

Bu işlemde nöronları %4 para formaldehit ile lamel üzerine bir saat süreyle sabitleyin. Daha sonra nöronlara PBS'de %2 ile 20 dakika boyunca nüfuz edin. Daha sonra, hücreleri bir saat boyunca bloke edici çözelti içinde inkübe edin.

Test hücreleri, gece boyunca bloke edici çözelti artı birincil antikor içinde inkübe edilir. Nöronların kontrol seti, herhangi bir primer antikor olmadan bloke edici çözelti içinde gece boyunca inkübe edilmeye bırakılır. Ertesi gün, kapak fişlerini PBS tamponu ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın, ardından bağlanmamış primer antikoru çıkarmak için her biri% 1 ara 20 ile beş dakikalık iki yıkama yapın.

Daha sonra testi ve kontrol kapak fişlerini, görselleştirmeye izin vermek için birincil antikora bağlanan uygun floresan etiketli ikincil antikor ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Bundan sonra, fazla ikincil antikoru çıkarmak için kapak fişlerini PB S3 ile her biri beş dakika boyunca yıkayın. Ardından, montaj ortamını kullanarak kapak kızaklarını temiz bir cam kızak üzerine monte edin.

Ardından, yerine sabitlemek için kapak kaymasının kenarına şeffaf oje sürün. Kuruduktan sonra, nöronları görselleştirin ve floresan mikroskobuna eşlik eden yazılımı kullanarak görüntüleri yakalayın. Bu, gastro kasına Dai enjeksiyonunun ve kastan DRG'ye retrograd taşınmanın bir temsilidir.

L dört ve L beş DRG burada etiketlenmiştir. Afferent nöronlar parlak alan görüntüsünde gösterilir ve bu floresan görüntü, kas afferent nöronu etiketli bir boya gösterir. Bu histogram, duyusal nöronların DII floresan yoğunluğunu gösterir.

Büyük tepe etiketsiz nöronlardandır ve ortalama yoğunluğu ve standart sapmayı belirlemek için bir Gauss denklemi ile donatılmıştır. Kesikli dikey çizgi, DAI etiketleme eşiğini temsil eder. Histogram, 167'si dai ile etiketlenmiş 1047 nörondan gelen verileri içerir.

İşte membran voltajını iyi kontrol eden temsili bir kas afferent nöronu. Solda eksi 20, eksi 10 ve sıfır milivolttaki sodyum akımları ve sağda akım voltaj ilişkisi gösterilmiştir. Bu prosedürü denerken, DRG'leri hızlı ama nazikçe incelemeyi ve hazırlığı buz kodu hbss'de tekrar tekrar nemli tutmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, fizyolojideki rollerini anlamak için diğer efferent nöronlar etiketlenebilir ve tanımlanabilir.