Etkileşimi incelenmesi Staphylococcus aureus Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

Aşağıdaki deneyin genel amacı, stafilokok fenol, çözünür modlin veya PSM'lerin insan nötrofilleri üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu, ilk olarak nötrofillerin daha sonraki in vitro analizler için insan kanından izole edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, nötrofiller ya floresan boya ile yüklenir ve inhibitörlü ve inhibitörsüz bir konsantrasyon serisi PSM ile karıştırılır ya da bir PSM alfa promotörü GFP raportör yapısı içeren S reus bakterilerini fagositozlaştırmalarına izin verilir.

Sonuç olarak, nötrofillerin PSM stimülasyonu ile aktivasyonu, akış sitometrisi ve fagosisite uğrayan tarafından GFP'nin ekspresyonu ile izlenebilir. Bakteriler floresan mikroskobu ile analiz edilebilir Bu yöntemle. Stafilokok, fenil, soya, molinler veya nötrofillerin etkilerini inceleyebilirsiniz.

Tabii ki, bu yöntem diğer birçok hücre tipine, uyarana ve antagoniste uygulanabilir. İlk olarak, nötrofillerin içindeki PSM'lerin etkilerini gözlemlemenin bir yolunu tartışırken bu yöntemin mikroskopi kısmı için fikir sahibi olduk. Bakteriyel bir GFP ekspresyon yapısı ve hızlandırılmış mikroskopi kullanmak tam olarak bunu yapmamızı sağlar.

Beş tüp heparinize venöz kan çektikten sonra, 12 mililitre yoğunluk başına 1.119 gram fial çözeltiyi 50 mililitrelik bir tüpe dökün ve ardından mililitre yoğunluk FI çağrı çözeltisi başına 1.077 gramlık 10 mililitre dikkatlice kaplayın. Daha sonra, kanı eşit hacimde PBS ile seyreltin ve 20 ila 25 mililitre kanı her bir çift katmanlı fi çağrı gradyanına dikkatlice katmanlayın. Gradyanları 20 dakika boyunca 396 kez G ve 22 santigrat derecede kırılmadan santrifüjleyin.

Ardından, üst sarı plazma ve PBMC katmanlarını aspire etmek için steril bir pipet ucuna sahip bir vakum pompası kullanın. Ve sonra üçüncü beyaz katman. Şimdi polimorfonükleer nötrofil veya PMN fraksiyonunu her tüpten 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarmak için küçük bir plastik pipet kullanın.

Toplam hacmi 50 mililitreye çıkarmak için her tüpe insan serumu, albümin veya R-P-M-I-H-S-A ile takviye edilmiş PMI'mizi taze hazırlanmış ön soğutma ekleyin. Daha sonra hücreleri aşağı doğru döndürün, süpernatanı bir vakum pompasıyla aspire edin ve kırmızı eritrosit ve PMN içeren peleti nazikçe girdaplayın. Daha sonra, hücrelere dokuz mililitre steril deiyonize su ekleyin ve bir zamanlayıcı başlatın.

Tam olarak 30 saniye ekleyin. Hiperozmotik şoku durdurmak için bir mililitre 10 kez konsantre PBS ekleyin. Daha sonra hücreleri toplam 50 mililitre soğuk R-P-M-I-H-S-A hacminde yıkayın.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, eritrositlerin parçalanması nedeniyle artık beyaz olan her damağa bir mililitre R-P-M-I-H-S-A ekleyin. Daha sonra yeniden canlandırın, pipetleyerek askıya alın ve peletleri bir tüpte birleştirin. Şimdi hücreleri sayın ve konsantrasyonu mililitre başına 10 ila yedinci hücrelere ayarlayın.

Şimdi R-P-M-I-H-S-A'da saat 3:00'te iki mikromolar grip ile mililitrede 10 ila altıncı hücreye beş kez yükleyin. Ve tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün. Daha sonra, hücreleri çalkalama altında sıcaklıkta 20 dakika inkübe edin.

Bu arada, uyaranın nihai konsantrasyonun 10 katında üç kat seri seyreltmesini hazırlayın. Daha sonra, uyarıcının 30 mikrolitresini eşit hacimde taze hazırlanmış 10 kez konsantre inhibitör veya tampon ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca önceden inkübe edin. Daha sonra, hücreleri 10 mililitre R-P-M-I-H-S-A'da yıkayın ve hücreleri taze R-P-M-I-H-S-A'da mililitre başına 10 ila altıncı hücreye beş kez yeniden süspanse edin.

Akış analizinden hemen önce, hücreleri R-P-M-I-H-S-A'da mililitre başına 10 ila altıncı hücreye kadar seyreltin ve faks tüpü başına 200 mikrolitre hücre ekleyin. Hücreleri sallayarak veya pipetleyerek aktive etmemeye dikkat ederek, ilk tüpü akış sitometresine yükleyin. Üç saniye bekleyin ve ardından sabit bir süre sonra, örneğin sekiz saniye sonra edinimi başlatın, tüpü çıkarın ve uyaranın en düşük seyreltmesinden 50 mikrolitreyi numuneye hızlı bir şekilde ekleyin.

Tüpü hemen yeniden yükleyin ve edinime devam edin. Bir seyreltme serisi bittiğinde, yeni bir seriyi ölçmeden önce akış sitometresi iğnesini taze R-P-M-I-H-S-A ile yıkayın. Son numuneyi çalıştırdıktan sonra, bakteriyel GFP ekspresyonunu analiz etmek için verileri akış sitometrisi analiz yazılımı ile analiz edin.

PMN fagositozu, gece boyunca et suyunda ilgilenilen raportör yapısını içeren bir S ous suşu büyüttükten sonra, hücreleri OD 6 60 0 0.01'e seyrelterek gece boyunca kültür sırasında eksprese edilen herhangi bir GFP'yi çıkarın. Kültürü OD 6 60 0 0.1'e büyütün. Hücreleri bir ila 30 oranında seyreltin ve ardından kültür bir kez daha OD altı 60 / 0.1'e ulaşana kadar büyümeyi izleyin.

Daha sonra bakterileri santrifüjleme ile toplayın. Hücreleri DPBS ve Resus'ta bir kez yıkayın. Kültürü askıya alın.

1.0'ın 60'lık bir OD altısını veya kabaca beş katı 10 ila sekizinci CFU'yu elde etmek için orijinal hacmin bir ila 10'unu ekleyin. Şimdi bakterileri yeni izole edilmiş PNS ile R-P-M-I-H-S-A'da 10'a bir oranında karıştırın. Daha sonra, hücre çözeltisi içinde havuzlanmış insan serumunun toplam 10'da bir hacmine havuzlanmış insan serumu ekleyin.

Hücre karışımını 37 santigrat derecede 10 dakika çalkalayarak fagositozu uyarın. Daha sonra bakteri yüklü PMN'leri mililitre başına beş kez 10 ila beşinci hücreye seyreltin ve hücrelerin 250 mikrolitresini sekiz iyi odacıklı bir örtü kaymasının her bir oyuğuna aktarın. Son olarak, hücreleri 40 x objektifle donatılmış ve karanlık bir ortam odasında bulunan ters çevrilmiş bir mikroskopta görüntüleyin ve bakteriyel GFP üretimini gerçek zamanlı olarak takip etmek için hem parlak alanda hem de GFP kanalında her beş ila 10 dakikada bir kapak kayma odalarında birden fazla yerde görüntüler elde edin, nötrofilleri bir sentetik PSM alfa üç konsantrasyon serisi ile inkübe etmek, nötrofillerin doza bağlı hızlı aktivasyonu ile sonuçlanır. kalsiyum akısı ile ölçülen hücreler.

PSM alfa üç peptidinin% 0.01% 0.1 veya% 1 İnsan serumu ile ön inkübasyonu, uyaranın bir kalsiyum tepkisi ortaya çıkarma yeteneğini önemli ölçüde inhibe etti. Yine doza bağlı bir şekilde% 1 serumda. Bu PSM alfa üç konsantrasyonlarında neredeyse hiç aktivasyon görülmez.

Bu görüntülerde, A PSM alfa GFP raportör yapısı içeren fagositoz bakterisi içeren iki nötrofil gösterilmektedir. Bakteriler fagositozdan yaklaşık bir saat sonra floresan oluşmaya başlar ve bu da PSM Alpha promotöründen GFP ekspresyonunu gösterir. Nötrofillerin dışındaki bakteriler floresan parlamaz, bu da PSM alfa ekspresyonunun yalnızca bakteriler fagosite edildiğinde hızlı bir şekilde açıldığını gösterir.

Bu prosedürü denerken, en iyi sonuçlar için her zaman taze nötrofiller kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi ile kalsiyum akışının nasıl ölçüleceğini ve floresan mikroskobu kullanılarak ökaryotik hücreler içindeki bakteriyel gen ekspresyonunun nasıl ölçüleceğini iyi anladığınızı umarım.