Name: Etkileşimi incelenmesi Staphylococcus aureus Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Keşfedin Staphylococcus aureus PSM toksinlerinin insan nötrofilleri üzerindeki etkilerini akım sitometri ve floresan mikroskopi ile. Bu yöntem immün yanıtları ve bakteriyel enfeksiyon mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; RN kısmen Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı, proje numarası 268324 Bir Marie Curie Avrupa Yeniden entegrasyon Hibeler (ERG) tarafından finanse edildi.</p&gt;

1. Yoğunluk Santrifüj tarafından İnsan Kanı itibaren PMNs&#39;nin izolasyonu <ol><li> Heparinize venöz kan 5 9 ml tüpler çizin. </li><li> Aşağıdaki gibi çift katmanlı Ficoll gradyanları (5 tüpler kan boyunca 4 gradyanları) hazırlanması: 50 ml&#39;lik bir tüp içinde bir yoğunluk 1.119 g / ml Ficoll çözeltisi, 12 ml ve üstüne bir yoğunluk 1.077 g / ml Ficoll çözeltisi dikkatli bir şekilde tabaka 10 ml dökün. </li><li> PBS eşit hacmi ile kan seyreltin. </li><li> Katman çift katmanlı Ficoll degrade dikkatle seyreltilmiş kan; degrade başına 20-25 ml. </li><li> Sallanan bir kova rotor, 22 ° fren olmadan C 396 x g&#39;de 20 dakika santrifüj. </li><li> Içeren soğuk RPMI hazırlanması% 0.05 insan serum albumini (HSA-içeren RPMI). Ayrıca 9 ml steril deiyonize H 2 O hazırlamak Ön serin buz üzerinde RPMI ve H 2 O hem. </li><li> (Steril bir pipet ucu koymak bir vakum pompasının kullanımı ile plazma (sarı renkli) ve PBMC, Ficoll içeren üst tabaka ve Ficoll ikinci tabaka (beyaz renkli) aspirePipet). </li><li> Küçük bir plastik pipet (her 2 degradelerin PMN kesirler için 1 tüp) kullanarak 50 ml tüpler PMN toplayın ve buz üzerine koyun. </li><li> 4 azından 249 x g&#39;de 10 dakika boyunca 50 ml santrifüj toplam hacim soğuk RPMI-HSA ekleme ° C </li><li> Bir vakum pompası ve vorteks yavaşça pelet (eritrositler ve PMN) kullanımı ile Süpernatantı al. </li><li> 9 ml steril deiyonize H 2 O ekleyin ve Sayacı başlatmak. 1 ml 10 kat konsantre PBS ekleyerek, tam 30 saniye sonra hiper ozmotik şok durdurun. Not: 30 saniye çok önemlidir. </li><li> 4 azından 249 x g&#39;de 10 dakika boyunca 50 ml santrifüj toplam hacim soğuk RPMI-HSA ekleme ° C </li><li> Bir yüksek vakum pompası kullanımı ile süpernatan çıkarmak ve tanımlanmış bir miktarda (1-2 mi) RPMI-HSA 1 tüp PMN pelet toplamak. </li><li> Hücrelerin miktarının belirlenmesi ve 1.10 7 hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır. Donör bağlı olarak, izole PMNs verim Betwe olacakkan, her biri 9 ml tüp mesafede yer alan en 5 x 10 6, ve 3 x 10 7 PMN </li></ol> 2. İnsan PMN Kalsiyum Seferberlik Değerlendirme akışı Sitometrik Testi <ol><li> 2 uM Yük hücreleri (5 x 10 6 hücre / ml) Fluo-3-AM örneğin ışıktan korunan bir sallanan bir platform çalkalayıcı kullanılarak, oda sıcaklığında, 20 dakika sallama yavaş için RPMI-HSA ve inkübe. </li><li> Bu arada 10x son konsantrasyonda uyarıcı bir seri seyreltme (örneğin, 3-kat) hazırlanması. PSMα3 Bu protokolde kullanılan, ancak, nötrofiller üzerinde etki gösteren herhangi bir GPCR uyarıcı uygundur. </li><li> RPMI-HSA reseptörünün 10x konsantre edildi inhibitörü hazırlayın. Önleyicisi, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inhibitörü eşit hacmi ile uyarıcı (PSMα3 örn. HDL) önceden inkübe 25 ul uyarıcı görür. </li><li> Oda sıcaklığında, 249 x g&#39;de 10 RPMI-HSA ml santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın. 5 x tekrar süspansiyon hücreleri10 6 hücre / ml. </li><li> Sadece deneyden önce, 2x10 6 hücre / RPMI-HSA ml için hücreleri sulandırmak ve FACS tüp başına 200 ul hücreleri ekleyin. Seyreltilmiş PMN çok kırılgan. Bu konsantrasyonda çok uzun tutarak otomatik etkinleştirme yol açacaktır, aynı güçlü sallayarak veya pipetleme için de geçerlidir. </li><li> Akış sitometresinin için tüp takın, 3 saniye bekleyin ve satın alma başlar. Sabit bir süre (örneğin 8 sn) sonra, tüp çıkarmak ve hızlı bir şekilde örnek 50 ul uyarıcı ekleyin. Hemen numune tutucu üzerine tüp yeniden takın ve satın alma devam. </li><li> Uyaran en yüksek konsantrasyon ile en düşük ve bitiş ile başlayın. RPMI-HSA her çalıştırdıktan sonra düzenli akış sitometresi iğne yıkayın. </li><li> Akım sitometri analiz yazılımı ile verileri analiz. Uyaran eklenmesinden sonra bu için uyarıcı ilavesinden önce ortalama floresans sinyali karşılaştır ve AC hesaplamak için uygun bir pozitif ve negatif kontroller kullanmakölçülen her seyreltme için tivasyon gücü. </li></ol> Alternatif olarak, inhibitör reseptör inhibitör ile önceden inkübe hücrelerinde işlev görür. 3. PMN tarafından Fagositoz sonra Bakterilerin GFP İfade Floresan Mikroskopi Analizi <ol><li> S. büyütün suyu içinde gece boyunca ilgi muhabiri yapı (plazmid muhabiri korumak için gerekli antibiyotik) içeren aureus suşları. Bu durumda, yük MW2 PSMα bir GFP raportör yapı LB kültür ortamı, 5 ml, 50 ml&#39;lik plastik bir tüp içinde yetiştirilen, 10 kullanılır içeren içinde. </li><li> O / N ifadesi tüm GFP kaldırmak için, OD 660 0.01 kültür sulandırmak ve OD 660 0.1 büyüyecek. Bu kültürün 01:30 Redilute ve kültür 0.1 bir OD 660 ulaşana kadar büyüme izlemek. Santrifüj bakteri toplayın ve DPBS bir kez yıkayın. 1.0 OD 660 ya da R elde etmek için, orijinal hacminin 1:10 süspanseklişeler 5.10 8 CFU / ml. </li><li> 1.5 ml mikrotüp RPMI-HSA (oran 10:1) taze olarak izole edilen PMN (1.10 6 / ml) bakteriler (1.10 7 / ml) karıştırın ve% 10 arasında bir nihai konsantrasyona toplanmış insan serumu ekleyin. 37, 10 dakika boyunca bir çalkalama platformu üzerinde çalkalayın ° C fagositoz uyarmak için. 5.10 5 PMN / ml ve 8 de mermi kapak kayma bir kuyuya pipet 250 ul bakteri yüklü PMN sulandırmak. </li><li> Bir mikroskop bakteri ile görüntü PMN. Bir 40X/0.85 NA amacı ile donatılmıştır ters bir mikroskop iyi çalışıyor ve 37 stabil çevre tutmak için karanlık bir ortamda odasında kaplı olmalıdır ° C Kamera parlak bir alan ve zaman içinde GFP üretim takip GFP kanal hem de her 5-10 dk kullanarak önceden ayarlanmış konumları bir dizi için görüntüler elde. </li></ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
<li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host & Microbe. 7, 463(2010).</li>
<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada açıklanan yöntemler bazı adımlar çok önemlidir. Biz burada bu vurgular. Yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla nötrofil yalıtımı için santrifüj adımları sırasında ya da sonrasında katmanların rahatsız etmemek için önemlidir. Plastik bir pipet kullanarak nötrofil aspire zaman, hücre tabakasında ise, gibi çıkartma sıvı katmanları rahatsız edecek balon sıkmak için değil emin olun. Ayrıca görsel, ozmotik şok ve santrifüj aşamasından sonra topak, nötrofillerin inceleyin. Pelet hala varsa kırm...

Nötrofiller (PMN) Staphylococcus aureus 1 karşı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı önemli bir rol oynamaktadır profesyonel fagositlerdir. Ev sahibi ve mikrop arasındaki sürekli bir savaş hem de bir silahlanma yarışı yol açmıştır. Metisilin dirençli S. son zamanlarda, toplum ile ilişkili (CA) suşları aureus (MRSA) nötrofil öldürme 2,3 tuzağa çok etkili gibi görünüyor ortaya çıkmıştır. CA-MRSA aşırı fenol çözünür modulin (PSM) üretimi 4,5 daha yüksek virulans ile ilişkilendirilmiştir. İnsan nötrofilleri reseptör 6 birleştiğinde Bu G-proteini ile aktive yol FPR2 ile bu PSM tanıyabilir. Ilk olaylardan biri kalsiyum hücre içi mağaza (Ca 2 +) harekete geçirilmesidir. Ca 2 + degranülasyonunun ve fagositoz 7 de dahil olmak üzere PMNs&#39;nin efektör çeşitli fonksiyonları için ikincil haberci olarak görev yapar. Bu nedenle Ca 2 + çok hassas bir göstergesidirPMN etkinleştirmek için PSM fonksiyonel kapasitesi. Nötrofiller üzerinde PSM etkilerini incelemek için, taze nötrofil kalsiyum mobilizasyonu üzerine fluoresces bir boya ile izole ve yüklenir. Bir akış sitometrisi deneyde bu hızlı harekete ölçülebilir. Bu yöntemi kullanarak, bu nötrofiller üzerindeki toksik ve diğer bileşenlerin doğrudan etkilerini incelemek ve bu aktif olan en düşük konsantrasyonunu belirlemek mümkündür. Bizim için, bu S. tarafından üretilen birçok proteinlerin etkisini araştırmak için çok yararlı bir araçtır aureus gibi FPR2 inhibitör protein (FLIPR) 8, 7 FLIPR benzeri, ve Staphylococcus aureus (CİPS) 9 Kemotaksis inhibitör protein gibi bağışıklık kaçırma, dahil. Tüm bu proteinler agonisti tanıma reseptöre bağlanarak nötrofillerde kalsiyum mobilizasyon inhibe ettiği gösterilmiştir. Son zamanlarda, bizim grup PSM işlevsel 10 serum lipoproteinlerin tarafından inhibe olduğunu nitelendirdi &lt;/&gt; Sup. Bu lipoproteinler PSM öncelikle hücre içi ortamda görevi yerine belirten, kan ve insan dokusu içinde bol miktarda mevcut bulunmaktadır. Kalsiyum mobilizasyon tahlilin durumu ki bu da serum çok düşük konsantrasyonları ile de inhibe ettiği gösterilen PSM tarafından nötrofil aktivasyonu, serum lipoproteinler etkisini ölçmek için izin verdi. PSM işlevsel serum tarafından inhibe bu yana, hücre içi toksinler gibi PSM için önemli bir işlevi olduğunu varsaydık. Bu nedenle fagositoz sonra PSM rolünü belirlemeyi amaçladık. Arası boşlukta PSM ifadesi araştırmak için, GFP psmα operon promotörünün raportör füzyonlarının inşa ettiler. Ne S. bu raportör suşları aureus nötrofiller tarafından fagosite edildi, ifade indüksiyon floresan mikroskobu 10 kullanılarak gözlemlenebilir oldu. Açıkçası, bu technique S. genin çok sayıda ifade çalışma sağlar fagositoz sonra aureus veya diğer patojenleri. S. beri arası niş hayatta aureus bu niş aktif genlerin rolü okuyan, doğuştan gelen bağışıklık sistemi 11 10 12 üstesinden gelmek için çok önemlidir onun virülans anlamak için büyük önem taşımaktadır.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3,</td><td>Moleküler Problar / Yaşam Teknolojileri</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>yoğunluk 1.077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>yoğunluk 1.119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>25 mM HEPES ve L-glutamin</td></tr><tr><td>içerir Leica TCS SP5 mikroskobu</td><td>Leica Microsystems, Hollanda</td><td>TCS SP5</td><td>hedefi: HCX PL APO 40x/0.85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>Ölçüm işlemi sırasında tüpün çıkarılıp değiştirilebilmesi çok önemlidir</td></tr></tbody></table>

etkileşimi incelenmesi<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; akım sitometri ve time lapse mikroskopi tarafından nötrofiller ile

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Biz nötrofiller üzerinde Staphylococcus aureus tarafından üretilen ve salgılanan fenol çözünür modulins (PSM) ve diğer toksinlerin etkisini araştırmak için yöntemler sunuyoruz. Biz yoğunluk gradiyenti santrifüj kullanılarak taze nötrofil izole nötrofiller üzerindeki PSM etkilerini incelemek. Bu nötrofil kalsiyum mobilizasyon üzerine fluoresces bir boya ile yüklenir. PSM tarafından nötrofil aktivasyonu serbest hücre içi kalsiyum konsantrasyonu hızlı ve geçici bir artış başlatır. Bir akış sitometrisi deneyde bu hızlı harekete serbest Ca2 + konsantrasyonunun artmasına tepki ön-yüklemeli bir boya floresan izlenmesi ile ölçülebilir. Bu yöntemi kullanarak, biz nötrofil aktive ve nötrofil aktivasyonu özel ve genel inhibitörlerinin etkilerini ölçmek için gerekli konsantrasyonu belirlemek PSM olabilir. Hücre içi alanı w PSM ifadesi araştırmake GFP için PSMα operonunun organizatörü muhabiri füzyon inşa ettik. Ne S. bu raportör suşları aureus nötrofiller tarafından fagosite edilir, ifade indüksiyon floresan mikroskobu kullanarak gözlemlenebilir.

Insan PMN kalsiyum seferberlik değerlendirilmesi için akış sitometrik analizi FL-1, sinyal bir artış ile gösterilir kalsiyum akısı ile ölçülen şekilde, hızlı aktivasyonu ile sonuçlanan sentetik PSMα3 bir konsantrasyon dizi nötrofil kuluçkalama ile hazırlanmıştır. % 0.01 sentetik PSMα3 ön inkübasyon,% 0.1 ya da% 1 insan serum önemli ölçüde kalsiyum akılarının (Şekil 1) ortaya çıkarma yeteneğini inhibe etmiştir. Floresan mikroskobu kullanarak PMN ile fag...

Biz tarafından salgılanan PSM ve diğer toksinlerin etkisini araştırmak için yöntemler mevcut<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım sitometri ve floresan mikroskobu kullanarak nötrofiller üzerinde.

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, stafilokokal fenol olarak bilinen çözünür modlinlerin veya PSM'lerin insan nötrofilleri üzerindeki etkilerini incelemektir. Bu işlem, öncelikle sonraki in vitro analizler için insan kanından nötrofillerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından nötrofiller, ya floresan boya ile yüklenip inhibitörlü veya inhibitörsüz farklı PSM konsantrasyon serileriyle karıştırılır ya da PSM alpha promotör GFP raporlayıcı yapısı içeren S. reus bakterilerini fagosite etmelerine izin verilir.Sonuç olarak, PSM stimülasyonu ile nötrofillerin aktivasyonu akış sitometrisi ile izlenebilir ve fagositoz edilen bakterilerin GFP ekspresyonu floresan mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu yöntemle, stafilokokal fenil-soya moleküllerinin veya nötrofillerin etkilerini inceleyebilirsiniz.Elbette bu yöntem, birçok farklı hücre tipine, stimülusa ve antagoniste uygulanabilir. Bu yöntemin mikroskopi kısmına dair fikir, ilk olarak nötrofillerin içindeki PSM'lerin etkilerini gözlemlemenin bir yolunu tartışırken ortaya çıktı. Bakteriyel bir GFP ekspresyon konstrüktü ve zaman atlamalı mikroskopi kullanımı, tam olarak bunu yapmamıza olanak tanır.Heparinli venöz kandan beş tüp aldıktan sonra, 50 mL'lik bir tüpe 1,119 g/mL yoğunluktaki Ficoll çözeltisinden 12 mL dökün ve ardından üzerine dikkatlice 1,077 g/mL yoğunluktaki Ficoll çözeltisinden 10 mL ekleyin. Sonra, kanı eşit hacimde PBS ile seyreltin ve her bir çift katmanlı Ficoll gradyanının üzerine dikkatlice 20 ila 25 mL kan ekleyin. Gradyanları, frenlemeden 22 °C'de 396 ×g hızında 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, steril bir pipet ucu takılmış bir vakum pompası kullanarak üstteki sarı plazma ve PBMC katmanlarını aspire edin. Sonra üçüncü beyaz katmanı aspire edin. Şimdi, her tüpteki polimorfnükleer nötrofil veya PMN fraksiyonunu yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarmak için küçük bir plastik pipet kullanın.Toplam hacmi 50 mililitreye tamamlamak için her tüpe taze hazırlanmış, önceden soğutulmuş, insan serum albümini ile desteklenmiş RPMI veya R-P-M-I-H-S-A ekleyin. Ardından hücreleri santrifüjleyin, süpernatantı bir vakum pompasıyla aspire edin ve kırmızı eritrosit ile PMN içeren peleti nazikçe vorteksleyin. Sonrasında, hücrelere dokuz mililitre steril deiyonize su ekleyin ve zamanlayıcıyı başlatın.Tam olarak 30 saniye ekleyin. Hiperozmotik şoku durdurmak için 1 mL 10 kat konsantre PBS ekleyin. Ardından hücreleri toplam 50 mL soğuk R-P-M-I-H-S-A ile yıkayın.Süpernatant alındıktan sonra, eritrositlerin lizisi nedeniyle şu an beyaz renkli olan her bir palete bir mililitre R-P-M-I-H-S-A ekleyin. Ardından, pipetleme yoluyla resüspande edin ve pelletleri tek bir tüpte birleştirin. Şimdi hücreleri sayın ve konsantrasyonu mililitre başına 1 × 10⁷ hücre olacak şekilde ayarlayın.Şimdi, R-P-M-I-H-S-A içerisinde 2 µM flu oh 3:00 AM ile mL başına 5 × 10⁶ hücre yükleyin. Ardından, ışık koruması sağlamak için tüpü alüminyum folyo ile kaplayın. Sonrasında, hücreleri uygun sıcaklıkta ve ajitasyon altında 20 dakika inkübe edin.Bu sırada, stimülasyonun son konsantrasyonun 10 katı olacak şekilde üç katlı seri dilüsyonunu hazırlayın. Ardından, 30 µL stimülasyonu, taze hazırlanmış 10 kat konsantre inhibitör veya tamponun eşit hacmi ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ön inkübasyona tabi tutun. Sonrasında, hücreleri 10 mL R-P-M-I-H-S-A ile yıkayın ve hücreleri taze R-P-M-I-H-S-A içinde mililitre başına 5 × 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin.Akış analizinden hemen önce, hücreleri R-P-M-I-H-S-A içerisinde mililitre başına 2 × 10⁶ hücre olacak şekilde seyreltin ve her bir faks tüpüne 200 µL hücre ekleyin. Hücreleri çalkalayarak veya pipetleyerek aktive etmemeye dikkat ederek ilk tüpü akış sitometresine yerleştirin. Üç saniye bekleyin ve ardından veri toplama işlemini başlatın; sabit bir süre sonra, örneğin sekiz saniye sonra, tüpü çıkarın ve numuneye stimülasyonun en düşük dilüsyonundan hızlıca 50 µL ekleyin.Tüpü hemen tekrar yükleyin ve kazanımı sürdürün. Bir dilüsyon serisi tamamlandığında, yeni bir seriyi ölçmeden önce akış sitometresi iğnesini taze R-P-M-I-H-S-A ile yıkayın. Son örneği çalıştırdıktan sonra, bakteriyel GFP ekspresyonunu analiz etmek için verileri akış sitometrisi analiz yazılımı ile analiz edin.PMN fagositozundan sonra, ilgilenilen raporlayıcı konstrüktü içeren bir S ous suşunu besiyerinde gece boyunca büyütün, gece boyu süren kültür sırasında eksprese edilen tüm GFP'yi hücreleri OD 6 60 0 0.01'e seyrelterek uzaklaştırın. Kültürü OD 6 60 0.1'e kadar büyütün. Hücreleri 1/30 oranında seyreltin ve ardından kültür tekrar 0.1 OD altı 60 değerine ulaşana kadar büyümeyi izleyin.Ardından bakterileri santrifüj yoluyla toplayın. Hücreleri bir kez DPBS ile yıkayın ve kültürü yeniden süspande edin.OD₆₀₀ değerini 1,0 veya yaklaşık 5×10⁸ CFU/mL yapmak için orijinal hacmin bir ila 10 katını ekleyin. Ardından, bakterileri RPMI-HSA içindeki yeni izole edilmiş PNS ile 10:1 oranında karıştırın. Daha sonra, hücre solüsyonu içerisindeki toplam son hacmin 1/10'u oranında havuzlanmış insan serumu ekleyin.Hücre karışımını 37 °C'de 10 dakika boyunca çalkalayarak fagositozu uyarın. Ardından, bakteri yüklü PMN'leri mililitre başına 5 × 10⁵ hücre olacak şekilde seyreltin ve hücrelerden 250 µL'yi sekiz kuyucuklu bir lamel haznesinin her bir kuyucuğuna aktarın. Son olarak, bakteriyel GFP üretimini gerçek zamanlı olarak takip etmek için, 40x objektifli bir ters mikroskop ile karanlık bir ortam haznesinde, hem parlak alan hem de GFP kanalında her 5-10 dakikada bir lamel haznesinin çeşitli konumlarından görüntüler alın; nötrofillerin sentetik PSM α3 konsantrasyon serileriyle inkübe edilmesi, kalsiyum akışı ile ölçüldüğü üzere hücrelerin doz bağımlı hızlı aktivasyonuyla sonuçlanır.PSM alpha three peptidinin %0,01, %0,1 veya %1 insan serumu ile ön inkübasyonu, stimulusun kalsiyum yanıtı oluşturma yeteneğini önemli ölçüde inhibe etmiştir. %1 serum konsantrasyonunda bu durum yine doz bağımlı bir şekilde gerçekleşmiştir. Bu PSM alpha three konsantrasyonlarında neredeyse hiç aktivasyon görülmemektedir.Bu görüntülerde, PSM alpha GFP raporlayıcı konstrükt içeren fagositoz edilmiş bakterileri barındıran iki nötrofil gösterilmektedir. Bakteriler fagositozdan yaklaşık bir saat sonra floresan yaymaya başlar; bu durum, PSM Alpha promotöründen GFP ekspresyonunu göstermektedir. Nötrofillerin dışındaki bakterilerin floresan yaymaması, PSM alpha ekspresyonunun yalnızca bakteriler fagositoz edildiğinde hızla aktive olduğunu göstermektedir.Bu prosedürü uygularken, optimal sonuçlar elde etmek için her zaman taze nötrofiller kullanmanız gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi ile kalsiyum akışının nasıl ölçüleceği ve floresan mikroskobu kullanılarak ökaryotik hücreler içindeki bakteriyel gen ekspresyonunun nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayış kazandığınızı umuyorum.

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Bu video, nötrofil-biyofilm etkileşimini incelemek için bir in vitro testi göstermektedir. Biyofilm ve izole nötrofillere gömülü patojenik bakteriler, floresan etiketler kullanılarak etiketlendi ve nötrofillerin immün yanıtı ve bakterilerin immün yanıtından kaçışı bir floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi.

Nötrofiller ve Biyofilm Arasındaki Etkileşimi İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Video, stromal hücrelerin lökosit alımı üzerindeki etkisini araştırmak için bir yöntem göstermektedir. Paralel bir plaka akış odası modelinde, pro-inflamatuar sitokinler, endotel hücreleri tarafından adezyon reseptörlerinin ekspresyonunu indükleyerek nötrofil alımını ve göçünü kolaylaştırır. Stromal hücreler ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, endotel hücrelerine nötrofil alımını azaltır.

Stromal Hücrelerin Lökosit Alımı Üzerindeki Etkisinin İn Vitro Flow Araştırması

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

akışından lökositleri için iltihaplı endotel kabiliyeti mezenkimal stromal hücreler tarafından düzenlenir. Biz akışından nötrofil işe değerlendirmek ve mezenkimal stromal hücreler bu süreci düzenleyen oynadığı rolü incelemek için kullanılabilir birincil insan hücreleri içeren iki in vitro model tarif.

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Bu çalışmada, tanımlanmış akış koşullarında kesme stresi altında farklılaştırılmış insan primer endotel hücrelerinin yüzeyinde üretilen pnömokok komponent dizelerine bağlıpnozyağının mikroskobik takibi açıklanmaktadır. Bu protokol, diferansiyel immünboyama prosedürleri uygulanarak belirli hücre yapılarının ayrıntılı görselleştirilmesi ve bakterilerin sayısallaştırılması için genişletilebilir.

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Mevcut protokol, nötrofil-biyofilm etkileşimlerinin incelenmesini açıklamaktadır. Staphylococcus aureus biyofilmleri in vitro olarak kurulur ve periferik kan kaynaklı insan nötrofilleri ile inkübe edilir. Nötrofillerden oksidatif patlama tepkisi ölçülür ve biyofilm içindeki nötrofil lokalizasyonu mikroskopi ile belirlenir.

İnsan Nötrofiller ve Staphylococcus aureus Biyofilmleri Arasındaki Etkileşimleri Görselleştirmek ve Ölçmek için Standartlaştırılmış In vitro Testler

Bu protokol, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak mikrobiyal otoagregasyonu ölçmek için kantitatif bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal otoagregasyonu incelemek için görüntüleme akışı sitometrisi

Bu yazıda, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus için antibiyotik sağkalımını değerlendirmek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz, plazmitleri P. aeruginosa ve S. aureus'a dönüştürerek raportör suşlar oluşturmak ve persistanlar gibi fenotipik varyantları hızlandırılmış epifloresan mikroskobu ile görselleştirmek için.

Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi

Keşfedin Staphylococcus aureus PSM toksinlerinin insan nötrofilleri üzerindeki etkilerini akım sitometri ve floresan mikroskopi ile. Bu yöntem immün yanıtları ve bakteriyel enfeksiyon mekanizmalarını anlamak için değerlidir.

Etkileşimi incelenmesi

Daha fazla video keşfet