Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Bu prosedürün genel amacı, birincil sıçan nöronlarını, nöronları kriyo-elektron mikroskobu ile görselleştirmeye uygun olacak şekilde büyütmektir. Bu, önce birincil nöronları kaplamak için EM ızgaraları ile yemekler hazırlayarak gerçekleştirilir. İkinci adım, birincil nöronları EM ızgaraları üzerinde hazırlamak ve plakalamaktır.

Daha sonra, EM ızgaraları üzerindeki nöronların vitrifikasyonu gerçekleştirilir. Son adım, kriyo-elektron mikroskobu ile görüntüleri toplamak, ardından son işleme ve açıklama yapmaktır. Sonuç olarak, kriyo-elektron mikroskobu ve tomografi, donmuş hidratlı bir durumda nöritlerin ultra yapısını göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, kimyasal fiksatifler kullanılmadan nanometre çözünürlükte donmuş hidratlı nöritlerin 3D görselleştirilmesi için kullanılabilmesidir. Bu nedenle, doğal duruma daha yakın olan morfolojik özelliklerin değerlendirilmesini kolaylaştırmak. Bu prosedüre, altın EM ızgaraları üzerindeki kutsal karbonun bütünlüğünü inceleyerek başlayın.

En az 25 kat büyütme oranında bir ışık mikroskobu kullanarak, karbon deliklerinin %98'den daha büyük sağlam olduğundan emin olun. Birincil nöronları kaplamak için, EM ızgaralarını alevle sterilize etmek ve aynı anda hidrofilik hale getirmek için bir bunsen brülörü kullanın. Izgarayı karbon tarafı yukarı bakacak şekilde hemen camın merkezine aktarın.

Alt tabak, tabak başına bir EM ızgarası yerleştirin ve yalnızca önceden sterilize edilmiş cam tabanlı tabaklar kullanın. Ardından, ızgara bütünlüğünü kontrol etmek için bir ışık mikroskobu kullanın, EM ızgarasını bir doku kültürü başlığında cam alt çanağın içinde tutarken, Petri kabının merkezi cam alanına 250 mikrolitre uygun kaplama maddesi uygulayın. Yavaş ve dikkatli bir şekilde, uygun kaplama malzemesinin tüm E EM ızgarasını kapladığından emin olun.

Daha sonra, Petri kabını kapağıyla kapatın ve örnekleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, davlumbazdaki vakum tüpüne bağlı steril bir pipet ucu ile bulaşıklardaki tüm poliol lizin karışımını aspire edin. E EM şebekesi ile doğrudan temastan kaçının.

Ardından, her bir Petri kabının merkezi cam alanındaki EM ızgarasını tamamen kaplamak için 250 mikrolitre steril PBS'yi dikkatli bir şekilde uygulamak için ayarlanabilir bir hava deplasmanlı pipet kullanın. Ardından PBS'yi her tabaktan aspire edin. Bundan sonra işlemi üç kez tekrarlayın.

EM ızgaralı bulaşıkların doku kültürü başlığında 15 dakika kurumasını bekleyin. Işık mikroskobu altında kontrol etme. Tamamen kuru olduklarından ve ızgarada nem kabarcığı olmadığından emin olun.

Aksi takdirde, bu ekstra nemi ortadan kaldırmak için EM ızgarasının yanında dikkatlice aspire edin, kaplanmış ızgara nöronları kaplamak için hemen kullanılmalıdır. Bu prosedürde, tabak başına mililitre başına 50.000 hücre konsantrasyonu elde etmek için her tabak için uygun hücre hacmini hesaplayın. Maksimum uygulama miktarı 250 mikrolitre olmalı ve kabın tamamını değil, sadece merkezi cam alanını doldurmalıdır.

Daha sonra, hücrelerin 30 dakika sonra iyileşmesini ve yapışmasını sağlamak için bulaşıkları 37 santigrat derecede bir CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin, her yemeğe yavaşça 1.5 mililitre ısıtılmış hücre ortamı ekleyin ve EM ızgarasına dokunmaktan kaçının hipokampal nöronlar için. Medyayı ertesi gün değiştirin ve ardından 14 gün boyunca her iki günde bir medyanın yarısını değiştirin. Bu prosedürde, nem hazneli bir vitrifikasyon cihazı, kalsiyum içermeyen filtre kağıdı, bir çift uzun düz uçlu cımbız, vitrifikasyon makinesi için bir çift ince uçlu özel cımbız, bir sıvı nitrojen yapıcı, bir soğutma sıvısı kabı ve EM ızgara saklama kutusu.

Ardından, vitrifikasyon cihazını açın. Nemi% 100'e ve sıcaklığı 32 santigrat dereceye ayarlayın. Seçenek bölümünde, blok süresini sıfır saniye olarak ayarlayın.

Bu, nem odasının yan camından manuel olarak lekelemeye izin verir. Ardından üç kalsiyum içermeyen filtre kağıdını istifleyin. Yığını yaklaşık iki santimetre uzunluğunda 0,5 santimetre genişliğinde şeritler halinde kesin, bundan sonra kağıdın bir bölümü 0,5 santimetre x 0,5 santimetre olacak şekilde 90 derecelik bir açıyla bükün.

Bu bölüm, numuneyi lekelemek için kullanılacaktır. Ortadaki kağıdı çıkarın ve kullanana kadar başka bir kalsiyum içermeyen filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Ardından, EM ızgarasını çanaktan dikkatlice seçmek için cımbızlamak için özel vitrifikasyonu kullanın.

EM ızgarasının nöronların büyüdüğü tarafına dikkat edin, çünkü pozisyon bir sonraki adım için önemli olacaktır. Ardından, cımbızları EM ızgarasına güvenli bir şekilde kilitlemek için cımbız üzerindeki siyah sürgülü kilidi kullanın. Şimdi cımbızları, nöronların yapıştırıldığı EM ızgarasının tarafı vitrifikasyon makinesinin yan tarafındaki dairesel açma deliğinden sola ve uzağa bakacak şekilde vitrifikasyon makinesine yerleştirin.

Ardından EM ızgarasını vitrifikasyon makinesine tutan cımbızı geri çekin. Daha sonra, yeterli LN iki ve sıvı etan ile doldurulmuş soğutma sıvısı kabını, vitrifikasyon makinesinin uygun ekran komutunu kullanarak vitrifikasyon makinesinin uygun tutucusuna yerleştirin. Soğutma sıvısı odasını, düz uçlu cımbızla nem odasının alt kısmıyla aynı hizaya gelene kadar yukarı doğru kaldırın.

Filtre kağıdının bir kenarını, kısa kenarı cımbıza dik olacak şekilde kavrayın. Bu yüz, lekeleme için EM ızgarası ile doğrudan temas edecektir. Şimdi, filtre kağıdını nem odasının yan deliğine dikkatlice sağlam bir şekilde yerleştirin Kağıdı EM ızgarasına 10 saniye tutun, kağıdı atın ve hemen daldırın.

Vitrifikasyon makinesinin otomasyonunu kullanarak numuneyi sıvı etan içinde dondurun. Daha sonra, donmuş hidratlı EM ızgarasını dikkatlice ızgara deposundaki yuvalardan birine aktarın. Bu, sıçan birincil nöronlarının iki haftadır büyümekte olduğu 10 kat büyütmede bir EM ızgarasının merkezi alanının bir ışık mikroskobu görüntüsüdür.

İşte nöronların ve nörit projeksiyonlarının gözlemlendiği su kutusunun yakınlaştırılmış görünümü. Bu, 4K büyütmede nöron gövdesinden dışa doğru çıkıntı yapan bir nöritin elektron mikrografıdır. Nöritlerin iç özelliklerinin 20 K büyütmede açıkça görülebildiği mavi kutu burada yakından görülüyor.

Bu video, sıçan hipokampal nöronlarının birincil kültüründen bir nöritin 3D yeniden yapılandırılmış mikrograf yığınını göstermektedir. Tomografi kullanılarak görüntülenir ve ardından ilgili 3D renk açıklaması gelir. Burada, kriyo-elektron tomografisi kullanılarak toplanan bir sıçan dorsal kök ganglion aksonunun 3B yeniden yapılandırılmış bir görüntü yığınını ve ardından karşılık gelen 3B renk açıklamasını gösteren başka bir video ve burada gösterilen, ayrı bir sıçan dorsal kök ganglion aksonunun dört adet 2B kriyo-EM görüntüsünün montajıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, elektron mikroskobu ızgaralarında birincil nöronların, nöronlarını kriyo-elektron tomografisi kullanarak donmuş hidratlı bir durumda görselleştirmeye uygun bir şekilde nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.