Name: Ifade İyon Kanallarının Çalışması için özel Duyusal Nöron Populasyonlarının Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Öğrenin, retrograd boya etiketleme ve yama kelepçesi elektrofizyolojisi kullanarak duyusal nöronları belirlemeyi ve iyon kanallarını incelemeyi. Bu yöntem, aferent nöronların fizyolojik özelliklerini anlamak için araştırmacılara kapsamlı bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe AR059397 (KSE) tarafından finanse edilmiştir.

Not: Tüm hayvan çalışmaları, kurumsal ve hayvan bakımı yönergelerine göre yapılmalıdır.
1. Hayvanın Hazırlanması ve Etiketlenmesi
<ol>
	<li>Sıçanları uyuşturun: Ketamin (50 mg / kg vücut ağırlığı), ksilazin (5 mg / kg) ve asepromazin (1 mg / kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu kullanarak bir sıçanı (tipik olarak 150-400 g) anestezize edin. Ayağınızı sıkıştırarak refleksleri kontrol edin, yanıt gelmeyene kadar bekleyin. Anestezi yanıtı hayvanlar arasında farklılık gösterdiğinden, ağrı reflekslerini test ederek anesteziklerin etkisini belirlemek en iyisidir.</li>
	<li>DiI Çözeltisi: DiI tozunu tartın ve% 1.5'lik bir çözelti (15 mg / ml) elde etmek için steril% 100 DMSO içinde çözün. Solüsyonu kullanana kadar oda sıcaklığında kuru bir atmosferde saklayın.</li>
	<li>DiI Enjeksiyonları: Anestezi uygulanmış farenin her iki bacağındaki baldır bölgesindeki kılları elektrikli bir tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin.
	<ol>
		<li>1 ml'lik steril bir şırıngayı (27 G iğnede 11/4) 200 μl% 1.5 DiI çözeltisi ile doldurun. İğneyi her bir gastroknemius kasının uzun eksenine paralel olarak yavaşça yerleştirin ve kastan çekilmeden iğneyi kasın dışına yavaşça geri çekerken (~ 10 saniye) kas içine 100 μl DiI enjekte edin.</li>
		<li>İğneyi kastan çekmeden önce, boyanın uçtan daha fazla akmamasını sağlamak için şırınga pistonunu geri çekin, 10 saniye bekleyin ve ardından iğneyi kastan geri çekin. Bu adım, DiI'nin iğneden cilde sızmasını önler, bu da kutanöz afferentleri etiketleyebilir.</li>
		<li>Diğer bacak için tekrarlayın.</li>
		<li>DiI'nin kastan DRG'ye taşınması için 4-5 gün bekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Diseksiyon ve Nöronal İzolasyon
<ol>
	<li>Çözümleri:
	<ol>
		<li>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (HBSS) ve Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisini (EBSS) üreticinin talimatlarına göre hazırlayın, süzün, sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>Kültür ortamı (MEM Plus): 89 ml minimal esansiyel ortam (MEM), 10 ml fetal sığır serumu (FBS), 1 ml penisilin-streptomisin solüsyonunu karıştırın, süzerek sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>Polilisin çözeltisi: poli-L-lizin hidrobromür tozunu (10 mg / 100 ml) 0.1 M sodyum borat çözeltisi, pH 8.4 içinde çözün, filtreleyin, sterilize edin ve alikotları -20 ° C'de saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lamellerin kaplanması
	<ol>
		<li>Cam lamelleri (12 mm yuvarlak) %70 etanolde 3-4 saat temizleyin ve steril kültür davlumbazında havayla kurutun.</li>
		<li>Kurutulmuş lamelleri polilisin çözeltisi O/N içine yerleştirin.</li>
		<li>Polilisin çözeltisinden çıkarın ve fazla polilizini çıkarmak için steril damıtılmış suda 2 kez 5 dakika yıkayın.</li>
		<li>Lamelleri ayırın, kültür davlumbazında kurutun ve 4 ° C'desaklayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Diseksiyon için ayarlama
	<ol>
		<li>Buzun üzerine 10 ml HBSS, 35 mm Petri kabı ve 100 mm Petri kabı içeren bir beher yerleştirin.</li>
		<li>Enzimleri tartın: 7 mg kollajenaz, 1 mg DNAse ve 10 mg tripsin.</li>
		<li>Çalkalanan bir su banyosunu önceden 37 °C'ye ısıtın ve ısıtmak için 10 ml EBSS içeren 15 ml'lik bir santrifüj tüpünü banyoya yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Diseksiyonu:
	<ol>
		<li>IACUC onaylı bir protokole göre sıçan kurban edin. Sıçanı ötenazi yapmak için Carbon dioksit kullanıldı.</li>
		<li>Sırttaki cildi keserek açarak sırtı hızlı bir şekilde çıkarın, daha iyi pozlama için omurga boyunca bağ ve kas dokusunu çıkarın ve vertebral kolonun bel bölümünü çıkarın (torasik bölgenin iliak kemiğe kadar olan ucu; Şekil 1).</li>
		<li>İzole edilmiş vertebral kolonunu 100 mm'lik Petri kabına yerleştirin ve steril bir Pasteur pipeti kullanarak, preparatı nemli ve soğuk tutmak için soğutulmuş HBSS solüsyonu uygulayın.</li>
		<li>Kasları vertebral kolonun yanlarından kesin. Rongeurs veya makas kullanarak dorsal laminektomi yapın ve DRG'yi içeren girintileri çevreleyen kemiği nazikçe çıkarın.</li>
		<li>Bu işlem sırasında tekrar tekrar buz gibi HBSS (~ 1 ml) uygulayın.</li>
		<li>Periferik ve merkezi sinirleri keserek DRG'yi izole edin (ganglionların işlenmesini kolaylaştırmak için 1-2 mm sinir bırakın)</li>
		<li>İzole edilmiş DRG'yi buz gibi soğuk HBSS tamponu içeren 35 mm'lik Petri kabına yerleştirin.</li>
		<li>Tüm L-4 ve L-5 DRG izole edilene kadar tekrarlayın. Torasik DRG, DiI etiketlemesi için negatif bir kontrol olarak izole edilebilir ve ayrı olarak işlenebilir.</li>
		<li>İzole DRG'li çanağı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve mikro makas ve forseps kullanarak fazla sinirleri ve kan damarlarını çıkarın.</li>
		<li>Enzimlere daha iyi maruz kalmak için DRG'yi kesin, ancak DRG'yi kınından çıkarmayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DRG nöron ayrışması:
	<ol>
		<li>Enzimleri ılık EBSS ortamına ekleyin (su banyosunda tutulur). Çözünmesi için kısa bir süre çalkalayın ve süzgeçten süzerek sterilize edin.</li>
		<li>Steril bir Pasteur pipeti kullanarak, tüm DRG'yi enzim çözeltisine yerleştirin. HBSS enzim karışımını seyrelteceği için DRG ile eklenen HBSS hacmini en aza indirin. Şişeyi sıkıca kapatmadan önce şişeyi %95O2 ve %5 CO2 ile 60 saniye boyunca gazlayın.</li>
		<li>Şişeyi 37 °C'ye ayarlanmış çalkalama suyu banyosunda 240 rpm'de 60 dakika inkübe edin.</li>
		<li>İnkübasyonun sonunda, DRG 50'i ayırmak için şişeyi 5x'i kuvvetlice sallayın.</li>
		<li>Steril koşullar altında, enzimleri durdurmak için şişeye 5 ml MEM Plus ekleyin.</li>
		<li>Şişe içeriğini 15 ml'lik steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve 6 dakika boyunca 16 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı çıkarın ve atın, numuneye 5 ml MEM Plus ekleyin. Peleti parçalamak için pipetle hafifçe ezin.</li>
		<li>Santrifüjleme adımını tekrarlayın, süpernatanı çıkarın ve atın ve 500 μl MEM Plus ekleyin. Bir hücre süspansiyonu yapmak için bir pipet üzerinde 1 ml'lik bir pipet ucuyla hafifçe ezin.</li>
		<li>Bir polilizin kaplı cam lameti 35 mm'lik boş bir steril kaba yerleştirin. Lamelin ortasına bir damla (~ 50 μl) hücre süspansiyonu ekleyin.</li>
		<li>Hücre çözeltisi bitene kadar tekrarlayın.</li>
		<li>35 mm'lik tabakları, nöronların lamellere yapışmasını sağlamak için 1 saat boyunca 37 °C ve %5CO2 inkübatöre yerleştirin.</li>
		<li>Her tabağa 2 ml daha fazla ortam ekleyin ve inkübatöre geri dönün.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Yama Kelepçesi Kaydı
<ol>
	<li>Kayıt için çözümler: Bu çözümler NaV akımlarını kaydetmek içindir. Farklı bileşime sahip çözelti örnekleri bu referanslardabulunabilir 5-7.
	<ol>
		<li>Dış çözelti: (mM cinsinden) 45 NaCl, 100 N-metil-d-glukamin (NMG)•Cl, 4 MnCl2, 10 Na•HEPES ve 10 glikoz, pH = 7.4 ve ozmolarite = 320 mOsm.</li>
		<li>İç çözelti: (mM cinsinden) 104 NMG•Cl, 14 Kreatin•PO4, 6 MgCl2, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG2•EGTA ve pH 7.4 ve ozmolarite = 300 mOsm ile 0.3 Tris2•GTP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>İyonik akımların ölçümü:
	<ol>
		<li>Kayıt elektrotlarını bir elektrot çekicideki cam kılcal damarlardan çekin ve bir microforge kullanarak uçları ısıyla parlatın. Elektrotların direnci tipik olarak 2-3 MΩ'dur</li>
		<li>Epifloresanslı bir mikroskop ve bir TRITC küpü kullanarak DiI etiketli DRG nöronlarını tanımlayın. DiI, 550 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 570 nm'lik bir emisyon dalga boyuna sahiptir.</li>
		<li>Cam elektrodu iç solüsyonla doldurun (sadece elektrot ucunun ~ 1 cm'sini törpüleyin) ve sıkışan kabarcıkları çıkarmak için hafifçe vurun. Elektrot tutucusuna yerleştirin ve bir mikromanipülatör kullanarak hücreye hareket ettirin.</li>
		<li>Elektrot hücreye temas ettiğinde, sıkı bir conta oluşana kadar (elektrot direncindeki artışla belirlenir) emme borusundan hafifçe emme uygulayın.</li>
		<li>Membran voltajını istenen tutma potansiyelinde (tipik olarak -60 ila -120 mV) sıkıştırın.</li>
		<li>Elektrotun ucundaki membran yamasını çıkarmak için daha güçlü emme uygulayarak tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonunu elde edin. Tüm hücre konfigürasyonuna geçiş, elektriksel olarak kapasitif akım8-10'da bir artış olarak gözlenir.</li>
		<li>Yama kelepçesinin kompanzasyon devresini kullanarak seri direnci telafi edin ampyükseltici (en az %80 kompanzasyon kullanın)8,10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. İmmünositokimya
<ol>
	<li>Nöronları 1 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile lamellere sabitleyin ve daha sonra 10 dakika boyunca% 2 Tween 20 ile fosfat tamponlu salin (PBS) içinde geçirgenleştirin.</li>
	<li>Sabit hücreler O / N'yi bir bloke edici çözelti (normal serum veya Sığır Serum Albümini) ve ayrıca ilgilenilen spesifik bir antijene bağlanmak için geliştirilmiş bir antikor olan birincil antikor içinde inkübe edin.</li>
	<li>Primer antikorlardan yoksun olan bloke edici çözeltide bir nöron O / N kontrol setini inkübe edin.</li>
	<li>Lamelleri PBS tamponu 3x ile 5 dakika yıkayın, ardından bağlanmamış primer antikoru çıkarmak için her biri 5 dakikalık 2 yıkama% 1 Tween 20 ile yıkayın.</li>
	<li>Test edin ve kontrol lamellerini, görselleştirmeye izin vermek için birincil antikora bağlanan uygun floresan etiketli ikincil antikorla inkübe edin.</li>
	<li>Fazla sekonder antikoru çıkarmak için lamelleri PBS 3x ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Lamelleri montaj ortamını kullanarak temiz bir cam sürgün üzerine monte edin.</li>
	<li>Sabitlemek için lamel kenarına şeffaf oje sürün. Kuruduktan sonra, nöronları görselleştirin ve floresan mikroskobuna eşlik eden yazılımı kullanarak görüntüleri yakalayın. 
	Not: Bu çalışmada, NIS elemanları BR 3.2 yazılımı ile bir Nikon Mikroskobu kullanılmıştır. Pozlama süresi optimize edildi ve kontrol ve test slaytları için aynı tutuldu.</li>
	<li>ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html) gibi görüntüleme yazılımlarını kullanarak tek tek nöronlardan floresan yoğunluğunu ve hücre boyutunu ölçün.</li>
</ol>

<ol><li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reactions+of+cutaneous+and+muscle+afferent+neurons+to+peripheral+nerve+transection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective reactions of cutaneous and muscle afferent neurons to peripheral nerve transection in rats.</a> J. Neurosci. 23, 10559-10567 (2003).</li>
<li>Wang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+reactive+oxygen+species+modulates+voltage-gated+sodium+channels+in+dorsal+root+ganglia+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endogenous reactive oxygen species modulates voltage-gated sodium channels in dorsal root ganglia of rats.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1439-1447 (2011).</li>
<li>Köbbert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog. Neurobiol. 62, 327-351 (2000).</li>
<li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 71-81 (2008).</li>
<li>Ikeda, S. R., Schofield, G. G., Weight, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+and+Ca2%2B+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+nodose+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Na+ and Ca2+ currents of acutely isolated adult rat nodose ganglion cells.</a> J. Neurophysiol. 55, 527-539 (1986).</li>
<li>Yarotskyy, V., Elmslie, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roscovitine+Inhibits+CaV3.1+%28T-Type%29+Channels+by+Preferentially+Affecting+Closed-State+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.Ther%22%5BJournal%5D)">Roscovitine Inhibits CaV3.1 (T-Type) Channels by Preferentially Affecting Closed-State Inactivation.</a> J. Pharmacol. Exp.Ther. 340, 463-472 (2012).</li>
<li>Ganapathi, S. B., Kester, M., Elmslie, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+block+of+HERG+potassium+channels+by+R-roscovitine%3A+implications+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">State-dependent block of HERG potassium channels by R-roscovitine: implications for cancer therapy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, 701-710 (2009).</li>
<li>Jones, S. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+SW+%22Neuromethods+Vol.+14+Neurophysiological+Techniques%3A+Basic+Methods+and+Concepts%22">Neuromethods Vol. 14 Neurophysiological Techniques: Basic Methods and Concepts</a>. Baker, G. B., Vanderwolf, C. H., Boulton, A. A. , The Humann Press, Inc. 143-192 (1990).</li>
<li>Penner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPenner%2C+R+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. rwin 1, Plenum Press. 3-30 (1995).</li>
<li>Marty, A. aN., Erwin, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+AaN+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. rwin 2, Plenum Press. 31-52 (1995).</li>
<li>Ramachandra, R., McGrew, S. Y., Baxter, J. C., Kiveric, E., Elmslie, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodotoxin-resistant+voltage-dependent+sodium+%28NaV%29+channels+in+identified+muscle+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Tetrodotoxin-resistant voltage-dependent sodium (NaV) channels in identified muscle afferent neurons.</a> J. Neurophysiol. , (2012).</li>
<li>Ramachandra, R., McGrew, S. Y., Baxter, J. C., Howard, J. R., Elmslie, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaV1.8+channels+are+expressed+in+large%2C+as+well+as+small%2C+diameter+sensory+afferent+neurons.+%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">NaV1.8 channels are expressed in large, as well as small, diameter sensory afferent neurons. </a> Channels. 7, 0-1 (2013).</li>
<li>Smith, S. A., Mitchell, J. H., Garry, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+exercise+pressor+reflex+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mammalian exercise pressor reflex in health and disease.</a> Exp. Physiol. 91, 89-102 (2006).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 12, 333-335 (1989).</li>
<li>von Bartheld, C. S., Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J. Histochem. Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Fuller, B. C., Sumner, A. D., Kutzler, M. A., Ruiz-Velasco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+employing+ultrasound+guidance+for+percutaneous+cardiac+muscle+injection+to+retrograde+label+rat+stellate+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel approach employing ultrasound guidance for percutaneous cardiac muscle injection to retrograde label rat stellate ganglion neurons.</a> Neurosci. Lett. 363, 252-256 (2004).</li>
<li>Takahashi, Y., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermatomes+in+the+rat+limbs+as+determined+by+antidromic+stimulation+of+sensory+C-fibers+in+spinal+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Dermatomes in the rat limbs as determined by antidromic stimulation of sensory C-fibers in spinal nerves.</a> Pain. 67, 197-202 (1996).</li>
<li>Zhou, W., Jones, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+and+calcium+channel+saturation+in+bullfrog+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Surface charge and calcium channel saturation in bullfrog sympathetic neurons.</a> J Gen Physiol. 105, 441-462 (1995).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Margas, W., Mahmoud, S., Ruiz-Velasco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+Acetylcholine+Receptor+Modulation+of+Mu+%28%7Bmicro%7D%29+Opioid+Receptors+in+Adult+Rat+Sphenopalatine+Ganglion+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic Acetylcholine Receptor Modulation of Mu ({micro}) Opioid Receptors in Adult Rat Sphenopalatine Ganglion Neurons.</a> J. Neurophysiol. 103, 172-182 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Triceps surae kaslarından (örneğin gastroknemius) kaynaklanan kas afferentleri, egzersiz baskılayıcı refleksini (EPR) araştırmak için birçok çalışmada kullanılmıştır13. EPR'ye aracılık eden duyusal nöronları incelemeye olan ilgi göz önüne alındığında, boya enjeksiyonu için gastroknemius kasları seçildi. DiI, lipofilik doğası nedeniyle ve bozulmamış plazma zarı3,14'ten difüzyon yoluyla nörondan kaybolmadığı için seçilmiştir. Bu yöntemi bir kılavuz olarak kullanarak, innerve edici afferent nö...

Dorsal kök gangliyonları (DRG), vücudun çeşitli bölgelerini innerve eden afferent nöronlardan gelen somadan oluşur ve farklı innervasyon hedeflerine sahip duyusal nöronların incelenmesinden önemli bilgiler elde edilebilir1. Afferent nöronları izole etmek ve tanımlamak için çeşitli dolaylı veya invaziv yöntemler kullanılır, örneğin sinire florogold1 gibi belirteçler enjekte etmek, cerrahi yöntem2 ile kaslara boya enjekte etmek. Nöronları ve nöronal yolları etiketlemek için başarıyla kullanılan farklı boyalardan, DiI gibi floresan boyalar, nöron terminalleri tarafından hızlı alımları, nöronlarda uzun süreli tutulmaları ve nöronlar arasında transfer eksikliği nedeniyle nöroanatomik izlemelerde yaygın olarak kullanılmaktadır3. DiI ile etiketlenmiş afferent nöronlar, ayrıntılı çalışma için bir floresan mikroskobu kullanılarak kolayca görüntülenebilir. Bununla birlikte, bir sınırlama, hücre içi epitoplar4 ile immünositokimya için gerekli olan hücre geçirgenliği sırasında DiI gibi belirteçlerin hücrelerden kaybolabilmesidir. Burada, DRG'deki kas afferent nöronlarını tanımlamak için iskelet kasına enjekte edilen DiI'yi kullanan bir yöntemi açıklıyoruz. Ayrıca, hücre içi epitoplara antikor erişimine izin verirken nöronda DiI'yi tutan bir hücre geçirgenleştirme yöntemini de tarif ediyoruz. Bu tanımlanmış nöronları incelemek için hem yama klemp elektrofizyolojisinin hem de immünositokimyanın kullanımını gösteriyoruz ve ayrıca nöronal uyarılabilirliği kontrol eden iyon kanallarını incelemede her tekniğin farklı avantajlarını açıklıyoruz. Son olarak, elektrofizyolojik verilerin yorumlanmasını engelleyebilecek potansiyel sorunları açıklıyoruz. Bu yöntemleri, kas ve kutanöz afferent nöronları tanımlamak ve bu tanımlanmış nöronlarda ifade edilen voltaj kapılı sodyum (NaV) kanallarını belirlemek için kullandık8. Bununla birlikte, bu yöntemler, belirli bir hedef dokuyu veya beyin çekirdeğini innerve eden tanımlanmış nöron alt kümelerini incelemek için çeşitli hazırlıklara uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>NaV 1.8</td><td>Abcam</td><td>Ab93616</td><td></td></tr><tr><td>NaV 1.1 / 1.6 / 1.7 ve 1.9</td><td>Alamone Labs, Kudüs, İsrail</td><td>ASC- 001/ 009 /008 /017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor ikincil antikorlar</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floro-Jel Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>17985</td><td></td></tr></tbody></table>

ifade İyon kanallarının Çalışması için özel duyusal nöron populasyonlarının belirlenmesi

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Duyusal nöronlar, vücudun çeşitli bölgelerinden merkezi sinir sistemine sinyaller iletir. Bu nöronlar için soma, omurgayı kaplayan dorsal kök gangliyonlarında bulunur. Bu duyusal afferent nöronlar tarafından ifade edilen reseptörleri ve kanalları anlamak, hastalık için yeni tedavilere yol açabilir. İlk adım, ilgilenilen duyusal nöronların spesifik alt kümesini tanımlamaktır. Burada, bir floresan boya DiI (1,1'-dioktadesil-3,3,3',3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat) kullanarak retrograd etiketleme ile kasları innerve eden afferent nöronları tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. İyon kanallarının kas afferentlerinin uyarılmasına katkısını anlamak, periferik vasküler hastalık veya kalp yetmezliği gibi belirli hastalık durumlarının neden olduğu aşırı uyarılabilirliği daha iyi kontrol etmeye yardımcı olabilir. Bu nöronlar tarafından eksprese edilen voltaja bağlı iyon kanallarını tanımlamak için yama kelepçe elektrofizyolojisi ve immünositokimya olmak üzere iki yaklaşım kullandık. Elektrofizyoloji ve farmakolojik blokerler fonksiyonel iyon kanalı tiplerini tanımlayabilirken, spesifik blokerlerin mevcut olmadığı kanalları belirlemek ve hücre popülasyonundaki iyon kanalı dağılım modelini daha iyi anlamak için immünositokimyayı kullandık. Bu teknikler, belirli nöronal grupları incelemek için sinir sisteminin diğer bölgelerine uygulanabilir.

Burada açıklanan yöntemi kullanarak, DRG'deki kas aferent nöronlarını tanımladık ve ardından bu nöronlar tarafından eksprese edilen voltaj bağımlı sodyum kanallarını (NaV) belirledik. DiI ile işaretli kas aferent nöronları (Şekil 1C), DRG'deki toplam nöron popülasyonunun küçük bir kısmını oluşturmuş olup, nöronların ortalama %16'sı (167/1047) işaretlenmiştir. Nicelleştirme, önce ImageJ kullanılarak floresansın ölçülmesi ve pozitif olarak işaretlenmiş nöronlar için eşik değerini belirlemek amacıyla yoğunl...

Afferent duyusal nöronlar, duyusal bilgileri çevreden merkezi sinir sistemine gönderir. Spesifik afferent nöronların tanımlanması, fizyolojilerinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Afferent nöronları tanımlamak için bir retrograd etiketleme yöntemi tanımladık ve bu nöronlardaki voltaj kapılı iyon kanallarını yama kelepçesi elektrofizyolojisi ve immünositokimya kullanarak inceledik.

Ifade İyon Kanallarının Çalışması için özel Duyusal Nöron Populasyonlarının Belirlenmesi

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Bu prosedürün genel amacı, retrograd boya etiketlemesi yoluyla afferent nöronları tanımlamak ve patch clamp elektrofizyolojisi ile immünokimya kullanarak bu nöronlardaki iyon kanallarını incelemektir. Bu işlem, öncelikle innervasyon sağlayan afferent nöronları etiketlemek için hedef dokuya DAI enjekte edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise dorsal kök gangliyonlarından afferent nöronların izole edilmesidir.Ardından, kapılı iyon kanallarını kaydetmek için işaretli nöronlara yama kenetleme (patch clamp) uygulanır; son adım ise immünokimya kullanarak işaretli nöronlarda eksprese edilen iyon kanallarının tanımlanmasıdır. Sonuç olarak, yama kenetleme ve immünokimya kombinasyonunu kullanarak, afferent nöronlardaki iyon kanallarının fonksiyonel özelliklerinin yanı sıra ekspresyon paternini de tanımlayabilmekteyiz. Bu yöntemin mevcut diğer yöntemlere göre temel avantajı, non-invaziv bir yöntem olması ve kullandığımız DAI olan DAI I'in, nöronal terminaller tarafından hızla alınmasıyla bilinmesidir.Enjekte ettiğimiz nöronlar arasında transfer eksikliği ve nöronlar içinde uzun süreli tutulumlar. Prosedürü, ben ve laboratuvarımızdan araştırma teknisyeni Stephanie uygulamalı olarak göstereceğiz. Boya enjeksiyonu için, öncelikle anestezi altındaki sıçanın her iki bacağındaki baldır bölgesinin üzerindeki tüyleri elektrikli tıraş makinesi kullanarak tıraş edin.Ardından, 1 CC'lik steril bir şırıngayı 200 µL %1,5'lik Dai çözeltisi ile doldurun. İğneyi her bir gastro kasının uzun eksenine paralel olarak yavaşça yerleştirin ve iğneyi kastan geri çekmeden önce kas içine 100 µL dai enjekte edin. Boyanın uçtan akmadığından emin olmak için şırınga pistonunu geriye doğru çekin.10 saniye bekleyin ve ardından iğneyi kastan çıkarın. Boyanın dağılımının diseksiyon için uygun hale gelmesi için dört ila beş gün gereklidir. 10 mililitre HBSS içeren bir beher, 35 milimetrelik bir Petri kabı ve 100 milimetrelik bir Petri kabını buz üzerine yerleştirin.Ardından, yedi miligram kollajenaz, bir miligram DNA ve 10 miligram tripsin tartın; çalkalamalı su banyosunu 37 °C'ye ısıtın ve banyoda 10 mL EBSS içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpünü ısıtın. Diseksiyon öncesinde sıçanı ötanize ettikten sonra, hayvanın sırtındaki deriyi hızla kesin. Daha sonra, daha iyi görünürlük sağlamak için omurga boyunca bulunan bağ dokusunu ve kas dokusunu uzaklaştırın.Ardından, omurganın lomber bölümünü çıkarın. Sonrasında, izole edilen omurgayı 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. Preparasyonun nemli ve soğuk kalmasını sağlamak için steril bir pastör pipeti kullanarak soğutulmuş HBSS çözeltisi uygulayın.Kasları omurganın yanlarından kesin. Kemikleri nazikçe çıkarmak ve dorsal kök ganglionlarını içeren girintileri kapatmak için kemik pensleri veya makas kullanarak dorsal laminektomi gerçekleştirin. Bu işlemi tekrarlayın. Bu prosedür sırasında buz gibi soğuk HBSS uygulayın.Mikroskop altında, gangliyonların kolayca taşınmasını sağlamak için bir ila iki milimetre sinir bırakacak şekilde periferik ve merkezi sinirleri keserek DRG'yi izole edin. Ardından, izole edilen DRG'yi buz soğukluğundaki HBSS tamponu içeren 35 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. Tüm L dört ve L beş DRG'ler izole edilene kadar prosedürleri tekrarlayın.Fazla sinirleri ve kan damarlarını mikro makas ve penset kullanarak temizleyin. Enzimlerin daha iyi nüfuz edebilmesi için DRG'yi kesin; ancak DRG nöron disosyasyonu için DRG'nin kılığını soymayın. Enzimleri sıcak EBSS medyumuna ekleyin, ardından çözünene kadar vorteksleyin ve filtre sterilizasyonu yapın.Ardından, tüm DRG'leri steril bir pastör pipeti ucuyla enzim çözeltisine yerleştirin. Bundan sonra, balonu sıkıca kapatmadan önce 60 saniye boyunca %95 oksijen ve %5 CO2 ile havalandırın. Daha sonra balonu, 37 °C'deki çalkalayan su banyosunda 240 RPM'de 60 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun sonunda, DRG'leri steril koşullar altında ayrıştırmak için flaskı 50 kez şiddetli bir şekilde çalkalayın. Enzimatik aktiviteleri durdurmak için flaska beş mililitre MEM plus ekleyin.Erlenmeyer içeriğini steril 15 milliliters santrifüj tüpüne aktarın ve 16 times G hızında altı dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı uzaklaştırıp atın. Numuneye beş milliliters MEM plus ekleyin ve pipet yardımıyla nazikçe trite edin.Pelleti dağıtmak için santrifügasyon adımını tekrarlayın, süpernatantı uzaklaştırıp atın ve 500 µL MEM plus ekleyip hücre süspansiyonu oluşturmak için bir pipet üzerindeki bir mililitrelik pipet ucuyla nazikçe tritüre edin. Ardından, poli-lizini kaplı bir cam lamelli örtüyü boş, steril 35 mm'lik bir kaba yerleştirin. Sonra, hücre süspansiyonundan bir damlayı lamelli örtünün merkezine ekleyin.Hücre çözeltisi tükenene kadar bu prosedürü tekrarlayın. Nöronların lamellere tutunmasını sağlamak için 35 milimetrelik kapları 37 °C ve %5CO2 içeren bir inkübatörde bir saat bekletin. Bir saat sonra, her kaba iki mililitre daha besiyeri ekleyin ve patch clamp kaydı gerçekleştirmek üzere kapları inkübatöre geri yerleştirin.Öncelikle, epi floresan özellikli bir mikroskop kullanarak boya ile işaretlenmiş DRG nöronlarını belirleyin. Ardından, cam elektrodu iç solüsyonla doldurun. Hapsolmuş hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe vurun.Ardından elektrodu elektrot tutucusuna yerleştirin. Mikromanipülatör kullanarak elektrodu hücreye doğru indirin. Elektrot hücreye temas ettiğinde, sıkı bir sızdırmazlık oluşana kadar vakum tüpü aracılığıyla hafif bir vakum uygulayın.Ardından membran voltajını istenen tutma potansiyelinde sabitleyin. Daha güçlü vakum uygulayarak tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) konfigürasyonunu elde edin. Tüm hücre yama kenetleme konfigürasyonu kurulduktan sonra, elektrodun ucundaki membran yamasını kaldırmak için kayda başlayın.Bu prosedürde, lamel üzerindeki nöronları %4 paraformaldehit ile bir saat boyunca fikse edin. Ardından, nöronları PBS içinde %2 tween 20 ile 10 dakika boyunca permeabilize edin. Sonrasında, hücreleri bir saat boyunca bloklama solüsyonunda inkübe edin.Test hücreleri, bloklama çözeltisi ve primer antikor içeren karışımda gece boyunca inkübe edilir. Kontrol nöron seti, primer antikor olmadan sadece bloklama çözeltisinde gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, lamlar PBS tamponu ile beşer dakikadan üç kez yıkanır; ardından, bağlanmamış primer antikoru uzaklaştırmak için %1 tween 20 ile beşer dakikadan iki kez yıkama yapılır.Ardından, görselleştirme sağlamak amacıyla primer antikora bağlanan uygun floresan işaretli sekonder antikor ile test ve kontrol lamelini 30 dakika boyunca inkübe edin. Bundan sonra, fazla sekonder antikoru uzaklaştırmak için lameleri her biri beş dakika sürecek şekilde 3 kez PBS ile yıkayın. Son olarak, lameleri bir montaj medyumu kullanarak temiz bir cam lam üzerine monte edin.Ardından, lamelini sabitlemek için kenarına şeffaf oje sürün. Kuruduktan sonra, nöronları görüntüleyin ve floresan mikroskobuna eşlik eden yazılımı kullanarak görüntüleri kaydedin. Bu, gastro kasına yapılan Dai enjeksiyonunun ve kastan DRG'ye doğru gerçekleşen retrograd taşımanın bir gösterimidir.Burada L dört ve L beş DRG'ler etiketlenmiştir. Afferent nöronlar aydınlık alan görüntüsünde gösterilmiş olup, bu floresan görüntü boya ile etiketlenmiş bir kas afferent nöronunu göstermektedir. Bu histogram, duyusal nöronların DII floresan yoğunluğunu göstermektedir.Büyük pik, işaretlenmemiş nöronlardan kaynaklanmaktadır ve ortalama yoğunluk ile standart sapmayı belirlemek için bir Gauss denklemi ile uydurulmuştur. Kesikli dikey çizgi, DAI işaretlemesi için eşik değerini temsil eder. Histogram, 167'si dai ile işaretlenmiş toplam 1047 nörona ait verileri içermektedir.Membran voltaj kontrolü iyi olan temsili bir kas aferent nöronu görülmektedir. -20, -10 ve 0 mV değerlerindeki sodyum akımları solda, akım-voltaj ilişkisi ise sağda gösterilmiştir. Bu prosedür uygulanırken, DRG'lerin hızlı ancak nazikçe diseke edilmesi ve preparasyonun buz soğukluğundaki hbss ile sürekli nemli tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, fizyolojideki rollerini anlamak amacıyla diğer efferent nöronlar işaretlenebilir ve tanımlanabilir.

identification-specific-sensory-neuron-populations-for-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Aynı anda birden fazla iyon kanalları aracılığıyla mevcut akı ölçüm teknik engeller ve transmembran akım daha sonra seçici hangi bölümünü her kanal tipi nedeniyle. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu yöntem belirli frekans bileşenleri kullanarak tek tek kanal türleri IV eğrisi oluşturmak için bir yol sunar.

Frekans Bileşenleri kullanarak bir İyon Kanal IV Eğrisi, Rekapitülasyon

Nöronlar ilk elektrofizyolojik karakterizedir. Ardından kaydedilen nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, iyon kanalları ve reseptörler mRNA'ların ifade algılamak için ters transkripsiyon-PCR analizi tabi.

Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Burada, anestezi uygulanmış fare korteksindeki tanımlanmış inhibitör internöronlardan kararlı, iyi izole edilmiş tek birimli kayıtlar elde etme stratejimizi açıklıyoruz. ChR2 eksprese eden nöronlar, mavi ışığa verdikleri tepkilerle tanımlanır. Yöntem, standart hücre dışı kayıt ekipmanı kullanır ve kalsiyum görüntülemeye veya görsel olarak yönlendirilen yamaya ucuz bir alternatif olarak hizmet eder.

A Guide In vivo Tek birim Kayıt

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Organa özgü duyusal nöronların tanımlanması zordur. Hızlı Mavi izleme, hücre sıralaması için hava yollarını innerve eden nodoz nöronlarını tanımlamak için kullanılır. Sıralanmış nodoz nöronları, dizileme için yüksek kaliteli ribonükleik asidi (RNA) çıkarmak için kullanılır. Bu protokol kullanılarak, hava yoluna özgü nöronların gen ekspresyonu belirlenir.

Bir Yöntem Hedef ve Fare İzole Havayolu-innerve Duyu Nöronlar için

Burada, tüm hücre yama-klemp kayıtlarını kullanarak fare vomeronazal organının akut koronal doku dilimlerinde tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tanımlanmasına ve derinlemesine analizine izin veren fizyolojik bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Burada canlı, uyuşturuldulu bir laboratuvar faresinin genikül ganglionunun nasıl ortaya çıkarılacağını ve bu nöronların topluluklarının uyaranları tatmak için tepkilerini ölçmek için kalsiyum görüntülemenin nasıl kullanılacağını ve farklı uyarıcılarla birden fazla denemeye izin vermeyi sunuyoruz. Bu, hangi nöronların hangi şok tabancalarına yanıt verdiğine derinlemesine karşılaştırmalar sağlar.

Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI), duyusal nöron sinyalinin sağlam, popülasyon düzeyinde bir analizini sağlar. Burada, sıçan trigeminal gangliyon nöron aktivitesinin in vivo GECI görselleştirmesine izin veren yeni bir yaklaşım geliştirdik.

Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

Nöronal membran proteazomu (NMP) yakın zamanda somatosensoriyel nöronların bir alt kümesinde dokunma, ağrı ve kaşıntı algısının önemli bir düzenleyicisi olarak tanımlandı. Bu makale, hücre sınıflandırması, transkriptom profili oluşturma ve kültür bazlı immünofloresan analizleri kullanarak hücre tipine özgü NMP ekspresyonunu ve fonksiyonunu analiz etmek için sağlam bir iş akışı sunmaktadır.

Somatosensoriyel Nöronlarda Nöronal Membran Proteazomunun Hücre Alt Tipine Özgü Analizi

Öğrenin, retrograd boya etiketleme ve yama kelepçesi elektrofizyolojisi kullanarak duyusal nöronları belirlemeyi ve iyon kanallarını incelemeyi. Bu yöntem, aferent nöronların fizyolojik özelliklerini anlamak için araştırmacılara kapsamlı bilgi sağlar.

Ifade İyon Kanallarının Çalışması için özel Duyusal Nöron Populasyonlarının Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet