Name: MicroRNA In situ Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Öğrenin, formalin sabit böbrek dokularında mikroRNA ifadesini lokalize ve kantite etmek için optimize edilmiş in situ hibridizasyon protokolünü. Bu yöntem, böbrek bölgelerinde ve nefron segmentlerinde mikroRNA ekspresyon modellerini görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen HL082798 ve HL111580 verir.

1.. Böbrek Doku Bölümler <ol><li> Formalin-sabit (% 10) parafin-gömülü böbrek bölümleri slaytlar analizden önce birkaç ay boyunca saklanabilir bir Microm HM 355 S. kullanılarak 5 mm kalınlığında mikroskop lamı üzerine kesilir. </li></ol> 2. Çözüm Hazırlığı <ol><li> Bir Otoklavlanabilir vida üst şişede GKD 2 O 1x PBS 1 L hazırlayın. GKD 2 O. 1 L ile bir şişe doldurun Her şişe, kapak DEPC 1 ml ekleyin ve şiddetle çalkalanır. Çözümler RNaz&#39;larına yok etmek ve daha sonra otoklavlanmasıdır gece oda sıcaklığında bekletin. PBS-T için 400 ml Tween-20 1x PBS L 1 ekle. </li><li> Proteinaz K tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve DEPC 1 mM CaCl2 su muamele edilmiş) hazırlayın. </li><li> PBS-T içinde% 0.2 glisin içeren bir çözelti hazırlayın. </li></ol> 3. Doku Hazırlanması <ol><li> Hibridizasyon tamponu büyük bir hacim% 50 Formamid oluşan (50-100 ml), 5x SSC,% 0.1 Tween, 9,2 hazırlanmasıpH 6, 50 ug / ml heparin ve DEPC içinde 500 ug / ml maya RNA için ayarlama için mM sitrik asit GKD 2 O. muamele -80 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve depoya Böl </li><li> Her biri 5 dakika için taze ksilen içinde 3 kez yıkayarak dokudan parafin çıkarın. </li><li> GKD 2 O. etanol konsantrasyonunu (% 100,% 75,% 50 ve% 25) azaltmada 5 dakika inkubasyon ile doku bölümleri rehidrate </li><li> Tam olarak 1 dakika boyunca doku bölümleri (yaklaşık olarak 0.4-0.5 mi) karşılamak için yeterli DEPC ile slaytlar tedavi. Emin olun dokular kuru değil. </li><li> DEPC yılında slaytlar uygun bertarafı için DEFPC içeren atık toplama, 5 dakika boyunca iki kez PBS-T tedavi durulayın. Tüm reaktifler DEPC bu noktadan RNaz&#39;larına ortadan kaldırmak için tedavi edilmelidir. </li><li> Ön ısıtılması Proteinaz K tamponu ve 10 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar proteinaz K ilave edin. Proteinaz K solüsyonu ile doku bölümleri kapak ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Çabuk proteinas çıkarıne K çözeltisi ve 30 saniye için PBS-T içinde% 0.2 glisin ekleyin. </li><li> DEPC içinde durulayın slaytlar 30 saniye, her iki kez PBS-T işlemden geçirildi. </li><li> 10 dakika boyunca taze% 4 paraformaldehid içinde bölümleri düzeltildi. </li></ol> 4. Melezleme <ol><li> Hibridizasyon tamponu 50 ul (% 50 formamid, 5x SSC,% 0.1 Tween, pH 6, 50 ug / ml heparin, 500 ug / ml maya RNA için ayarlama için 9.2 mM sitrik asit) doku kesiti başına ekleyin ve RNAse serbest HybriSlips ile kapağı doku bölümleri biraz daha büyük kesilir. </li><li> 3 &#39;digoksigenin işaretli prob (sonda genellikle Tm için belirlenmiş DNA melezleştirme sıcaklığında 2 saat boyunca nem kontrollü bir hibridizasyon fırınında Prehybridize bölümler -21 ° C, miR-382 için (örneğin, 54 ° C, DNA Tm = 75 ° C, sonda ), bölmeyi tutmak için% 50 formamide/50% 5x SSC batırılmış doku laboratuar mendil ile nemlendirilir. </li><li> MiRNA probu, pozitif kontrol (U6 küçük nükleer RNA) ve negatif kontrol (şifreli sulandırmakhibridizasyon tamponu içinde 40 nM&#39;ye sekans) (tampon maddesi 75 ul), her bölüm gereklidir. </li><li> 5 dakika boyunca 65 ° C&#39;de hibridizasyon tamponu içinde probu ısıtın. </li><li> Melezleme fırını slaytları çıkarın ve melezleme gelen lamelleri ve aşırı hibridizasyon tamponu çıkarın. </li><li> Doğrudan dokuya, doku Bölüm başına prob ihtiva eden bir tampon içinde 75 ul ekle. Doku bölümleri kapsayacak kadar sadece büyük HybriSlips ile doku örtün. </li><li> Slayt tutucu düzeyde tutulması, Aşama 4,2 (yaklaşık 16 saat) arası bir sıcaklıkta gece boyunca inkübasyon için melezleme fırını dönün. </li></ol> 5. Sertliği Yıkama <ol><li> Dokudan lamel serbest bırakmak için sadece lamelleri bir kenarının altında hibridizasyon sıcaklığa ısıtılmış 200 ul 2x SSC ekleyin. Slayt eğerek lamel çıkarın. </li><li> 30 dakika her biri için melezleştirme sıcaklık 3x% 50 formamid,% 50 2 x SSC içinde 200 ul slaytlar yıkayın. </li><li> DurulamaSlaytlar düşük hızda orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika her biri için oda sıcaklığında PBS-T içinde 5 kat. </li></ol> 6. Bulma <ol><li> Düşük hızda orbital bir karıştırıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle (% 2 keçi ya da at serumu, 2 mg / ml PBS-T içinde BSA) bloke slayt inkübe edin. </li><li> 1:100 bloke edici tampon içinde bir anti-DIP-AP Fab fragmanları seyreltin. Doku Bölüm başına 100 ul ekleyin ve HybriSlips ile kapak bölümünü kaplayacak kadar sadece büyük kesti. </li><li> 4 ° C&#39;de, gece boyunca (yaklaşık 16 saat), bir nemlendirilmiş oda içinde antikor inkübe edin. </li><li> Düşük hızda orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika her biri için, PBS-T 7x slaytlar yıkayın. </li><li> 5 dakika her biri için, 3x (100 mM TrisHCI pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl,% 0.1 Tween 20) ön-arka tampon maddesi içinde slaytlar yıkayın. </li><li> AP tamponuna NBT / BCIP solüsyonu (200 mi μl/10 tamponu) </li><li> Tamamen tüm doku bölümleri kapsayacak şekilde her slayt için seyreltilmiş NBT / BCIP çözeltisi 400-500 ml ekleyin. Karanlık, seviye, gösterilmeyen nem Develop4-5 saat için IED odası. </li></ol> 7. Montaj Slaytlar <ol><li> 5 dakika her biri için etanol konsantrasyonlarını (% 25,% 50,% 75,% 100) artan bölümleri kurutmak. </li><li> Bölümleri temizlemek için ksilen 5x inkübe. </li><li> Dağı Permount montaj orta ve kuru gecede slaytlar. </li></ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
<li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats%3A+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li>
<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Bu makalenin amacı formalin sabit böbrek dokularında iyi çalışır in situ hibridizasyon miRNA için bir protokol açıklar oldu. Bu protokol üzerinde çalışırken boyama dışlayıcı birçok önemli kaynakları tespit edilmiştir. Bu noktalara dikkat ve özen boyama objeyi önlemek ve başarılı ISH çalıştırmak olasılığını artırabilir. Haline doku bölümleri uzun inkubasyon sırasında kuruduğunda boyama dışlayıcı en önlenebilir nedenlerinden biri oluşabilir. Bu durumda, kurutuldu olur doku bölümü NBT ...

MicroRNA endojen olarak üretilir kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar (yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda) küçüktür. Bunlar genellikle translasyon baskı veya mRNA degradasyon yoluyla protein ekspresyonunu engellemek için çalışır. eksik tamamlayıcılık mRNA hedeflere miRNA&#39;ların bağlamak mümkün, tek bir miRNA çoklu hedefleri bastırmak için yapım. Hücre tipleri ve yapılarının miRNA&#39;lar ifade anlayış mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir parçası olan aracılığıyla miRNA ifade etkisi hücre ve doku fenotipleri değişiklikler. Bu tür sıralama MiRNA, QPCR ve Kuzey beneklemesi gibi yöntemler bütün dokularda miRNAs tespiti için kullanılabilecek olmakla birlikte, bu yaklaşım, bir de, belirli bir doku içinde gelen hangi belirli bir hücre tipi belirlemek için izin vermez. Bu yöntemlerle analizden önce hücresel ve yapısal bileşenlerin Diseksiyon çok zor olabilir ve yeterli izolasyonların elde etmek için gerekli olan koşullar al yol açabilirgen ekspresyonu ya da RNA&#39;lar parçalanmasında önemli ola. in situ hibridizasyon microRNA dokularda microRNA konumu ve ekspresyon seviyelerini görselleştirmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu teknik, böbrek gibi heterojen yapıların, oluşan dokularda, özellikle değerlidir. MicroRNA böbrek gelişimi 2,3 ve fizyoloji 4 düzenleyici bir rol oynadığı gösterilmiştir. microRNA sentezleme değişiklikler, aynı zamanda, 5-10 fibrosis, diabetik nefropati 7, renal karsinom 11,12 ve akut böbrek hasarı 13 gibi renal patoloji ile ilgili olduğu gösterilmiştir. Bizim araştırmada, böbrek dokularında in situ hibridizasyon mıkroRNA optimize sağlık ve hastalık 14 hem de miRNA ifade tesisinin yapısal yeri saptanması için değerli olduğunu bulduk. Farklı microRNA boru şeklindeki ve hücresel ifade belirlenmesi önemlidir, çünkü ta onların düzenlenmesirgets hücre fonksiyonları bağlı olabilir. Hastalıklı eyaletlerde bu miRNA ifadesi değişiklikler fonksiyonunu etkileyen olabilir belirlemek için de önemlidir. Burada tarif edilen yöntemin amacı Kloosterman et al. 15, diğer araştırmacılar 16,17 tarafından geliştirilen mevcut ISH yöntemleri üzerine inşa etmek için, ve bu Exiqon 1 tarafından verilir ve formalin sabit böbrek dokularında yöntemini optimize eder. Biz başarıyla tek taraflı üreter 18 ile böbrek mıkroRNA miR-382 ifadesinde belirgin bölgesel farklılıkları belirlemek için bu yöntemi kullandık. Bu yaklaşım ek optimizasyonu ile, hem de diğer dokuları ile kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Dietil Pirokarbonat</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ksilenler</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ultra Saf</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Ömrü Teknolojiler</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>JT Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik Asit</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC Tampon Ömrü</td><td>Teknolojileri</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>Maya RNA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- miRNA probu</td><td>Exiqon</td><td>miR bağımlı-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- Şifreli miR probu</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3' DIG- U6 miR probu</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Fisher</td><td>Doku boyutuna</td><td></td>uygun</tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>Kaydıraklı Hibridizasyon Fırını</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Tepsi Montajı</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Raf Geçmeli</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna<em&gt; in situ</em&gt; formalin sabit böbrek dokular hibridizasyon

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

Bu yazıda microRNA problar etiketlenmiş digoksijenin ile in situ melezleme yoluyla böbrekte miRNA kolorimetrik tespiti için bir yöntem tarif eder. Başlangıçta Kloosterman ve Exiqon miRNA sondalar 1 ile geniş kullanım için meslektaşları tarafından geliştirilen bu protokol, böbrek dokularında miRNA analizinde doğal zorlukları aşmak için modifiye edilmiştir. Bunlar yapı tespiti ve kalıntı prob ve antikor çıkarmak zor gibi konuları içerir. Nispeten ince kullanımı olup, 5 mm kalınlığında, güçlü bir prob sinyal hücrelerinde muhafaza ederken, böbrek yapıları net bir görünüm için izin verilen doku kesitleri. Ayrıca, prob konsantrasyonu ve inkübasyon koşulları Düşük arka plan ve spesifik olmayan sinyal ile mıkroRNA ifade görselleştirme kolaylaştırmak için optimize edildi. Burada, optimize edilmiş prosedür protokolü sonunda slaytların montajı yoluyla ilk doku toplanması ve hazırlama kaplama açıklanmaktadır. Temel componeBu protokolün nts diğer doku ve hücre kültürü modelleri uygulama için değiştirilebilir.

Hibridizasyonlar, inkubasyon sırasında kurutulmuş veya NBT / BCIP gelişimi sırasında daha koyu lekelere sona genellikle yıkama aşamaları olur bir doku kesitinin alanları. 1 HybriSlip kenarının kaymış olduğu bir böbrek bölümünün bir bölümünü göstermektedir, Şekil kısmen susuz olmak sağlayan doku. Kalan adımda rehidrasyon ve içerisinde rağmen, susuz kısmında sinyal yapay yüksektir. NBT-BCIP gelişme zamanını kontrol önemi, Şekiller 2A ve <stron...

Bu makalede, formalin içerisinde tespit edilmiş böbrek bölümlerinde microRNA ifade Renkölçer tespiti için optimize edilmiş bir in situ hibridizasyon protokolü tarif eder.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, böbrek dokularındaki mikro RNA ekspresyonunu konumlandırmak ve miktarını belirlemektir. Bu işlem, öncelikle digogen etiketli bir probun, böbrek dokusu içindeki belirli bir mikro RNA ile hibridize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, konjuge alkali fosfataz içeren bir digogen antikoru ile doku inkübe edilir.Ardından, hibridize olmuş mikro RNA problarının bulunduğu bölgelerde mavi renkli bir ürün oluşumu aracılığıyla mikro RNA'nın konumunu görselleştirmek için dokuya N-B-T-B-C-I-P substratı eklenir; böylece mikro RNA tamamlayıcı problarının hibridizasyonuna dayalı olarak mikro RNA'ların böbrek bölgelerinde ve nefron segmentlerinde nerede eksprese edildiğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu prosedürde, mikroskop lamlarına beş mikron kalınlığında alınan, formaldehit ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüş böbrek kesitleri kullanılır. Böbrek kesitlerini analize hazırlamak için, öncelikle dokudaki parafini taze ksilen ile beş dakika boyunca üç kez yıkayarak uzaklaştırın.Doku kesitlerini, çift distile su içindeki azalan konsantrasyonlu etanol çözeltilerinde beşer dakikalık inkübasyonlarla yeniden hidrate edin. Ardından, lamları doku kesitlerini tamamen kaplayacak miktarda dathyl, perkarbonat veya desy ile bir dakika boyunca işleyin. Dokuların kurumasını önlediğinizden emin olun.Lamları desikatörden çıkarın ve PBST ile iki kez beşer dakika boyunca durulayın. Atık içeren desikatörün uygun şekilde bertaraf edilmek üzere toplandığından emin olun.Bu noktadan itibaren, tüm reaktifler dsy işlemine tabi tutulmalıdır. RNA'ları uzaklaştırmak için, önceden ısıtılmış proteinaz K tamponuna, mililitre başına 10 mikrogram final konsantrasyonuna ulaşacak şekilde proteinaz K ekleyin. Doku kesitlerini proteinaz K çözeltisiyle kaplayın ve 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Proteinaz K çözeltisini hızla uzaklaştırın ve 30 saniye boyunca PBST içinde %0,2 glisin ekleyin.Lamları iki kez, her seferinde 30 saniye boyunca desyalle işlem görmüş PBST ile durulayın. Son olarak, doku kesitlerini taze hazırlanmış %4 paraformaldehit ile 10 dakika boyunca sabitleyin.Bu prosedüre başlamak için, doku kesiti başına 50 µL hibridizasyon tamponu ekleyin ve doku kesitlerinden biraz daha büyük olan RNA'sız hibridizasyon lamları ile kapatın. Lamları, %50 formamid ve %50 5X SSC ile ıslatılmış laboratuvar mendilleriyle nemlendirilmiş bir hazneye yerleştirin. Doku kesitlerini, nemlendirilmiş hazneyi 3' digoksin etiketli prob için belirlenen hibridizasyon sıcaklığındaki bir fırında iki saat bekleterek ön hibridize edin. Prob için hibridizasyon sıcaklığı genellikle probun DNA erime sıcaklığı veya TM değerinden 21 °C düşük olan sıcaklıktır.Örneğin, mere 3 82 probu için hibridizasyon sıcaklığı, TM değeri 75 °C olduğu için 54 °C'dir. Mikro RNA probunu, pozitif ve negatif kontrolleri, her birini hibridizasyon tamponunda 40 nM olacak şekilde seyrelterek hazırlayın. Pozitif kontrol U6 küçük nükleer RNA, negatif kontrol ise karıştırılmış (scrambled) bir dizidir.Probu ve kontrolleri 65 °C'de beş dakika boyunca ısıtın. Lamları hibridizasyon fırınından çıkarın. Pre-hibridizasyon düzeneğinden hibrid şeritleri ve fazla hibridizasyon tamponunu uzaklaştırın.Her bir doku kesitinin üzerine doğrudan 75 µL prob içeren tampon ekleyin. Doku kesitlerini kapatacak büyüklükteki hibridizasyon lamelleri ile örtün. Lam tutucuyu düz tutun.Lamları uygun sıcaklıktaki hibridizasyon fırınına geri yerleştirin. Yaklaşık 16 saat boyunca gece boyu inkübe edin. Hibridizasyon tamamlandığında, lamları hibridizasyon fırınından çıkarın.Lamı dokudan ayırmaya yardımcı olmak için, kapatma lamasının hemen bir kenarının altına, hibridizasyon sıcaklığına ısıtılmış 200 µL 2X SSC ekleyin. Lamı eğerek kapatma lamasını çıkarın. Kapatma lamaları çıkarıldıktan sonra, lamları belirlenen hibridizasyon sıcaklığında, %50 formamid içeren 2X SSC çözeltisi ile 30'ar dakikalık üç yıkama işlemiyle yıkayın.Slaytları oda sıcaklığında, düşük hızda çalışan orbital bir çalkalayıcıda beşer dakika süreyle toplam beş kez PBST ile yıkayın. Bu prosedüre, slaytları oda sıcaklığında, düşük hızda çalışan orbital bir çalkalayıcıda bir saat boyunca bloklama tamponunda inkübe ederek başlayın. Bir saat sonra, her bir doku kesitine 100 µL anti dig AP FAB fragmanları ekleyin ve hibridizasyon lamlarıyla kapatın.Kesiti kapatmaya yetecek büyüklükte kesin. Lamları nemlendirilmiş bir bölmede 4 °C'de gece boyunca veya ertesi gün yaklaşık 16 saat inkube edin. Lamları, düşük hıza ayarlanmış bir orbital çalkalayıcı üzerinde, oda sıcaklığında her biri beş dakika sürecek şekilde yedi kez PBST ile yıkayın.Ardından, lamları AP tamponu ile beşer dakikadan üç kez yıkayın. 10 mililitre AP tamponuna 200 mikrolitre N-B-T-B-C-I-P solüsyonu ekleyerek N-B-T-B-C-I-P geliştirme solüsyonunu hazırlayın. Tüm doku kesitlerini tamamen kaplamak için her lama 400 ila 500 mikrolitre seyreltilmiş N-B-T-B-C-I-P solüsyonu ekleyin.Kolometrik tespit tamamlandığında, oda sıcaklığında, karanlık ve nemlendirilmiş bir bölmede dört ila beş saat boyunca bekletin. Kesimleri, her biri beş dakika sürecek şekilde artan konsantrasyonlarda etanolleyerek suyunu giderin; ardından kesimleri, her biri beş dakika sürecek beş inkübasyonla ksilen üzerinden geçirerek şeffaflaştırın. Son olarak, lamları PerMount kapatma medyumu ile kapatın ve gece boyunca kurumaya bırakın.Doku kesitinin kurumasını önlemek, bu in situ hibridizasyon protokolünün başarısı için kritiktir. Bu şeklin sol kısmı, hibridizasyon lamının dokunun kenarından kaydığı ve dokunun kısmen susuz kalmasına neden olduğu bir böbrek kesiti bölümünü göstermektedir. Sonraki adımlarda yeniden hidrasyon ve kaplama uygulanmasına rağmen, susuz kalan bölümdeki sinyal, hibridizasyon lamı ile kaplı kalan bölüme kıyasla yapay olarak yüksektir.Bu görüntüdeki kalibrasyon çubuğu 100 mikronu temsil etmektedir. N-B-T-B-C-I-P geliştirme süresini optimize etmenin önemi sonraki şekillerde gösterilmiştir. Panel A, dört ila beş saatten daha uzun geliştirme sürelerinin, böbrek genelinde belirgin spesifik olmayan renk gelişimi ve karışmış mikro RNA kontrol problu dokularla sonuçlandığını göstermektedir.Panel B, böbrekler U six küçük nükleer RNA kontrolü gibi yüksek bolluktaki hedefler için incelendiğinde, dört ila beş saatten daha uzun inkübasyonların sinyalde daha fazla iyileşme sağlamadığını göstermektedir. Önceki bir çalışmadan uyarlanan bu şekiller, bu in situ hibridizasyon yönteminin böbrek dokusunda mikro RNA saptaması için uygulanabilirliğini doğrulamaktadır. Panel A, tek taraflı üreteral obstrüksiyonu (UUO) olan veya olmayan ve anti-ME 3 82 veya antis-scrambled ile tedavi edilen farelerin böbrek kesitlerinden in situ hibridizasyon ile elde edilen tipik miR-382 ekspresyon görüntülerini göstermektedir. UUO, sham plus antis-scrambled dokusuyla karşılaştırıldığında UUO plus antis-scrambled dokusundaki daha koyu boyamanın gösterdiği üzere, miR-382 ekspresyonunda bir artışa neden olmuştur.Bu artış, anti-ME 3 82 tedavisi ile engellenmiştir. Panel B'deki grafikler, sham artı antis scrambled ile tedavi edilen farelerdeki mere 3 82 ekspresyonunu, ortalama entegre optik yoğunluk yüzdesi olarak göstermektedir. Gözlemlenen piksel yoğunluğu ölçümüne göre, UUO dış ve iç medullada mere 3 82 ekspresyonunda anlamlı bir artışa neden olmakta ve anti-ME 3 82 bunu engellemektedir.Tüm bunlar, mikro RNA in situ hibridizasyonu ile görselleştirilebilir ve ölçülebilir. Bu sonuçlar, burada gösterilmeyen qPCR sonuçlarıyla da tutarlıdır ve formaldehit ile fikse edilmiş böbrekte miR-382 ekspresyonunu tespit etmek için in situ hibridizasyon kullanımının, qPCR tabanlı ekspresyon analizini yansıtan sayısallaştırılabilir sonuçlar sağlayacak kadar hassas olduğunu göstermektedir. Ek olarak, in situ hibridizasyon, böbrek içerisindeki mikro RNA ekspresyonundaki belirgin bölgesel farklılıkların ölçülmesine olanak tanır.

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Burada, biz verimli bir yüksek kapasiteli...

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Burada, kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) ve yerinde hibridizasyon (ISH) kullanan arşivlenmiş Formalin-Sabit, Parafine Gömülü (FFPE) veya taze dondurulmuş prostat kanseri (PCa) klinik dokularında mikroRNA (miRNA) ekspresyon analizleri için basitleştirilmiş bir protokolü açıklıyoruz.

Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri

Burada, miRNA in situ hibridizasyon kullanarak meme kanseri hasta örneklerinde miRNA ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.

miRNA kullanarak Meme Kanseri Dokularındaki miRNA İfade Klinikopatolojik Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

Mikro-RNA'ların (miRNAs) haberci RNA (mRNA) çoğu düzenleyiciler hizmet veren kısa ve son derece homolog RNA dizileri vardır. Geçerli miRNA algılama yöntemleri duyarlılık ve özgüllük değişir. Situ hibridizasyon ve immunostaining eşzamanlı miRNA ve protein molekülleri fare kalp doku bölümlerinde algılanması için bir araya getiren bir protokolü açıklar.

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.

İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Bu makale, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak akut böbrek hasarı olan bir fare modelinin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, iskemik böbrek hasarı fare modelini ve mikroRNA örneklerinin dikkatli bir şekilde çıkarılmasını vurgular.

İskemik Böbrek Hasarı Fare Modelinin Böbrekteki MikroRNA'ları için Kantitatif Bir Tespit Yöntemi

Tek taraflı üreteral obstrüksiyonu (UUO) olan farelerin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonunu kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirmek için bir yöntem tanımladık. Bu protokol UUO ile farelerde ve diğer patolojik durumlar bağlamında böbrek mikroRNA ekspresyon profillerinin incelenmesi için uygundur.

Fare Böbreğinde Tek Taraflı Üreteral Obstrüksiyonile MikroRNA Ekspresyonlarının Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Değerlendirilmesi

mikroRNA'lar IgA nefropatisinin patogenezinde rol oynarlar. Bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki mikroRNA ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA tutulumunu kontrol etmeyi kolaylaştıracaktır.

İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti

Burada, çeşitli böbrek hastalığı fare modellerinde viral olmayan bir vektörün kuyruk damarı enjeksiyonu ve polietilenimin nanopartikülleri yoluyla böbreğe yapay olarak sentezlenmiş dışsal miRNA taklitleri veriyoruz. Bu, böbrekte hedef miRNA'nın önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı ve birkaç fare modelinde böbrek hastalığının ilerlemesini engelledi.

Çeşitli Böbrek Hastalığı Fare Modellerinde Polietilenimin Nanopartikülleri Kullanılarak Ekzojen Yapay Olarak Sentezlenmiş MiRNA Mimiklerinin Böbreğe Verilmesi

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Öğrenin, formalin sabit böbrek dokularında mikroRNA ifadesini lokalize ve kantite etmek için optimize edilmiş in situ hibridizasyon protokolünü. Bu yöntem, böbrek bölgelerinde ve nefron segmentlerinde mikroRNA ekspresyon modellerini görselleştirmeyi sağlar.

MicroRNA

Daha fazla video keşfet