Kültürleme ve bakımı

Bu prosedürün genel amacı, uzun süreli saklama için gliserol stokları hazırlamak amacıyla dışkı örneklerinden C. difficile izole etmek ve çeşitli alt uygulamalar için spor stokları hazırlamak ve bunları saymaktır. Bu işlem, öncelikle seçici besiyerine ekim yaparak dışkı örneklerinden C. difficile izole edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise C. difficile'in sıvı besiyerinde büyütülmesi ve C. difficile stoklarının gliserol içerisinde uzun süreli olarak muhafaza edilmesidir.

Ardından, dondurulmuş gliserol stoklarından C difficile alınır ve agar plaklarına ekilir. Son adımda, bu protokoller takip edilerek C difficile spor stokları hazırlanır ve sayılarak belirlenir. C difficile, kimliğini doğrulamak ve onaylamak amacıyla çeşitli besiyerlerinde büyütülebilir, başarıyla kültüre edilebilir ve muhafaza edilebilir.

Bu gliserol stokları ve kültürler, hayvan çalışmaları ve ek moleküler biyoloji çalışmaları da dahil olmak üzere birçok sonraki uygulama aşamasında kullanılabilir. c difficile kültürü oluşturmak için mum kavanozları gibi diğer yöntemler yerine vinil bir anaerobik oda kullanmanın temel avantajı, katı bir anaerobik ortamın sürdürülebilmesi ve böylece c difficile'in tutarlı ve güvenilir bir şekilde büyümesine olanak tanımasıdır. Genel olarak, bu tekniklerde yeni olan kişiler, eldivenler nedeniyle oda içerisindeki el becerisi eksikliği ve ayrıca deneylerini önceden planlama konusundaki kritik ihtiyaç nedeniyle sorunlarla karşılaşabilirler.

Bu prosedürleri laboratuvarımdan teknisyen Jose Suarez uygulamalı olarak gösterecek. Bu işlem aerobik koşullarda gerçekleştirilebilir. İlk olarak, dışkı örneğini tartın.

Bu işlem, dışkıdaki c difficile sayımı için gereklidir. Ardından, dışkı örneğini bir miktar XPBS içinde yeniden süspanse edin ve dışkı örneğinin tamamen süspanse olduğundan emin olmak için vortekslleyin. Daha sonra, koloniyi oluşturan birimlerin (CFU) uygun izolasyonu veya gram başına dışkıdaki CFU sayımının yapılabilmesi için, yeniden süspanse edilen dışkı örneğinin bir miktar XPBS içinde seri dilüsyonlarını hazırlayın.

C difficile vejetatif hücrelerinin herhangi bir oksijene maruz kalmamasını sağlamak için prosedürü anaerobik koşullarda gerçekleştirin. Bu deneyde kullanılan anaerobik oda 37 °C'de tutulur. Aseptik teknik kullanın.

Her bir seri dilüsyondan 100 µL'yi Toro collate oxetane, cyclo Seine, fruktoz agar veya T-C-C-F-A plaklarına uygulayın. Kalan oksijenin uzaklaştırılmasını sağlamak için bu plaklar, anaerobik kamarada en az bir ila iki saat boyunca önceden indirgenmiştir. Doğru sayım için veya diğer sonraki uygulamalar için kolonileri izole edin.

Uygulanan kültürü T-C-C-F-A plak yüzeyine eşit şekilde yaymak için steril bir ekim özesi kullanın. Plakları 48 saat sonra 37 °C'de anaerobik olarak inkübe edin. Vejetatif c difficile hücrelerinin oksijen maruziyeti nedeniyle ölmediğinden emin olmak için, c difficile kolonilerini düz, düzensiz buzlu cam görünümlerine göre tanımlayın.

Alt uygulamalar için koloni izolasyonunda kullanılan plakalar her zaman anaerobik oda içerisinde tutulmalıdır. Koloni sayımı için plakalar anaerobik odanın dışına çıkarılabilir. Bir plaka oda dışına çıkarıldığında, vejetatif c difficile oksijene maruz kalacak ve ölecektir.

Plaka tekrar hazneye yerleştirilse bile bu C difficile kolonileri kurtarılamaz. Her dilüsyonun C difficile kolonilerini sayın ve kültür yapmak ve C difficile gliserol stokları hazırlamak için dışkı örneğinin gramı başına düşen CFU sayısını hesaplayın. Tek bir koloniyi seçmek ve önceden indirgenmiş beyin kalp infüzyonuna ekim yapmak için steril bir ekim özesi kullanın.

Maya özütü veya %0,03 L-sistein eklenmiş BHIS agar plaklarına, her kadran için yeni bir steril ekim özesi kullanarak tekil koloniler ve kadranlar halinde ekim yapın. Plakları 37 °C'de, anaerobik koşullarda 16 ila 24 saat inkübe edin. BHIS agar plaklarında izole koloniler göründüğünde, tek bir izole koloni seçin ve bu koloniyi %0,03 L-sistein eklenmiş 10 mL önceden indirgenmiş sıvı BHIS besiyerinde resüspande ederek gece boyunca inkübe edin.

37 °C'de anaerobik koşullarda veya kültür bulanıklaşana kadar inkübe edin. Ertesi gün, izole edilen suşun %15'lik gliserol stokunu oluşturmak için 1,8 ml'lik bir kriyojenik tüpe 333 µL %50 gliserol ve 666 µL C. difficile kültürü ekleyin. Kriyojenik tüpün kapağını sıkıca kapatın ve karıştırın.

Stoku derhal anaerobik odadan çıkarın ve uzun süreli saklama için -80 °C dondurucuya yerleştirin. Bu prosedüre başlamak için, dondurulmuş C. difficile gliserol stokunu -80 °C dondurucudan çıkarın. Çözülmeyi önlemek için.

Dondurulmuş gliserol stokunu, kullanım öncesinde -80 °C'de saklanmış bir soğutma rafına hemen yerleştirin. Soğutma rafındaki dondurulmuş gliserol stokunu, aseptik teknik ve steril bir ekim özesi kullanarak anaerobik kamaraya taşıyın. Stoktan küçük bir miktar plak üzerine yerleştirin ve plağın bir kadranı boyunca ekim yapın.

Plakayı 90 derece döndürün ve yeni bir steril ekim özesi kullanarak ikinci kadrana ekim yapın. Tekil kolonilerin izolasyonunu sağlamak için işlemi üçüncü ve dördüncü kadranlar için tekrarlayın. Donmuş gliserol stokunu anaerobik kamaradan hemen çıkarın ve -80 °C dondurucuya geri koyun.

c difficile kültüründen sporları saflaştırmak için plakayı 37 °C'de gece boyunca anaerobik olarak inkübe edin. Donmuş gliserol stoklarından alınan suşları, önceki bölümde gösterilen prosedürü takip ederek önceden indirgenmiş BHIS plakalarına ekin.

Ertesi güne kadar 37 °C'de anaerobik olarak inkübe edin. Tekil kolonileri birkaç önceden indirgenmiş 70 30 plaklarına yeniden ekimleyin. 37 °C'de 24 ila 48 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edin.

Sporlar oluştuktan sonra, plakaları anaerobik odadan çıkarın. Plakaları steril bir ekim özesi kullanarak sıyırın ve hücreleri 10 mililitre steril 1X PBS içinde yeniden süspande edin. Plakaları atın ve hücreleri 3000 G'de 15 dakika boyunca pelletleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın, bir mililitre 1X PBS resüsponzyon çözeltisi ekleyin, süspande edin ve aynı şekilde tekrar pelletleyin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın; ertesi gün vejetatif ve ana hücrelerin lizisine yardımcı olmak için dört °C'de gece boyunca inkübe edin, ardından kalıntı vejetatif hücreleri öldürmek için 70 °C'de 20 dakika inkübe edin. Mililitre başına CFU değerini belirlemek için, her spor preparasyonunu 1X PBS içerisinde seri olarak dilüe edin ve önceden indirgenmiş BHIS artı %0,1 Sodyum Torokollat içeren plakalara ekin; kolonileri saymadan önce plakaları 37 °C'de minimum 24 saat inkübe edin.

Sporlar, kısa süreli saklama için oda sıcaklığında veya uzun süreli saklama için dört derece Celsius'ta bir XPBS içinde saklanabilir. A. Burada, BHIS ve Columbia anaerobik koyun kanlı agar besiyerlerinde büyütülen c difficile örneği görülebilir.

C difficile, her iki ortamda da belirgin olan, düz ve buzlu cam görünümlü düzensiz koloniler oluşturur. Panel A, BHIS agar (24 saat boyunca kullanılan zenginleştirilmiş seçici olmayan bir besiyeri) üzerinde büyütülen eritromisin duyarlı klinik bir izolat olan c difficile 630 E'yi göstermektedir. 37 °C'de, panel B'de gösterilen Columbia anaerobik koyun kanlı agar üzerindeki koloniler, beyaz ışık altında BHIS'te büyüyenlere benzer görünmektedir.

Bununla birlikte, bu besiyerinin kullanımı, bu prosedürü takiben panel C'de gösterilen uzun dalga ultraviyole ışık altında C difficile tarafından sergilenen yeşilimsi veya narenciye rengindeki floresansın tespit edilmesini de sağlar. Ek moleküler biyoloji sorularını yanıtlamak amacıyla; sıvı besiyerinde büyüme eğrileri, DNA ve RNA, koloni izolasyonu, PCR ve C difficile için uygun diğer moleküler biyoloji teknikleri ile manipülasyonların yanı sıra hayvan çalışmaları için C difficile sporlarının kullanımı gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, anaerobik bir ortamda C difficile vejetatif hücrelerinin ve sporlarının nasıl izole edileceği, kültüre edileceği ve sürdürüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

C. difficile'in gastrointestinal hastalıklara neden olabilen bir insan ve hayvan patojeni olduğunu unutmayın. C. difficile ile yapılan deneyler, uygun biyogüvenlik düzeyi iki koşulları altında gerçekleştirilmelidir.