Name: Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Öğrenin, kriyojenik elektron tomografisi kullanarak dondurulmuş-hidratlı durumdaki primer sıçan nöronlarının ultrayapısını nasıl görselleştireceğinizi. Bu yöntem, kimyasal fiksatif kullanmadan nanometre çözünürlüğünde 3D görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma NIH hibe (PN2EY016525 ve P41GM103832) tarafından desteklenmiştir. SHS Gulf Coast Konsorsiyum (NIH Hibe No T32EB009379) Disiplinlerarası Biyobilim Eğitim WM Keck Merkezi&#39;nin Nanobiyoloji Disiplinlerarası Lisansüstü Eğitim Programı bir burs ile desteklenmiştir. SHS, disseke büyüdü ve DRG ve hipokampus hücrelerini vitrifiye, cryo-EM ve DRG ve hipokampal akson kriyo-ET toplanan verileri, yeniden ve tilt serisi renk açıklamalı. MRG disseke ve MnR laboratuarında hipokampal hücreleri sağladı. SC tilt serisi açıklama destekli. SHS nöronlar incelemek ve büyümeye nasıl CW tarafından eğitildi. SHS, WCM ve WC deneyler tasarlanmıştı. SHS diğer yazarlar girişi ile el yazması hazırladı. Bu video t Biozentrum Hücresel Görüntüleme ve NanoAnalytics (C-Cina) için Merkezi&#39;nde çekildiÜniversite Basel diye. C-Cina Basel, İsviçre&#39;de bulunan ETH Zürich arasında Biyosistem Bilimi ve Mühendisliği (D-BSSE) için Bölümü entegre edilmiştir.

1.. Kaplama İlköğretim Nöronlar EM Izgaralara Yemekleri Hazırlama <ol><li> En az 25X büyütmede ışık mikroskobu kullanarak altın EM ızgaraları holey karbon bütünlüğünü inceleyin. Emin karbon delikleri&gt;% 98 sağlam olduğundan emin olun. </li><li> Birincil nöronları kaplama için, EM ızgaraları alev sterilize ve aynı anda onları hidrofilik işlemek için bir Bunsen beki kullanın. Kenarıyla değil, merkezi ızgarah alanı ile EM ızgara almak için cımbız kullanın. DİKKAT: gözetimsiz yanan bir Bunsen beki bırakmayın ve bu adımları gerçekleştirirken plastik bileşenleri ile eldiven veya cımbız kullanmayın: <ol><li> Bunsen Ocağı yakmadan önce, bir minimal açık pozisyona hava ve gaz ayarı ayarlayın. </li><li> Bir forvet çakmaktaşı ya da bütan çakmak kullanarak Bunsen beki yakin. </li><li> Uzun boylu, açık mavi / mor alev içinde küçük, mavi bir iç alev elde etmek için hava ve gaz ayarı değiştirin. Iç alev ucu alevin sıcak parçasıdır. Altında topuzubrülör namlu hava brülör girme miktarını ayarlamak için açılabilir iken neath brülör, gaz brülör tüpü girme miktarını ayarlar. Hava ayarı saat yönünde çevirerek (mor alev sonuçlanan) havayı azaltır ve saat yönünün tersine (sarı bir alev sonuçlanan) havayı artırır. </li><li> Karbon tarafı yukarı bakacak şekilde, iki kez alev aracılığıyla hızlı bir şekilde geçmek, EM ızgara tutun metal cımbız (hiç plastik parça) kullanma. Karbon tarafı daha mat (daha az parlak) görünür ve diğer tarafında daha grimsi tonu daha fazla olacaktır. </li><li> Hemen Bunsen beki 10 cm mesafede yerleştirilmiş cam alt çanak merkezi haline ızgara (karbon-tarafı yukarı) aktarın. Çanak başına bir EM ızgara (Şekil 1) kullanın. Sadece presterilized olan cam alt yemekler, yani yoluyla gama radyasyon kullanın. </li></ol></li><li> Hala cam Bott içindeki EM ızgara korurken ızgara bütünlüğünü (karbon delikler sağlam) kontrol etmek için bir ışık mikroskobu kullanınom çanak (kirlenmesini önlemek için). Nöronlar ile temas edecek ızgara ya da bir şey üzerinde herhangi bir maddeyi uygularken, steril prosedür ve steril pipet uçları kullanın. </li><li> Steril bir prosedür kullanılarak, bir doku kültürü kaputu, Petri kabı, merkezi cam bölgeye yavaş ve dikkatli bir şekilde, uygun olan kaplama maddesinin 250 ul geçerlidir. Uygun kaplama maddesi tamamı EM ızgara kapsar emin olun. <ol><li> Hipokampal nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi hazırlanmıştır 19, kaplama maddesinin, poli-L-lisin (PLL, 1 mg / ml) kullanın. 250 ul tabak başına, EM ızgara başına gerekli olduğunu unutmayın, bu yüzden buna göre toplu ölçek. Dorsal kök ganglion (DRG) nöronlar için, aşağıdaki gibi hazırlamak, kaplama madde olarak (Malzeme ve reaktiflerin tabloya bakınız) Engelbreth-Holm-Swarm (ÇSG) fare sarkoma hücreleri tarafından salgılanan bir protein jelatinli karışımı kullanın. 250 ul tabak başına, EM ızgara başına gerekli olduğunu unutmayın, bu yüzden buna göre toplu ölçek. <ol><li> Bir stok şişe Çözülme4 ° C de bir gece Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan jelatinimsi protein karışımının </li><li> Soğuk Ol Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), fare sarkoma hücreleri, buz üzerinde tutarak, yani çözelti yapılması için kullanılan bütün bileşenleri, salgılanan protein jelatinimsi karışım. </li><li> Buz üzerinde, bir 1:20 seyreltme vermek üzere, Neuro temelli ortam içinde bu, jelatinimsi protein karışımı seyreltik da (örneğin, Neuro temelli 10 ml jelatinimsi protein karışımının 500 ul seyreltik). </li><li> Bölme 1 ml alikotlar halinde, jelatinimsi protein karışımı seyreltildi ve hemen -20 ° C&#39;de fazladan alikotları depolamak </li><li> Bölüm 1.4 &#39;de tarif edildiği gibi, çanak başına EM grid başına 250 mikrolitre uygulayın. </li></ol></li></ol></li><li> Onun üst Petri kabı kapağı ve (hipokampal numuneler için iki PLL ile, OR DRG örnekler için, jelatinimsi protein karışımı ile) inkübe doku kültürü kaputu oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. </li><li> Aspi(hipokampal numuneler için) tüm PLL veya yemekler (DRG numuneler için) jelatinli protein karışımı değerlendirirsiniz. Bunu yapmak için, doku kültürü kaputu vakum sistemini kullanır. Vakum tüpüne bağlanmış bir steril pipet kullanın. EM ızgara ile doğrudan temastan kaçının. </li><li> Dikkatlice EM ızgara tamamen PBS ile kaplanmıştır, öyle ki her bir Petri kabı içinde merkezi cam alanında, EM şebekeye steril PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) içinde 250 ul uygulamak için ayarlanabilir bir hava-yer değiştirme pipet kullanın. Daha sonra, her bir tabaktan PBS aspire. 3x tekrarlayın. </li><li> EM ızgaraları ile yemekleri 15 dakika süreyle doku kültürü kaputu altında kurumaya bırakın. Onlar doku kültürü odasında ışık mikroskobu altında kontrol ederek tamamen kuru olduğundan emin olun. Emin kılavuzunda nem hava kabarcığı olmadığından emin olun. Eğer öyleyse, dikkatle aspire yanındaki EM ızgara için bu ekstra nem ortadan kaldırmak için. Kaplanmış ızgara nöronları kaplama için hemen kullanılmalıdır. </li></ol> 2. Hazırlanması ve PlEM Izgaralar üzerinde ating İlköğretim Nöronlar <ol><li> Daha önce 19 açıklandığı gibi, tek tek hücrelere hippocampi (veya 18 gün eski sıçan embriyoların dorsal kök ganglion) ayırmak için birincil nöronları, ilk teşrih, trypsinize (% 2.5 tripsin kullanarak) ve çiğnemek plaka. <ol><li> Öğütün özellikle ateş cilalı ucu ile bir cam pipet kullanılarak, tek tek hücreler içine hücre ayrıştırma kümeleri tanımlamak için neurobiologists tarafından kullanılan bir terimdir. Sonuç dikkatlice ve yavaşça pipet aracılığıyla (~ 30), yukarı ve aşağı, birden çok kez hücreleri çekme ve bırakılmasıyla elde edilir. </li></ol></li><li> Fare için daha uygundur önerilen enzimler (papain, kolajenaz / dispaz) kullanmak yerine, sıçan DRG nöronlarını izole edilmesi için (HBSS)% 0.25 tripsin kullanımı dikkate alarak, daha önce DRG diseksiyon ve hücre 24 izolasyonu için açıklanan prosedürleri takip DRG nöronları. </li><li> (Örneğin bir hemasitometre kullanılarak) izole nöronların sayısını hesaplayınve tabak başına 50,000 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için her bir çanak uygulamak için hücrelerin uygun hacmi hesaplamak için bu değerini kullanın. Uygulamak için maksimum hacmi 250 ul. Bu sadece merkezi cam alanını değil, tüm yemeğin doldurur unutmayın. </li><li> 37 ° C &#39;de, bir CO2 kuluçka makinesi içinde 30 dakika için inkübe yemekler Hücreleri kurtarmak ve uymak için izin verin. </li><li> Yavaşça EM ızgara bozmamaya özen, her yemeğin ısıtılmış medya 1.5 ml ekleyin. Ortamının tipi, hücre tipi (hipokamp veya DRG) bağlıdır. <ol><li> Kullanımdan önce, 37 ° C su banyosu içinde ısıtıldı olmaktır hipokampal nöronlar 19 ya da dorsal kök ganglion nöronlarının 24, her iki için uygun ortam hazırlar. CO2 inkübatör içinde bir gece boyunca inkübe yemekler. </li><li> Hipokampalinden için, ertesi gün ortamı değiştirmek. 14 gün boyunca her iki günde bir ileriye ortamın yarısı değiştirin. Kullanımdan önce, 37 ° C su banyosu içinde ortam ısıtın. </li&gt; <li> DRG nöronları için, diseksiyon / kaplama takip eden gün, bir anti-mitotik ajan (Üridin ve 5&#39;-floro-2&#39;-deoksiüridin) ayrı olarak, her bir 10 mM stok çözelti yapmak ortam ile yeni bir stok hazırlamak, nihai kullanımı Her biri için 10 uM konsantrasyonu. DRG medya (875 ul) yarısı çıkarın ve anti-mitotik madde ile taze medya 875 ul ekleyin. <ol><li> DRG nöronlar için, ilk hafta için her iki gün, alternatif anti-mitotik medya ve standart DRG medya arasındaki ortam değişiyor. Ikinci hafta için, her iki gün standart DRG ortamı değiştirmek. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. EM Izgaralar üzerinde Nöronlar camlaştıncı <ol><li> Kriyojenik sıcaklıkta altın EM ızgaraları dondurulması ve depolanması için ekipman ve tüm malzemeleri hazırlayın: bir nem odası 17 ile vitrifikasyon cihazı, sıvı azot vitrifikasyon makine, uzun düz uçlu cımbız, termosun (ler) için ince nokta uzman cımbız (LN 2), coolant konteyner, EM ızgara saklama kutusu, kalsiyum-ücretsiz filtre kağıdı. </li><li> Vitrifikasyon cihazı başlatın. 32 ° C&#39;ye kadar% 100 ve sıcaklık nem ayarlayın &quot;Konsol&quot; bölümünde, sıfır saniye leke saati ayarlayın. Bu, vitrifikasyon makinenin nem odası yan pencereden lekeleme kılavuzu sağlar. </li><li> Üç kağıtlar yığılmış şekilde onları katman, eldiven ile kalsiyum ücretsiz filtre kağıdı tutun. Yaklaşık 2 cm uzunluğunda 0.5 cm genişliğinde şeritler halinde yığını kesin. Kağıdın bir tarafı x 0.5 cm yüz (Şekil 2) 0.5 cm olan böyle bir 90 ° açıyla bükün. Cımbız kullanarak, orta kağıdı çıkarın ve kullanıma kadar başka bir kalsiyum ücretsiz filtre kağıdı üzerine yerleştirin. </li><li> Vitrifikasyon odası içinde düğme tutucu ızgara depolama düğmesine koyun. Sıvı azot ile soğutma kabın iç bölmeyi doldurmak ve tam buharlaştırma kadar bekleyin. Th dış bölmeyi doldurmaksıvı nitrojen ile e soğutucu kap bir sonraki adıma geçilir için kararlı bir sıcaklık elde edene kadar. Soğutulan odası içinde bir sıvı duruma yoğuşur yüksek saflıkta gaz etan ile iç bölmesini doldurun. </li><li> Hemen yakınında vitrifikasyon odasına ulaşım için büyük bir 100 mm polistiren çanak inkübatör çanağı (es) hareket, eğer değil. Dikkatli çanak EM ızgara almak için özel vitrifikasyon cımbız kullanın. Nöronlar EM ızgara üzerinde büyüyor hangi tarafa unutmayın; pozisyon bir sonraki adım için önemli olacaktır. Güvenli EM ızgara üzerinde cımbız kilitlemek için cımbız üzerinde siyah sürgülü kilidini kullanın. </li><li> Vitrifikasyon makine nöronlar uzakta vitrifikasyon makinenin yan açıklık deliğinden, sola yüzleri yapıştırılır üzerinde EM ızgaranın şekilde yan içine cımbız yerleştirin. Vitrifikasyon makinenin içine özel cımbız çekin. </li><li> Uygun tutucuya soğutucu kap yerleştirinvitrifikasyon Makinenin. Yeterli LN 2 ve sıvı etan ile dolu olmalıdır. Bu nem odası alt ile yıkandı olana kadar vitrifikasyon makinenin uygun ekran komutunu kullanarak, yukarı doğru, soğutucu bölmeyi yükseltmek. </li><li> Düz nokta cımbız ile, daha kısa yan (0.5 cm x 0.5 cm yüz) cımbız dik olduğu şekilde, filtre kağıdının bir kenarından kavramak. Bu yüz (Şekil 2B) kaydedilmek üzere EM ızgara ile doğrudan temas edecek. Dikkatlice vitrifikasyon makinenin nem odası yan delik (Şekil 2A) içine filtre kağıdı yerleştirin. Kararlı şekilde 10 saniye için (yan uzak örnekten bakan) EM ızgara karşı kağıdı tutun. Sonra kağıt atmak ve hemen vitrifikasyon makinenin otomasyon kullanılarak sıvı etan örnek dalma-dondurma. </li><li> Dikkatli birinde yuvalardan birine dondurulmuş-sulu EM ızgara transferiızgara depolama düğmeleri. Yemekleri ek EM ızgaraları için işlemi tekrarlayın. Bu deneylerde kullanılan EM ızgara depolama düğmeleri çok dondurulmuş hidratlanmış EM ızgaraları depolayabilir. </li></ol> 4. Görüntü Toplama, İşleme ve Annotation <ol><li> 2-D elektron mikrograflannı ve / veya düşük doz koşul altında bir kriyo-elektron mikroskobu kullanarak neurites 3-D tilt serisi 5 toplamaya devam. 2-D görüntüler 3-D tilt serisi için yararlı olması için buz kalınlığı ve olası alanlar açısından ızgara kalitesini değerlendirmek amaçlanmıştır. <ol><li> Bu durumda, her görüntü / 7 um ve 4.4 arasında örnekleme underfocus bir hedefe 20k büyütmede mikroskop, tek bir eğim sıvı azot cryo buraya tutucu ile donatılmış bir 200 kV elektron mikroskobu bağlanmış bir 4k x 4k CCD kamera kullanılarak toplandı piksel. </li><li> Aşamalı örnek al eğerken örnek bir 3D tomogram edinmek için, projeksiyon görüntüleri bir dizi çekmektransmisyon elektron mikroskobu (TEM) ong bir eksen. Eğim açıları ve diğer deneysel ayarları göz önüne alındığında, otomatik eğim serisini 5 toplamak için mevcut birkaç farklı yazılımlar vardır. Burada gösterilen 3-D tilt serisi ~ 60 e / Å 2 kümülatif dozu ile 5 ° artışlarla 60 ° -60 ° aralığında yarı-otomatik tilt serisi toplama yazılımı kullanarak 26 aynı mikroskop üzerinde toplanmıştır. </li></ol></li><li> Daha önce diğer numuneler 5,29 için açıklanan görüntü işleme yazılımı kullanarak 21 neurites eğim dizi yeniden yapılandırma. </li><li> İlk tomogram segmentlere ve daha önce 5 açıklandığı gibi 3 boyutlu görüntü işleme yazılımı kullanarak bir yüzey modeli oluşturarak neurites 3-D özellikleri Renk açıklama. </li></ol>

<ol><li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).</li>
<li>Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease-like+dystrophic+neurites+characteristically+associated+with+senile+plaques+are+not+found+within+other+neurodegenerative+diseases+unless+amyloid+beta-protein+deposition+is+present%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present.</a> Brain Res. 606, 10-18 (1993).</li>
<li>Binks, B. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBinks%2C+BP+%22Modern+characterization+methods+of+surfactant+systems%22">Modern characterization methods of surfactant systems</a>. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).</li>
<li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of bacterial cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).</li>
<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277, 1990-1993 (1997).</li>
<li>Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+aqueous+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Frozen aqueous suspensions.</a> Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).</li>
<li>Fernández-Busnadiego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+molecular+organization+of+the+neuron+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography.</a> J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).</li>
<li>Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+membrane-bound+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of membrane-bound cellular organelles.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).</li>
<li>Garvalov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+particles+within+cellular+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Luminal particles within cellular microtubules.</a> J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).</li>
<li>Grünewald, K., Cyrklaff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+complex+viruses+and+virus-infected+cells+by+electron+cryo+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).</li>
<li>Gu, J., Bourne, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGu%2C+J+%22Structural+bioinformatics%22">Structural bioinformatics</a>. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).</li>
<li>De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Hoop%2C+MJ+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329(2004).</li>
<li>Fink, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+neurite+extension+and+synapse+formation+by+the+beta+but+not+the+alpha+isoform+of+CaMKII%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII.</a> Neuron. 39, 283-297 (2003).</li>
<li>Jacob, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+matrix+granules%3A+their+behavior+during+changing+metabolic+situations+and+their+relationship+to+contact+sites+between+inner+and+outer+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes.</a> Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).</li>
<li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Ibiricu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+Electron+Tomography+of+Herpes+Simplex+Virus+during+Axonal+Transport+and+Secondary+Envelopment+in+Primary+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons.</a> PLoS Pathog. 7, e1002406(2011).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Koning, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+electron+tomography+of+vitrified+fibroblasts%3A+microtubule+plus+ends+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ.</a> J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%3A+dopamine%2C+vesicles+and+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).</li>
<li>Lucić, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+imaging+of+neurons+grown+in+culture%3A+from+light+microscopy+to+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 160, 146(2007).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and.</a> 2, 152-160 (2007).</li>
<li>Marsh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+tomographic+studies+of+the+mammalian+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+actin+networks+in+intact+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of actin networks in intact filopodia.</a> Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).</li>
<li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770(2011).</li>
<li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li>
<li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li>
<li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li>
<li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li>
<li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSquire%2C+LR+%22Fundamental+neuroscience%22">Fundamental neuroscience</a>. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).</li>
<li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li>
<li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+expression+of+glycine+and+GABA%28A%29+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Biz sıçan embriyonik nöronlar (dorsal kök ganglion ve hipokampus) altın, elektron mikroskobu (EM) ızgaralar üzerinde büyümüş ve 2-D cryo-EM ve 3-D kriyo-kullanarak görüntülü onların neurites için yeterince ince vitreus buz donmuş olabileceğini göstermektedir ET. Hipokampal nevrotiler önceden kriyo-ET 8,10,18,23 kullanarak görüntülü olsa da, bir protokol eksik olmuştur piyasada mevcut cihazlar kullanılarak başarılı çoğaltma için yeterince ayrıntılı. Araştırma hipokampal nevritlerle görselleştirmek için kriyo-E...

Nöronlar alt nöronlar ile iletişim kurmak için bilgi ve aksonlar, genellikle oldukça uzun, almak için dendrit detaylandırılması, merkezi ve periferal sinir sistemlerinin işlev için karmaşık devre esasını kurmak. Nörit gelişimi, sinir sisteminin eleştirel işlevini destekleyen embriyonik gelişim ve nöronal farklılaşma ve neurites bakımı sırasında temel bir rol oynamaktadır. Nöritik işlemleri de nöronal hasar ve rejenerasyon, hem de sinir sistemi bozukluklarında kritik bulunmaktadır. Nöronal mimari çalışma hem normal ve hastalıklı beyin anlamak için çok önemlidir. Neyse ki, fizyolojik olarak ilgili nöronal hücre kültürü sistemleri karmaşık ve heterojen hücre yapıları özetlemek için mevcuttur. Katı deneysel platformlarda, nöronal morfoloji kalitatif ve kantitatif analizleri sağlayacak etkili görselleştirme stratejileri aydınlatılması dayanarak ihtiyaç vardır. Özellikle yararlı olurnanometre ölçeğinde nevritlerle, hem akson ve dendrit görselleştirmek için tutarlı bir platform sağlar ayrıntılı bir metodoloji. Geleneksel elektron mikroskobu gerçek durumundan örneklerinde bozulmalara neden olabilir ki, dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücünün kullanılmasını gerektirir. Böylece bulgular 4,9,25 yorumlanmasını sınırlayıcı - Bugüne kadar, nanometre ölçeğinde en fazla yapısal karakterizasyon gibi sert kimyasallara maruz kalan daha büyük hücrelere veya dokulara dayanmaktadır. Ayrıca, elektron ışını penetrasyon için, 1 mikron kesit 12 daha büyük olan bir kalınlık arzeden organizma veya hücre uzantılar için gereklidir. Nihayet, neurites uzatılmış özelliği hantal tanımı yaparak, ayrık dilim özgü veri setleri toplama doku sonuçları kesitli veya öğütülmüş. Hatta cryo-EM için, bir dondurulmuş, hidratlanmış numune kesit mümkün olduğu, yöntem, sıkıştırma artif getirmektedir1, hareket eder. Son yıllarda, araştırmacılar EM ızgaraları ve flaş dondurma sonradan cryo-ET 8,10,18,23 kullanarak nevritlerle görselleştirmek için sıvı etan onları doğrudan hipokampal nöronlar büyümeye nasıl öğrendim. Ancak, bu tür çalışmalar, bir ısmarlama cihaz 10,23, ya da rutin görselleştirme 8,18 için yeterince ince vitreus buz üretmek için kurutma adım eksikliği bilgilerini kullanın ya. Örneğin, bir çalışma EM ızgara 10 lekeleme için 30-40 sn kullanılmasını önerir, ancak bu değer genel kullanım için optimize edilmiş değil ama bu ölçüye dalma-dondurma cihaz için özeldir. Dalma-dondurma örnek öncesinde nem korumak için özel yapılmış bir cihaz yerine piyasada mevcut bir 17 Kullanımı yaygın tekrarlanabilirlik için bir engel teşkil edebilir. Bu çalışmalar Cryo-ET tarafından nevritlerle görselleştirme çığır olsa da, biz ap keşfetmek için bir adım daha almışnöronal numuneler (hipokampal ve dorsal kök ganglion nöronlarının) çeşitli cryo-ET plicability. Ayrıca, optimal ve optimal sonuçları yanı sıra, böyle bir numune için kriyo-ET kullanarak karşılaşabileceği potansiyel eserler hem de tartışmak. Yakın bir yerli devlet korunması ve nanometre ölçeğinde bütün nevritlerle görselleştirmek için detaylı bir teknik tanımlama ultrastrüktürel çalışmalar yürütmek için daha fazla araştırmacılar için yeteneğini geliştirmek olacaktır. Bu amaçla, nevritler görselleştirmek için sabitlenmemiş, boyanmamış nöronlar hazırlamak için ticari olarak temin edilebilen ekipman kullanılarak etkili ve detaylı bir protokol açıklar. Bu sağlıklı neurites ultrastrüktürünü detaylandırma ve yapısal farklılıkları sinir sistemi hastalık modellerinde mevcut ne anlamak için zemin hazırlamaya yönelik önemli bir ilk adımdır. Cryo-ET nanometre ölçeğinde 3-D sabitlenmemiş, boyanmamış nörit özelliklerini çözebilirsiniz yana, yöntem mümkün asla gibi olacaktır yapacaknevritik mimarisini 12 tanımlamak için fore.

<table><tbody><tr><td>Dumont #7 Cımbız</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72803-01</td><td>EM ızgaraları işlemek için Cam</td></tr><tr><td>alt tabaklar</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>Numune yetiştirmek için</td></tr><tr><td>Elektron mikroskobu ızgaraları</td><td>Quantifoil</td><td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td><td>Numune yetiştirmek için</td></tr><tr><td>Kalsiyum içermeyen filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>1541-055</td><td>Leke numunesi için</td></tr><tr><td>Büyük düz uçlu uzun cımbız</td><td>Excelta Corporation</td><td>E003-000590, 25-SA</td><td>Lekeleme numunesi için&nbsp;</td></tr><tr><td>Vitrifikasyon cihazı ve cımbız</td><td>FEI</td><td>Vitrobot Mark III</td><td>Numuneyi dondurmak için</td></tr><tr><td>Minigrid saklama kutuları</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>160-40</td><td>EM ızgaralarını depolamak için</td></tr><tr><td>Kriyo transfer tutucu</td><td>Gatan</td><td>626 Tek Eğimli Sıvı Nitrojen Kriyo Transfer Tutucu</td><td>Görüntüleme örnekleri için</td></tr><tr><td>Yarı otomatik eğim serisi toplama yazılımı</td><td>SerialEM</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td> <td>Görüntüleme örnekleri için</td></tr><tr><td>Görüntü işleme yazılımı</td><td>IMOD eTomo</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td> <td>Görüntü işleme için</td></tr><tr>CryoEM <td>JEOL, Tokyo</td> 200-kV <td>için transmisyon elektron mikroskobu</td><td>JEM2100 LaB6 elektron mikroskobu</td><td>Görüntüleme örnekleri için</td></tr><tr><td>4k x 4k CCD kamera</td><td>Gatan</td><td>N/A</td><td>Görüntüleme örnekleri için</td></tr><tr><td>3-D not alma yazılımı</td><td>Visage Imaging GmbH</td><td>Amira/Avizo</td><td>3D verileri işlemek</td></tr><tr><td>için 2D görüntüleri dijital olarak birleştirme yazılımı</td><td>Adobe</td><td>Adobe Photoshop</td><td>2-D veri işlemek için</td></tr><tr><td>DMEM, Yüksek Glikoz</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td>Hipokampal kültür için</td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-0252</td><td>Hipokampal kültür için</td></tr><tr><td>Sodyum tetraborat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-9876</td><td>Hipokampal kültür için</td></tr><tr><td>Poli-L-lizin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636-500MG</td><td>Hipokampal kültür için</td></tr><tr><td>Filtre sistemi</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>Hipokampal kültür için</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>DRG kültürü için</td></tr><tr><td>B-27 takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>DRG kültürü için</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>DRG kültürü için</td></tr><tr><td>DRG kültürü için</td> <td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>Rekombinant sıçan b-NGF</td><td>R& DRG kültürü için D Sistemleri</td><td>556-NG</td><td>DRG kültürü için</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr><tr><td>DRG kültürü için</td><td>5'-Floro-2'-deoksiüridin</td><td>Sigma</td><td>F0503-100MG</td></tr><tr><td>DRG kültürü için</td> <td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td></tr></tbody></table>

cryo-elektron tomografi kullanma frozen-hidratlı devlette neurites görselleştirme İlköğretim nöronlar hazırlanması

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Nöritler, hem dendrit ve aksonlar, nöronlar arasındaki elektriksel uyarıların iletimini sağlayacak nöronal hücresel süreçleri vardır. Neurites yapısının tanımlanması, bu işlemler, sinaptik iletişim destek malzemeleri ve sinyalleri nasıl hareket anlamak için çok önemlidir. Elektron mikroskopisi (EM) geleneksel nevritlerin içindeki ultrastrüktürel özellikleri değerlendirmek için kullanılmıştır, ancak dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücüye maruz kalma yapıları bozabilmektedir. Önemli bir karşılanmamış hedefi böyle eserler etkilenmez yapısal değerlendirmeler için izin prosedürlerin oluşturulmasıdır. Burada, biz büyüyen ve kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ile muayene ile takip elektron mikroskobu ızgaraları farklı primer nöronlar flaş dondurma bütün nevrotiler için detaylı ve tekrarlanabilir bir protokol kurduk. Bu teknik asse kolaylaştıran, nanometre çözünürlükte donmuş, hidratlı neurites 3-D görselleştirme sağlarmorfolojik farklılıklar ssment. Bizim protokol dorsal kök ganglion (DRG) nevritler ve onların yakın yerli devlet hipokampal neurites bir görselleştirme görülmemiş bir görünüm verir. Gibi, bu yöntemlerin normal nöronlar ve nörolojik bozukluklar etkilenenlerin hem neurites gelecek çalışmalar için bir temel oluşturabilir.

Önceki cryo-ET ile dondurma ve görüntüleme için, ışık mikroskobu ve görüntüler nöronlar üzerinde büyüdüğü EM ızgaranın alınmalıdır. Nöritler birbirleri ile önemli örtüşme olmaksızın açıkça görünür olmalıdır. Şekil 3A&#39;da renkli bir kutu büyütüldüğünde nevrotiler ızgara kafes boyunca uzandığı Şekil 3B, daha yüksek büyütme göstermek için bir alanı temsil eder. Her ızgara-kare nöronlar ve onların nevritlerle destekleyen bir holey karbon film oluşur. Bu delikler, dışarı doğru çıkıntı nör...

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Bu prosedürün genel amacı, primer sıçan nöronlarını, kriyojenik elektron mikroskobu ile görselleştirmeye uygun olacak şekilde büyütmektir. Bu işlem, öncelikle primer nöronların ekimi için EM ızgaraları içeren kapların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise primer nöronların hazırlanması ve EM ızgaraları üzerine ekilmesidir.Ardından, EM ızgaraları üzerindeki nöronların vitrifikasyonu gerçekleştirilir. Son adım, kriyojenik elektron mikroskopi ile görüntülerin toplanması, ardından gelen işlem sonrası analiz ve açıklama ekleme aşamasıdır. Nihayetinde, nöritlerin donmuş hidrate durumdaki ultra yapısını göstermek için kriyojenik elektron mikroskopi ve tomografi kullanılır.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kimyasal sabitleyiciler kullanmadan dondurulmuş hidrate nöritlerin nanometre çözünürlükte 3D görselleştirmesi için kullanılabilmesidir. Böylece, doğal duruma daha yakın olan morfolojik özelliklerin değerlendirilmesi kolaylaşır. Altın EM ızgaraları üzerindeki delikli karbonun bütünlüğünü inceleyerek bu prosedüre başlayın.En az 25 kat büyütme kapasitesine sahip bir ışık mikroskobu kullanarak, karbon deliklerinin %98'inden fazlasının sağlam olduğundan emin olun. Primer nöronların ekimi için, EM ızgaralarını alevle sterilize etmek ve aynı zamanda onları hidrofilik hale getirmek için bir bunsen beki kullanın. Izgarayı, karbon yüzeyi yukarı gelecek şekilde hemen camın merkezine transfer edin.Alt kap olarak, her bir kaba bir adet EM ızgarası yerleştirin ve yalnızca önceden sterilize edilmiş cam tabanlı kaplar kullanın. Ardından, EM ızgarası cam tabanlı kabın içindeyken, bir doku kültürü davlumbazı altında ışık mikroskobu kullanarak ızgara bütünlüğünü kontrol edin ve Petri kabının merkezi cam alanına 250 microliters uygun kaplama maddesi uygulayın. Uygun kaplama maddesinin tüm EM ızgarasını kapladığından yavaşça ve dikkatlice emin olun.Ardından, Petri kabını kapağıyla kapatın ve örnekleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, çeker ocak içindeki vakum tüpüne takılı steril bir pipet ucuyla kaplardaki tüm poliol lizin karışımını aspire edin. E EM ızgarasıyla doğrudan temastan kaçının.Ardından, her bir Petri kabının merkezindeki cam alanında bulunan EM ızgarasını tamamen kaplamak için ayarlanabilir bir hava deplasmanlı pipet kullanarak dikkatlice 250 µL steril PBS uygulayın. Daha sonra PBS'yi her bir kaptan aspire edin. Bu prosedürü üç kez tekrarlayın.EM ızgaralı kapların doku kültürü kabininde 15 dakika boyunca kurumasına izin verin. Işık mikroskobu altında kontrol edin. Tamamen kuruduklarından ve ızgara içinde nem kabarcığı kalmadığından emin olun.Aksi takdirde, bu fazla nemi gidermek için EM ızgarasının yanından dikkatlice aspire edin; kaplanmış ızgara, nöronların ekimi için hemen kullanılmalıdır. Bu prosedürde, kap başına mililitrede 50.000 hücre konsantrasyonu elde etmek için her kap için uygun hücre hacmini hesaplayın. Tüm kabı değil, sadece merkezi cam alanı doldurmak için uygulanacak maksimum miktar 250 microliters olmalıdır.Ardından, hücrelerin toparlanması ve yapışması için kapları 37 °C'deki bir CO2 inkübatöründe 30 dakika boyunca inkübe edin; 30 dakika sonra, her bir kaba yavaşça 1,5 mL ısıtılmış hücre besiyeri ekleyin ve hipokampal nöronlar için EM ızgarasına dokunmamaya özen gösterin. Besiyerini ertesi gün değiştirin ve ardından 14 gün boyunca iki günde bir besiyerinin yarısını yenileyin. Bu prosedürde; nem odalı bir vitrifikasyon cihazı, kalsiyum içermeyen filtre kağıdı, bir çift uzun düz uçlu cımbız, vitrifikasyon makinesi için bir çift ince uçlu özel cımbız, bir sıvı azot doldurucu, bir soğutucu kap ve EM ızgara saklama kutusu dahil olmak üzere, altın EM ızgaraları kriyojenik sıcaklıkta dondurmak ve saklamak için gerekli tüm ekipman ve malzemeleri hazırlayın.Ardından vitrifikasyon cihazını açın. Nem oranını %100'e, sıcaklığı ise 32 °C'ye ayarlayın. Seçenekler bölümünden blok süresini sıfır saniye olarak ayarlayın.Bu, nem odasının yan penceresinden manuel kurulama yapılmasına olanak tanır. Ardından üç adet kalsiyumsuz filtre kağıdını üst üste dizin. Bu yığını 0,5 santimetre genişliğinde ve yaklaşık iki santimetre uzunluğunda şeritler halinde kesin; sonrasında, kağıdın bir bölümü 0,5 santimetre çarpı 0,5 santimetre olacak şekilde bunları 90 derecelik bir açıyla bükün.Bu bölüm örneği kurulamak için kullanılacaktır. Ortadaki kağıdı çıkarın ve kullanıma kadar başka bir kalsiyumsuz filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Ardından, EM ızgarasını kaptan dikkatlice almak için özelleşmiş vitrifikasyon cımbızını kullanın.Nöronların büyüdüğü EM grid tarafını not edin, çünkü konum bir sonraki adım için önem arz edecektir. Ardından, cımbızı EM gride güvenli bir şekilde sabitlemek için cımbız üzerindeki siyah kayar kilidi kullanın. Şimdi cımbızı, nöronların yapışık olduğu EM grid tarafı sola bakacak ve vitrifikasyon makinesinin yan tarafındaki dairesel açıklık deliğinden uzağa yönelecek şekilde vitrifikasyon makinesine yerleştirin.Ardından, EM ızgarasını tutan cımbızı vitrifikasyon makinesinin içine geri çekin. Sonrasında, vitrifikasyon makinesinin uygun ekran komutunu kullanarak, yeterli miktarda LN2 ve sıvı etan ile doldurulmuş soğutucu kabı vitrifikasyon makinesinin uygun tutucusuna yerleştirin. Soğutucu hazneyi, düz uçlu cımbız yardımıyla nem haznesinin tabanıyla aynı seviyeye gelene kadar yukarı kaldırın.Filtre kağıdının bir kenarını, kısa kenarı cımbıza dik olacak şekilde tutun. Bu yüzey, kurulamak için EM ızgarasıyla doğrudan temas edecektir. Şimdi, filtre kağıdını nem odasının yan deliğine dikkatlice ve sabit bir şekilde yerleştirin. Kağıdı 10 saniye boyunca EM ızgarasına karşı tutun, ardından kağıdı atın ve derhal dondurma işlemine (plunge) geçin.Vitrifikasyon cihazının otomasyonunu kullanarak numuneyi sıvı etan içinde dondurun. Ardından, dondurulmuş hidratize EM ızgarasını dikkatlice ızgara depolama alanındaki yuvalardan birine aktarın. Bu, iki hafta boyunca rat primer nöronlarının büyütüldüğü bir EM ızgarasının merkez bölgesinin 10 kat büyütmedeki ışık mikroskobu görüntüsüdür.Burada, nöronların ve nörit çıkıntılarının gözlemlendiği turkuaz kutunun yakınlaştırılmış görünümü yer almaktadır. Bu, nöron gövdesinden dışarı doğru uzanan bir nöritin 4K büyütmedeki elektron mikrografıdır. Mavi kutu burada yakından görülmekte olup, nöritlerin iç yapıları 20 K büyütmede net bir şekilde seçilebilmektedir.Bu video, sıçan hipokampal nöronlarının primer kültüründen alınan bir nöritin mikroğraflarından oluşturulmuş 3D yeniden yapılandırılmış bir yığınını göstermektedir. Görüntüleme tomografi ile yapılmış olup ardından ilgili 3D renkli açıklama verilmiştir. Burada, kriyojenik elektron tomografisi kullanılarak toplanan bir sıçan dorsal kök ganglion aksonunun 3D yeniden yapılandırılmış görüntü yığınını ve ardından ilgili 3D renkli açıklamayı gösteren başka bir video yer almaktadır; ayrıca burada, ayrı bir sıçan dorsal kök ganglion aksonuna ait 20 K büyütmede çekilmiş dört adet 2D kriyojenik EM görüntüsünden oluşan montaj görülmektedir.Bu videoyu izledikten sonra, primer nöronların, kriyojenik elektron tomografi kullanılarak donmuş hidrate durumdaki nöronların görselleştirilmesine uygun şekilde elektron mikroskobu ızgaraları üzerinde nasıl hazırlanacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Schönherr, S., et. al. Fare Amigdalasındaki Glutamat Reseptörlerinin Girişe Özgü Düzenlemesini İncelemek için Kombine Optogenetik ve Donma Kırığı Replika İmmün Etiketleme. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, elektron mikroskobu için fare beyin dokusunun donarak kırılmış kopyalarının immüno-etiketlemesini göstermektedir. Kırılmış ve kaplanmış kopyalar, reseptörleri açığa çıkarmak için sindirilir. Primer ve altın etiketli sekonder antikorlar, spesifik nöronal membran reseptörlerini etiketlemek...

Fare Beyin Dokusunun Donarak Kırılmış Bir Örneğinde Nöronal Membran Proteinlerinin İmmünoetiketlenmesi

Biz bir doku örnekleri içinde bulunan uzun dendritik ağaçlar nöronlar görselleştirmek amacıyla, kalın beyin bölümlerinde, Golgi-Cox boyama yöntemi kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokolün iki varyantları da cresyl menekşe karşıtboyama ve uzun süreli depolama için işlenmemiş beyinleri dondurulmasını içerdiğini sunulmaktadır.

Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Nöronal öncülerin in vitro lentiviral mühendisliğine dayanarak, vahşi tip beyinleri ve "test" ve "kontrol" türevlerinin eş-transplantasyonu, bu yöntem, neokortikal in vivo gen kontrolünde doğru modelleme sağlar basit ve ekonomik bir şekilde nöron morfoloji.

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Burada, kriyo yumuşak X-ışını tomografisinde (SXT) kriyo-korunmuş hücrelerin ultrayapısını 25 nm yarım perde çözünürlükte görüntülemek için gerekli numune hazırlama ve veri toplama adımlarını açıklayan bir protokol sunulmaktadır.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Bu protokolün amacı, hücre yapıştırma ve büyümesini kriyo-elektron mikroskopisi için hedeflenen ızgara alanlarına yönlendirmektir. Bu, kullanıcı tarafından belirtilen desenlerde ablated bir anti-kirlenme tabakasının uygulanması ve ardından hücre tohumlamadan önce desenli alanlarda hücre dışı matris proteinlerinin birikmesi ile elde edilir.

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Bu protokol, kalın dokular için kriyo-elektron tomografisini (kriyo-ET) standartlaştırır; yüksek basınçlı dondurma (HPF) ile waffle yöntemi, kriyojenik odaklı ion ışını (kriyo-FIB) kaldırma ve doz-simetrik, paralel alım ile entegre edilir; böylece fare hipokampusunda tekrarlanabilir in situ analizi için uniform ince lameller ve vitrifikasyon örnekler elde edilir.

Fare Hipokampusunda Kalın Dokular İçin Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışı Gösterildi

Öğrenin, kriyojenik elektron tomografisi kullanarak dondurulmuş-hidratlı durumdaki primer sıçan nöronlarının ultrayapısını nasıl görselleştireceğinizi. Bu yöntem, kimyasal fiksatif kullanmadan nanometre çözünürlüğünde 3D görüntüleme sağlar.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Daha fazla video keşfet